【核糖体失活蛋白在抗肿瘤方面的探究开题报告文献综述7700字】

核糖体失活蛋白在抗肿瘤方面的研究开题报告文献综述目录TOC\o"1-2"\h\u23038核糖体失活蛋白在抗肿瘤方面的研究开题报告文献综述 1232181研究背景 1198871.1肿瘤疾病的高发性 173261.2核糖体失活蛋白抗肿瘤活性 2252262文献综述 2146672.1核糖体失活蛋白的简介 2146922.2穿膜肽的相关介绍 6292383技术路线 825245.1重组质粒构建 8297725.2重组蛋白表达及纯化 8311745.3兔网织红细胞裂解物无细胞翻译实验 9205195.4MTT实验检测药物蛋白的凋亡效果 9146024进度安排 963945参考文献 10摘要：核糖体失活蛋白（RIP）是一类能使核糖体大亚基rRNA断链以致核糖体失活的植物蛋白，主要在蓖麻科、石竹科、葫芦科等植物中存在。在植物中具有抗病毒，虫害，真菌感染等作用。将其延伸到药理层面之后，研究人员正在开发其抗肿瘤活性方面的功能。本课题希望通过对若干种植物来源的核糖体失活蛋白的糖苷酶活性的验证研究，以及相关的MTT实验来证实这些植物源的核糖体失活蛋白是否具有抗肿瘤活性。之后再通过基因工程铰链上本课题组先前开发的一种来源于人超氧化物歧化酶C端的穿膜肽HBD，验证其穿膜效率是否上升，导致药效增强。关键词：RIPs，穿膜肽，抗肿瘤1研究背景1.1肿瘤疾病的高发性近年来，随着人类生活水平的上升，本身的平均寿命也在不断延长。而随着寿命的延长，一些与人类基因突变，破损积累程度成正相关的疾病发病率则显得越发高了。其中，肿瘤，特别是恶性肿瘤其高发性，低治愈率已成为医学界的重大攻克课题。在医学上，癌是指起源于上皮组织的恶性肿瘤，是恶性肿瘤中最常见的一类。相对应的，起源于间叶组织的恶性肿瘤统称为肉瘤。有少数恶性肿瘤不按上述原则命名，如肾母细胞瘤、恶性畸胎瘤等。一般人们所说的“癌症”习惯上泛指所有恶性肿瘤。肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控导致异常增生与分化而形成的新生物。新生物一旦形成，不因病因消除而停止生长，他的生长不受正常机体生理调节，而是破坏正常组织与器官，这一点在恶性肿瘤尤其明显。与良性肿瘤相比，恶性肿瘤生长速度快，呈浸润性生长，易发生出血、坏死、溃疡等，并常有远处转移，造成人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等，最终造成患者死亡。1.2核糖体失活蛋白抗肿瘤活性因为癌症的巨大危害，恶性肿瘤成了众多实验室试图攻克的难题。有别于传统的物化疗法对人体的巨大伤害。一些生物相关的疗法、药剂的研究越来越受到重视，本实验室针对抗癌药物也有相关的研究。而在众多抗肿瘤药物的相关研究中，核糖体失活蛋白也成为重要的一支。核糖体失活蛋白（RIPs）是一类植物中广泛存在的蛋白质，随着近年来对它研究的深入，越来越多的药理和农用上的相关功能被开发出来。本实验室通过对相关文献的整理判断，觉得很大一部分的RIPs都具有细胞杀伤效果，且对肿瘤细胞效力更强。基于这样的事实，设计了一系列有关RIPs抗肿瘤活性的相关实验。以类似于苦瓜中的Napin蛋白这样的，可能是RIPs的蛋白为素材，通过观察其核糖体切割活性来确定其为RIPs，之后进行相关的MTT实验验证其抗肿瘤活性，选用不同的癌细胞株观察其对不同细胞的敏感性的不同。 而在构建得到Napin蛋白的表达重组体之后，本实验室想进一步验证穿膜效率的不同对该类蛋白效力的影响。