基因工程分子的杂交

基因工程分子的杂交基因工程分子的杂交第1页1968年由华盛顿卡内基学院（CavnegieInstituteofWashington）RoyBritten及其同事创造。原理：带有互补特定核苷酸序列单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其对应同源区段将会退火形成双链结构。

1核酸分子杂交技术基因工程分子的杂交第2页彼此退火核酸来自不一样生物有机体，而形成双链分子。DNA/DNA杂交作用：检测特定生物有机体之间亲源关系DNA/DNA或RNA/DNA能力，揭示核酸片断中某种特定基因位置。1.1杂种核酸分子基因工程分子的杂交第3页按其分子种类划分

1）DNA杂交—探针为DNA或RNA

2）RNA杂交—探针为DNA或cDNA1.2核酸杂交类型基因工程分子的杂交第4页3）蛋白质免疫分析—探针为抗体基因工程分子的杂交第5页按样品制备过程划分

1）原位杂交(insituhybridization)

i.原位菌落杂交

ii.原位噬菌斑杂交

iii.原位细胞杂交

iv.原位组织块杂交1.2核酸杂交类型基因工程分子的杂交第6页起源于标准光学显微镜技术，这种技术曾被用来观察细胞分裂期染色体形态。对于许多生物体来说，能够经过染色体形状或者不一样方法染色来区分。原位杂交提供了一个经过在光学显微镜下观察染色体图像，直接定位克隆基因方法。

原位杂交基因工程分子的杂交第7页原位杂交优点不但能够判定出基因存在于哪条染色体上，还能够提供染色体上基因位置相关信息。

基因工程分子的杂交第8页特点：原位裂解细胞，不需要分离DNA，RNA或蛋白质样品，可同时处理大量样品，常见于目标基因筛选或检测某类细胞或组织中是否存在某一特定DNA、RNA或蛋白质序列。基因工程分子的杂交第9页比如：菌落杂交原位杂交之一，是指把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，使溶菌DNA同滤膜原位结合，带有DNA滤膜烘干后，与放射性同位素标识特异DNA或RNA探针杂交。目标：判定重组子。基因工程分子的杂交第10页检测重组体克隆菌落杂交技术基因工程分子的杂交第11页经固定剂处理细胞被黏附在载玻片上，然后用核糖核酸酶和氢氧化钠降解RNA，并使DNA分子变性，单个多聚核苷酸链之间配对碱基被拆散，而且染色体也在一定程度上被拆开，暴露出通常被包裹在它们结构之中DNA片段。将一定量被标识基因掺入到制备好染色体中。标识基因和它染色体拷贝杂交，最终在放射性自显影中形成一个黑点。这个黑点位置表示标识基因在染色体上位置。尽管技术较难，但大家已经利用原位杂交和放射性标识探针，定位人类细胞遗传图谱上相当数量基因。原位细胞杂交基因工程分子的杂交第12页基因工程分子的杂交第13页大家用荧光标识物替换放射性标识，将它连接到杂交探针上，探针与DNA分子杂交后，能够经过荧光显微镜直接观察试验结果。假如使用不一样荧光染料，能够同时探测两个或更多基因，经过荧光颜色间显著差异能够分辨出不一样杂交信号。FISH经常与已知正常染色体位置探针一起使用，这项技术对于研究染色体已经重新排列细胞尤其有用。染色体重新排列，比如染色体复制，或者是某一DNA片段从一条染色体转移到另一条染色体上，都能够经过FISH相对较快地测定出来，比传统染色技术快很多。荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization，FISH)基因工程分子的杂交第14页2）斑点杂交(dothybridization)

先分离DNA，RNA或蛋白质，然后将样品液直接点在固体基质上进行杂交，不能测定分子量大小。基因工程分子的杂交第15页先纯化样品，然后使不一样大小分子在凝胶上分离，转移到固体基质上，与探针杂交。该法可检测出感兴趣分子分子量。用于转移方法有：

i.扩散法

ii.毛细管法

iii.电泳转移法

iv.真空转移法

3）转移杂交或印迹杂交(blottinghybridization)基因工程分子的杂交第16页它利用两种探针与待测DNA结合，先将不带标识探针固定在基质上，然后用待测样品与之杂交，洗去非特异性结合后，再与第二种带标识探针杂交。这种方法可用于粗制DNA样品，可检测出0.2ngDNA样品4)夹心杂交法(sandwichhybridization)基因工程分子的杂交第17页