因为RIPs基本分为I型和II型两类，后者具有凝集素特性的蛋白质片段可与细胞表面的半乳糖残疾特异性结合，进而达到穿膜目的。而前者并不具备穿膜能力，本实验室又有着一个效果良好，在多种产品上均得到很高穿膜效率的穿膜肽HBD，所以在完成相关RIPs抗肿瘤能力的基本鉴定之后，将开始RIPs与HBD的重组复合体的构建工作，之后进行蛋白表达，MTT实验，与之前未连接HBD的RIPs实验效果相对比，验证穿膜效率的上升是否提高了其抗肿瘤活性。文献综述2.1核糖体失活蛋白的简介RIPs广泛存在于植物中,Stillmark,H.等人在19世纪发现蓖麻子的毒性来自于一种叫做蓖麻毒素（ricin）的蛋白，是植物蛋白中第一个被确定有生物学活性的蛋白，最早被鉴定为核糖体失活蛋白．蓖麻毒素的发现是生物化学历史上一座里程碑。自从蓖麻毒素被分离以及特性的确定，许多其他植物中具有相似结构和功能的蛋白也陆续发现[1]，迄今为止，在14个科的50种植物中都有发现，包括葫芦科、大戟科、禾本科和石竹目等[2]。RIPs在植物界分布如此广泛，在某些科中含量特别丰富。大多数的RIPs[3,4]有抗病毒、抗真菌[5,6]、杀虫[7]的功能，但其天然的功能还未完全了解，推测可能是植物响应环境压力的结果。长期以来人们对RIPs的兴趣集中于它在医学和治疗学上的应用，根据对RIPs现有的了解，包括结构、功能和生物学活性，植物来源的RIPs在农业和医药领域中有巨大的应用潜力，如对动物和人类细胞具有独特的生物学活性，即人们发现其中的一些蛋白对肿瘤细胞的毒性比正常细胞大，这为RIPs成为具有靶向性的抗肿瘤药物提供了理论上的依据[8]。通过与抗体连接，人们已经利用这些功能制成了能够靶向特定细胞的免疫毒素。此外，许多实验结果表明，一些RIPs在植物防御中扮演关键角色，因此RIPs可以在农业领域中用于植物的防病虫害等保护等。2.1.1核糖体失活蛋白的基本分类核糖体失活蛋白是一个进40年来被不断分析研究的蛋白家族。关于这类蛋白的运用分析出现得相当迅速，而这些在植物，蕈菌，细菌中发现的核糖体失活蛋白，基本被归纳为以下三种类型。I型：由一条有酶活的单链组成；II型：由一条与I型相似的A链以及与之相连的对半乳糖凝集素B链所组成；III型：有如A链一般的活性链，其中间部分插入了一段蛋白碎片抑制其活性，如此组成[9]。图2.1三种核糖体失活蛋白的结构图核糖体失活蛋白（RIPs大多是I型和II型。I型RIPs最早在1925年发现，当时Duggar和Armstrong观察到Phytolaccaamericanaantiviralprotein(PAP)可以抑制烟草花叶病毒（TMV）的转染，但其抑制蛋白合成的作用直到1978年才被发现[10]。所有I型RIP都是单链蛋白，分子量约为30kd，常见的I型核糖体失活蛋白有TCS、MAP30、白树毒素等；II型RIPs分子量约为56-65kd，包括含有活性中心的A链和对糖分子有特异性的B链，A链与B链通过二硫键连接，其中A链与I型RIP在序列和功能上相似，比对分析发现，蓖麻毒素A链与I型RIP的TCS基因序列相似；B链比A链分子量大，具有凝集素活性，可以使RIP大量聚集于细胞表面，例如蓖麻毒素[11,12,13]。无论叶子、种子或者根，所有的RIPs都有分布[14]。但是I型的RIPs比与其同源的II型RIPs更为常见。以下是几种I型和II型核糖体失活蛋白的来源以及它们的部分生物活性方式。表2.1两类RIPs的性质简介来源RIP分子量（KD）等电点活性I型RIPs皱果苋,野苋菜苋菜红甙,苋红素309.8N-糖苷酶活性，体外转化抑制胶苦瓜Balsamin28N/AN-糖苷酶活性，体外转化抑制叶子花属海棠Bouganin269.6腺嘌呤多核苷酸糖基化酶、蛋白质合成抑制剪秋罗属Lychnin≈30N/A腺嘌呤多核苷酸糖基化酶、蛋白质合成抑制苦瓜MAP30a-Momorcharinb-Momorcharin303029N/A99N-糖苷酶活性，抗艾滋病病毒、抗肿瘤、抑制无细胞翻译堕胎药,抗肿瘤和抗艾滋病活动,免疫抑制木鳖果Cochinin28N/AN-糖苷酶活性，抗肿瘤活性,抑制蛋白质的合成斑玉蕈Marmorin10N/A无细胞翻译抑制，hiv-1逆转录酶抑制、抗增殖活动II型RIPs西潘莲Stenodactylin63N/A多核苷酸糖基化酶的活性，无细胞翻译抑制，使红血球凝聚西葫芦FoetidissiminII61N/AN-糖苷酶活性，抗癌活性、无细胞蛋白合成抑制接骨木EbulinI56N/AN-糖苷酶活性，蛋白合成抑制白槲寄生Mistletoe65N/A抗肿瘤活性,免疫调节活动，N-糖苷酶活性扁枝槲寄生ArticulatinD665.4N-糖苷酶活性，红血球凝聚活动，无细胞蛋白合成抑制香樟Cinnamomin61N/A抗肿瘤活性，N-糖苷酶活性2.1.2核糖体失活蛋白的性质及部分作用机理大量的I型RIPs已在植物中被发现，特别是类似与有病虫害伤口这样的生存条件不佳的蔬菜，其RIPs含量尤其高。当然也并非所有植物都可表达RIPs，拟南芥的基因组中并未发现此类蛋白基因。许多植物中，RIPs在它们的部分组织中被发现（例如石碱草的皂巴素）或者某一个组织中（例如蓖麻中的蓖麻毒素）。I型RIPs的酶活表现为N-乙酰糖苷酶，它能使一个腺嘌呤从rRNA的一段特异性序列上脱离出来，如小鼠的核糖体60S亚基中的28S亚基的一个高度保守的茎环结构上（A4324位点）脱腺嘌呤，从而引起之后的RNA断裂，最终导致了蛋白合成的失活。RIPs也能从DNA或多聚核苷酸中切割单个的腺嘌呤，但是效率不同。例如蓖麻毒素可以识别该结构并且特异性的切割嘌呤与核苷酸间的糖苷键。脱嘌呤作用发生的位点序列高度保守，为GAGA，该结构对延伸因子和核糖体的相互作用至关重要[15-18]。嘌呤被移除后，脱嘌呤位点变得不稳定。酸性苯胺的处理后，会发生β-消除反应，因此RNA的3’端被切除，并可用电泳检测。该位点所在茎环结构成为八叠球菌-蓖麻毒素环的（sarcin-ricinloop；SRL）。该结构位于VII区，距3’端约400bp的位置[19,20]。该位点特异性的催化功能是目前鉴定RIPs的重要特征。图1.2脱嘌呤原理示意图相对于I型核糖体失活蛋白，II型RIPs的A链功能与其相同，B链结合细胞表面的半乳糖残基，使A链进入细胞质，它们摧毁核糖体导致细胞死亡。因此部分II型RIPs是强力的毒素，蓖麻毒素就是最为有名的，其它的则没有毒性，可能是由于它们进入细胞方式的不同，在细胞内通路的不同，以及抗蛋白水解作用的不同。有毒性的II型RIPs已被用于作为你杀伤性武器，现代社会害怕蓖麻毒素及其相关毒素作为生化武器被用于战争及恐怖主义。由于缺乏B链，I型RIPs难以与细胞结合，并进入细胞，故毒性很弱，但是，如果将其与具有细胞结合特异性的分子结合，它们也能具有毒性。大部分的RIPs具有抗病毒，抗真菌，抗虫害，以及堕胎药的功能，而且应该在极端条件下的植物体内具重要作用。科学界为探索RIPs的这些农业上药理上的功能已经做了很多尝试了。因此，一些研究者将RIPs连接或者融合到能将它们投递到目标细胞的载体分子上以期达到消除感染区域的目的。这些轭合物是研究的工具，常常用于神经生物学研究，当然也会用于治疗。