1)DNA和RNA杂交制备DNA或RNA样品→与固定基质结合→80℃真空固定→预杂交→加入标识探针杂交→洗涤→放射自显影或显色反应。

2）蛋白质免疫分析制备蛋白质样品→与固定基质结合→常温空气中固定→封闭剂封闭→一抗反应→洗涤→二抗-酶偶联物反应→洗涤→显色反应（EIA）或→一抗放射标识物→洗涤→放射自显影（RIA）2分子杂交普通程序基因工程分子的杂交第18页2.1杂交样品膜制备1.固定基质种类与特征

1）硝酸纤维素滤膜(Nitrocellulosefilter,NCF)可与三类大分子结合，其机理不清楚，可能为被动吸附。NCF不能结合小分子DNA，RNA和蛋白质（<20,000）基因工程分子的杂交第19页优点：i.用于DNA，RNA杂交分析时结果可靠，灵敏，本底低。ii.用于蛋白质分析时，容量大（80μg/cm2)；可直接染色；分辨率高；不需要预激活；易于操作缺点：

结合低分子蛋白质不稳定，重复使用探针次数有限（2-3次）硝酸纤维素滤膜NCF基因工程分子的杂交第20页硝酸纤维素膜

不能滞留小于150bpDNA片断，不能同RNA结合。

应用1mol/L醋酸铵和0.2mol/LNaOH缓冲液代替SSC缓冲液可改进对小片断DNA滞留能力。

RNA变性后也能十分轻易结合到膜上。基因工程分子的杂交第21页2）重氮化纸：DBM纸与DPT纤维素纸最大特点：能结合小分子DNA，RNA和蛋白质，共价结合，可用不一样探针进行屡次杂交分析。该类基质结合生物大分子能力差，需要激活，分析蛋白质时最好用放射性标识物。这类基质对生物大分子是主动吸附。基因工程分子的杂交第22页i.阳离子尼龙膜（如Zeta-prob，Zeta-bind等）

i)容量大,蛋白质可结合480μg/cm2ii)可结合不一样大小DNA(6n.t.)，RNA和蛋白质。

iii)韧性好

iv)可用于电转移

v)可进行重复屡次杂交试验

vi)广泛化学耐受性和可高温消毒*不能用于蛋白质直接染色

ii.尼龙66

广泛用于核酸印迹分析，静电荷可从pH4时阳离子状态转变为pH7时阴离子状态。

3)尼龙膜基因工程分子的杂交第23页4）离子膜i.DEAE-纤维素纸(可用于ss-DNA,ds-DNA,RNA制备回收)ii.CM-纤维素纸(可用于碱性蛋白质结合)基因工程分子的杂交第24页固定基质选择依据1）强度，耐久性，操作简便2）高信噪比（低本底高信号）3）生物大分子结合容量和稳定性4）重现性好基因工程分子的杂交第25页核酸杂交常见几个膜性能比较基因工程分子的杂交第26页

尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交步骤：

1.核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体支持膜上。利用是毛细管作用

2.印迹杂交：将含有核酸印迹滤膜同带有标识DNA/RNA进行杂交。基因工程分子的杂交第27页1）原位杂交样品膜制备2.2各种杂交样品膜制备基因工程分子的杂交第28页

2）斑点杂交样品膜制备制备样品→点样→固定（可用斑点杂交仪或直接点样）基因工程分子的杂交第29页3）转移杂交样品膜制备

i.扩散法（Difusionblottingmethod)基因工程分子的杂交第30页ii.毛细管法(Capillaryblottingmethod)

Southern印迹基因工程分子的杂交第31页iii.电转移法(electroblotting)基因工程分子的杂交第32页iv.真空转移法(Vaccumbllotting)

转移速度与凝胶速度和厚度成反比，在相同转移率（50%）时，真空法比毛细管法快13倍，其损失仅6%，而毛细管法损失率20%。

v.各种转移方法比较

i)扩散法和毛细管法：操作简便，不需要特殊转移仪器，但转移效率低,（扩散法为70%，毛细管法80%）耗时多。

ii)电转移法：效率高，耗时少，需特殊转移仪，对转移条件要求较严。

iii)真空转移法：效率高，耗时最少，需特殊真空转移仪。基因工程分子的杂交第33页i)固定基质选择

ii)转移前预处理：DNA和RNA分子变性，蛋白质则需除去凝胶中SDS。

iii)大分子转移对于分子量较大DNA片段，必须进行原位断裂后再进行转移，断裂DNA分子最正确长度为1-2kb。vi.转移最正确条件

其步骤是：0.25MHCl处理凝胶两次（每次15分钟）→水洗→0.5MNaOH/1MNaCl两次，每次15分钟→转移。对于大分子蛋白质，可采取下述三种方法之一：解偶联剂使凝胶解聚；蛋白酶作用；转移缓冲液中加入SDS。基因工程分子的杂交第34页1.标识化合物种类