2.2穿膜肽的相关介绍 细胞穿膜肽(cellpenetratingpeptides,CPPs)又称为蛋白转导域或膜转导肽，是一种由30个或者更少氨基酸组成的能够穿透细胞膜的多肽，能够运载包括药物在内的许多物质。CPPs主要分为阳离子型和两性分子型。部分研究者认为穿膜肽能够直接转导细胞，但绝大多数研究者更倾向于穿膜肽通过一种能量依赖型细胞内吞作用以囊泡形式进入细胞内。穿膜肽作为有效转导细胞的工具，运载不同的药物分子进入不同的细胞中，在穿膜的过程中并不会影响细胞的活力。2.2.1细胞穿膜肽的性质、分类及结构特征 到目前为止,已发现了多种CPPs,它们共有的性质[21]:1)具有净正电荷性或两亲性特征;2)穿膜转运效率高;3)可以导入近乎所有的细胞;4)可以携带多种活性物质进入细胞;5)可以通过固相合成或原核表达制备,方法成熟简便。CPPs的分类以及统一的术语还没有。根据不同的分类标准,得到不同的种类。最近有学者根据短肽的特点和来源将其分为3大类:1)蛋白衍生肽(proteinderivedCPPs),如penetratin、TAT和pVEC等;2)模型肽(modelpeptides)如MAP和(Arg)7等;3)设计肽(designedCPPs)如MPG和Transportan等[22]。从其两亲性性质也可将其分为3)类:1)两亲性CPPs(PaCPPs),如MPG、transportan、TP10、Pep-1;2)中等两亲性CPPs(SaCPPs),如penetratin,RL16;3)非两亲性CPPs(NaCPPs),如R9。穿膜肽的二级结构主要受以下两个因素影响:静电和多肽表面负荷(peptidesurfaceoccupancy)。第一个因素包括表面电位的变化影响,如表面电荷密度与电荷强度。第二个因素是受饱和结合状态时的脂质体与穿膜肽比例(L/Pratio)关系密切。当在低L/P值时,在结合到带电颗粒的同时,该多肽将由随机折叠转变为β折叠。当继续增加P值时,β折叠则转向螺旋。穿膜肽的这种二级结构转变在穿膜过程中作为暂时性的过渡模型,或许是存在的。2.2.2细胞穿膜肽的跨膜过程及其机制有关CPPs的内化机制一直以来存在争议。不论通过何种机制穿膜,理论上CPPs首先接近细胞膜的脂质层,与其发生作用后进入细胞。目前认为CPPs与细胞膜的结合模式有两种[23],多位点结合模式和静电吸引模式。多位点结合模式,带正电荷的CPPs可能与细胞膜上带负电荷的葡糖胺聚糖结合,也有可能与细胞膜上带负电荷的脂质结合。CPPs中存在的带正电荷的碱性氨基酸与细胞膜上带负电荷的物质结合是CPPs穿膜的必要条件。静电吸引模式,即通过疏水性吸附作用,靠近膜表面的肽段发生非特异性的静电积聚。Ziegler等[11]根据CPPs的两亲性程度分别阐述了其与膜的结合机制以及其在膜上的定位。PaCPPs与膜结合时主要靠疏水作用插入膜内,结构发生改变（α螺旋或β折叠结构的形成）,且不耗能。SaCPPs在与膜结合时结构发生改变,通过静电作用轻微插入脂质双分子层。相反,NaCPPs与膜结合时仅仅轻微吸附于膜上,不会插入到脂质分子层中。PaCPPs与SaCPPs在穿膜时都会使脂质层发生紊乱,形成跨膜静电域,一些CPPs自组装会进一步扰乱脂质双分子层的完整性。而在低摩尔浓度、低阴离子脂质组分膜条件下,SaCPPs、NaCPPs与膜之间不会发生相互作用。关于CPPs的内化机制(穿膜机制/易位机制/转导机制)一般可分为两种[24,25]:转导(易位)模式,包括直接穿膜和跨膜转导模式,跨膜转导模式(translocationmodels)又包括反转微团(inversemicells)、地毯(carpet)及打孔(barrelstave)模型;内吞模式(endocytosis),包括网格蛋白(clathrin,120nm)、脂质筏/小窝蛋白(caveolin,50~80nm)和巨胞饮(macropinocytosis,1~5μm)介导的模式。转导模式与内吞模式的主要不同在于转导的CPPs在穿膜后直接定位于细胞质,而内吞的CPPs被限制在囊泡中。一般来说,当CPPs运载小的亲水性药物时,多肽诱导膜紊乱使肽直接易位进入胞内;而当运载大的亲水性药物时膜紊乱程度较低,内吞作用似乎是比较合适的易位机制。巨胞饮介导的内吞作用[26]是最近提出的一种CPPs运载大分子药物(MW>30000Da)的入胞机制,它是一种非网格蛋白、非脂质筏介导的依赖肌动蛋白的一种非特异性内吞过程。最近的研究重点是巨胞饮作用并认为其是细胞内化的主要途径,它能在不同程度上发生于所有的细胞内,而且可以从膜的边缘扰动和形成囊泡的大小两个方面区分巨胞饮与其他形式的内吞作用。影响CPPs内化机制的因素主要有:温度、肽浓度、细胞周期、药物分子大小及其理化性质、非固定化细胞中不同的亚细胞分布类型、CPPs的理化性质(氨基酸构成、分子大小、分子构象)、所用的细胞系、胞内体中肽的降解、早期肽从胞内体中的逃离速度及所结合配体的荧光强度等。2.2.3细胞穿膜肽的跨膜过程及其机制将多肽类药物、DNA等导入细胞内目前普遍采用的手段有:物理方法，如电穿孔、显微注射等;生物及化学方法，如洋地黄皂苷处理法、成孔蛋白质法等;其他方法,如将蛋白质脂化增加疏水性、运用免疫毒素等蛋白质载体、颗粒(如脂质体)包裹法和细胞融合技术等。但由于上述方法存在分子导入率低、易造成细胞损伤甚至死亡,以及细胞内部无相应靶向性等诸多不足,使得许多无生物膜通透性且易降解的亲水性多肽、蛋白质及寡核苷酸在药学领域的应用大大受限。大量研究表明,穿膜肽具有强大的运载潜能,与其他生物大分子转运方式相比,穿膜肽的转导作用具有许多独特之处。CPPs携带的物质可以为蛋白质(绿色荧光蛋白、RNA酶、半乳糖苷酶等)、多肽(100个氨基酸残基以下)、DNA、化学小分子药物、寡核苷酸(100bp以下)、反义核酸、肽核酸、纳米颗粒、荧光素、有机分子、腺病毒载体、成像物质、脂质体及铁颗粒等。运载能力可以达到120kDa(如半乳糖苷酶)、40nm(如铁颗粒),没有明显的证据表明运载极限。细胞穿膜肽可以通过化学结合或基因融合等方式携带各种生物大分子。CPPs与药物的连接方式有两种:非共价连接和共价连接。通过使用CPPs还可以增加肽类药物的活性,以及进行细胞器官的特异性运输[27]。一些证据显示,CPPs可以与任意的分子结合,非靶向性进入细胞内,导致生物活性药物不必要的损失。因此,如果不能建立可行性使用方法以促进细胞特异性运输,将限制细胞穿膜肽在机体内运输药物等方面的应用。目前,在能够有效利用CPPs运输药物以充分发挥治疗作用方面有价值的应用实验结果还鲜见报道。这种载药方式在应用中是否存在潜在的细胞毒性以及运输过程中缺乏细胞特异性等问题尚未引起足够的的重视[28]。一些CPPs存在细胞内化差,出现细胞内代谢性降解及一些不良的生物效应如毒性和免疫原性等。需要进一步开展对CPPs的药代动力学、体内分布等相关研究。3技术路线5.1重组质粒构建实验前期准备构建Napin-pET32a、Napin-HBD-pET32a，MCL-pET32a、MCL-HBD-pET32a。通过PCR、酶切、连接等分子克隆技术完成重组表达载体。