1）放射性同位素标识物125I，3H，14C用于蛋白质标识；32P，3H，35S 用于核酸标识，其中32P和35S使用频率高。32P标识核苷酸α位或γ位，35S则是标识核苷酸α位.2.3标识探针制备基因工程分子的杂交第35页2)非放射性标识物

i.生物素分离自蛋黄水溶性维生素，它能够和分离自蛋清中一个碱性蛋白—抗生物素蛋白牢靠地结合。每个抗生物素蛋白可结合4个生物素分子。另外，链霉菌抗生蛋白与生物素结合更牢靠，可大大提升其灵敏度。生物素能够经过化学法与不一样化合物结合形成标识化合物。

基因工程分子的杂交第36页ii.半抗原包含汞，2-乙酰胺二苯丙茂，地高辛配体和金属铕。地高辛配体是一个脂质半抗原，可将其连在dUTP上，然后用酶将其掺入新合成链中。检测上述标识物方法是利用二抗-酶偶联物反应和显色反应。基因工程分子的杂交第37页iii.蛋白质检测标识物

i)酶偶联二抗（0.05ng）

ii)蛋白质A（来自金黄色葡萄球菌）。可作用于大多数哺乳动物IgG，灵敏度较低（5ng）

iii)免疫金（immunogold）0.1-0.5ng基因工程分子的杂交第38页3)两类标识化合物比较i.灵敏度检测蛋白质，两种方法差不多。检测核酸，放射法比酶法敏感。ii.稳定性酶法探针可在4℃保留一年，放射性标识需每次制备。iii.安全性非放射性标识安全。iv.效率非放射性标识所需时间短。基因工程分子的杂交第39页2.标识探针制备

1）链标识法

i.切口移位法

ds-DNA+DNaseI+DNApolI+dNTP(32P-dCTP)ii.随机DNA引物延伸法

ds-DNA→ss-DNA-(6n,t)→Klenow片段+dNTP(32P)基因工程分子的杂交第40页iii.反转录法

mRNA+dNTP(32P)→cDNA（标识）iv.转录法

含有待标识DNA片段重组质粒+NTP(32P)→→RNA（标识）v.引物延伸法含待标识DNA单链DNA分子(M13mp系列)+引物(15-17n.t)+dNTP(32P)→待标识DNA链vi.T4DNA聚合酶法

ds-DNA→T4DNA聚合酶,无dNTP→3’-5’外切酶活性→加入dNTP和标识核苷酸→新合成链（32P）基因工程分子的杂交第41页2)末端标识

i.5’-末端标识

ss-和ds-DNA,RNA→脱磷酸化反应(CIP)→T4DNA激酶(γ-32P)ATPii.3’-末端标识

i)TdT加尾反应，用于dsDNAii)补齐反应

iii)T4RNA连接酶反应RNA-OH+*pNp（3’-5’-二磷酸核苷）+ATP—RNA-*pNPp+pA+ppi

基因工程分子的杂交第42页

3)标识化合物纯化

i.柱层析利用SephadexG-50，前峰-标识物，后峰-核苷酸

ii.旋转柱层析

快速，简便,可同时纯化多个样品。

基因工程分子的杂交第43页2.4分子杂交与结果检测1.核酸杂交与结果检测1）预杂交：预杂交液中常加入鲑鱼精DNA，若标识探针是cDNA或RNA，预杂交液中还需加入多聚A以阻止特异性结合,42℃4-6h或过夜。2）杂交：探针100℃变性，快速冷却，加入预杂交液中，42℃一天基因工程分子的杂交第44页3）洗涤：2×SSC+0.1%SDS常温洗涤两次，1×SSC+0.1%SDS65℃洗涤两次，每次15分钟。若使用低聚核苷酸探针，洗涤温度按下式计算：T=4GC+2AT*高强度与低强度杂交：若具高度特异性同源序列，采取高强度杂交条件；若使低同源性DNA之间杂交，则采取低强度杂交条件。这两种条件之差异表现在杂交液和洗涤液离子强度以及杂交和洗涤时温度。基因工程分子的杂交第45页4）放射自显影或显色反应使用放射性同位素标识物，采取放射自显影。若采取非放射性同位素标识物，则采取显色反应。显色反应将依据偶联酶类而定。主要有两种酶：

i.辣根过氧化物酶:

可将3，3’-二氨基苯胺氧化成褐色沉淀或将4-氯萘酚氧化成紫色沉淀物。基因工程分子的杂交第46页ii.碱性磷酸酶作用底物是5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，在酶作用下，该化合物可转变为兰色沉淀物，该反应中释放氢离子可将硝基兰四唑还原成深紫色沉淀，这些沉淀物都是沉积在酶作用位点。

iii.两种酶偶联物比较

i)碱性磷酸酶灵敏度比辣根过氧化物酶高10倍左右，但噪声大。

ii)碱性磷酸酶显色反应可连续几个小时，其显色结果可长久保留，但辣根过氧化物酶显色反应仅能连续30分钟。

5)杂交结果基因工程分子的杂交第47页2.蛋白质免疫分析

封闭剂，明胶，牛血清蛋白，卵清蛋白等。

基因工程分子的杂交第48页3SouthernDNA印迹杂交由E.Southern于1975年首先设计出来，依据毛细管作用原理，使在电泳凝胶中分离DNA片段转移并结合在适当滤膜上，然后经过同标识单链DNA或RNA探针杂交作用，检测这些被转移DNA片段，这种试验方法叫做DNA印迹杂交技术。基因工程分子的杂交第49页（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交基因DNA片段X光底片Southern凝胶转移杂交技术基因工程分子的杂交第50页SouthernDNA印迹杂交之X光显像图片

水稻（OryzasativaL.)叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有EtBr染料1%琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标识玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现阳性条带，表明含有水稻psbA基因序列。基因工程分子的杂交第51页

在进行核酸印迹转移时，

1.要将已转好硝酸纤维素膜在80度下烘烤1～2小时；

2.紫外线交联法，将DNA分子上个别胸腺嘧啶残基同尼龙膜表面带正电荷氨基基团之间进行交联。

基因工程分子的杂交第52页4NorthernRNA印迹技术（Northernblotting）

1979年，J.C.Alwine等人发展而来，将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其它化学修饰活性滤纸上，进行核酸杂交一个试验方法。因为这种方法与SouthernDNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做NorthernRNA印迹技术（Northernblotting）。而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标识特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术叫做Western蛋白质杂交技术（Westernblotting）。基因工程分子的杂交第53页5凝胶阻滞试验（Gelretardationassay）

又叫DNA迁移率变动试验（DNAmobilityshiftassay）80年代早期出现用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用一个特殊凝胶电泳技术。它含有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质一个经典试验方法。原理：

DNA与蛋白结合造成了电泳时迁移率降低。基因工程分子的杂交第54页凝胶阻滞试验基础原理图放射性标识DNA因为同一个细胞蛋白质B结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中展现滞后条带ACB放射自显影****凝胶电泳放射性标识DNA细胞蛋白质提取物蛋白质与DNA结合******BDNA-蛋白质结合物电泳迁移迟缓滞后带表明DNA与蛋白质结合基因工程分子的杂交第55页不但能够用来判定在特殊类型细胞提取物中，是否存在与某一特定DNA片断结合蛋白质分子而且能够研究发生此中结合之准确DNA序列特异性。（加入超量非标识竞争DNA）基因工程分子的杂交第56页(a)(b)(c)

在凝胶阻滞试验中竞争DNA与探针DNA之间竞争作用（a）没有加入竞争DNA正常凝胶阻滞试验，探针DNA与特异蛋白质结合，出现阻滞条带；（b）加入超量竞争DNA与探针DNA竞争结协议一个蛋白质，阻滞条带消失；（c）竞争DNA与探针DNA分别结合不一样蛋白质，出现同（a）一样阻滞条带。**********蛋白质与未标识竞争DNA结合凝胶电泳放射自显影蛋白质与标识探针DNA结合**********基因工程分子的杂交第57页

能够间接说明体内发生DNA与蛋白质之间相互作用。

1.用含有已知转录因子结合位点竞争DNA，可检测蛋白是否属于这类转录因子；

2.在竞争DNA已知转录因子结合位点上，引入突变可评定突变对竞争DNA性能及其转录因子结合影响。基因工程分子的杂交第58页

凝胶阻滞试验能揭示在体内发生DNA与蛋白质之间相互作用相关信息，但无法确定二者结合准确部位，而DNaseⅠ足迹试验能够处理这个问题。基因工程分子的杂交第59页6DNaseⅠ足迹试验（footprintingassay）

是一类用于检测与特定蛋白质结合DNA序列部位及特征专门试验技术。一个显著优点是，能够形象地展示出一个特殊蛋白质因子同特定DNA片段之间结合区域。基因工程分子的杂交第60页32p1510*14810*加入蛋白质X加入DNaseI凝胶电泳放射自显影1510AB足迹(a)(c)