5.2重组蛋白表达及纯化将以上重组表达载体转化到大肠杆菌BL21中，选择合适的温度、诱导时间及诱导剂浓度对以上表达进行优化表达，获得目的重组蛋白。收集菌体，超声破壁，据情况选择上清或包涵体进行镍柱纯化。包涵体需要对其变性溶解，在经镍柱纯化，最后收集到的蛋白通过透析进行缓慢复性，得到较纯的活性蛋白，最后通过SDS验证纯化效果。图5-1蛋白质纯化流程图5.3兔网织红细胞裂解物无细胞翻译实验通过兔网织红细胞裂解物无细胞翻译实验，来验证所选的Napin蛋白是否具有核糖体失活活性。通过细胞裂解物构建的无细胞翻译体系简单且变数少，能更直接地说明Napin的核糖体失活活性。5.4MTT实验检测药物蛋白的凋亡效果MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲臜（Formazan），甲臜的多少可以用酶标仪在570nm处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目，并由此推测出细胞死亡数。本文中我们将各重组蛋白孵育不同的细胞株(包括人正常细胞和癌细胞)，一定时间后，加入MTT反应4h并测定OD值，根据OD值的变化比较各细胞株的死亡情况，由此比较蛋白杀伤效果的差异。4进度安排2014.9~2014.10查阅文献资料，学习实验技能，了解研究背景和发展前景。2014.10~2014.11确定课题研究方向，找到所需的RIP基因。20114.11~2014.12完成苦瓜RIP基因Napin在大肠杆菌中的转化表达，与构建加入HBD的重组菌株。2014.12~2015.1融合蛋白优化表达及使用镍柱进行分离纯化，熟练掌握并探索优化的蛋白纯化条件，找到稳定方法。2015.3~2015.4验证表达蛋白的核糖体失活活性，进行无细胞翻译实验，探究RIPs的抗肿瘤活性2015.5实验数据的分析处理及补充，撰写毕业论文。5参考文献[1]BarbieriL,BattelliMG,StirpeF.Ribosome-inactivatingproteinsfromplants[J].BiochimicaetBiophysicaAda.1993,1154:237-282.[2]StirpeF.Ribosome-inactivatingproteins[J].Toxicon.2004,44:371–383[3]InderdeepKaur,R.C.Gupta,MunishPuri.Ribosomeinactivatingproteinsfromplantsinhibitingviruses[J].VirologicaSinica.2011,26(6):357–365[4]Stirpe,F,BattelliM.G.Ribosome-inactivatingprotein:progressandproblems[J].Cell.Mol.LifeSci.2006,63:1850–1866[5]NgTB.Antifungalproteinsandpeptidesofleguminousandnon-leguminousorigins[J].Peptides.2004,25(7):1215–1222[6]FlorentineMarx,WillibaldSalvenmoser,UlfStahl.ResearchinMicrobiology[J].TorstenTheis.2005,156(1):47-56[7]CarliniCR,GrossideSaMF.

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