基因工程技术

关于基因工程技术

一概述

基因工程技术使很多自然界很难或不能获得的蛋白得以大规模合成.80年代以来,表达真核cDNA,细菌毒素和病毒抗原基因等,为人类获取大量医用价值的多肽蛋白开辟了新途径.

基因工程技术生产药品的优点:生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽,胰岛素,干扰素等,细胞因子等;

可以提供足够数量的生理活性物质;发现更多内源生理活性物质;定向改变内源生理活性物质;获得新化合物,扩大药物来源.第2页,共172页，2024年2月25日，星期天

重组DNA技术也称为分子克隆技术。供体、受体、载体是其三大基本元件。

基因工程:利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内进行无性繁殖，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新的生物类型。是指重组DNA技术的产业化设计与应用.

包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；

下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。第3页,共172页，2024年2月25日，星期天

从实质上讲，基因工程的定义强调了外源DNA分子的新组合被引入到一种新的寄主生物中进行繁殖。这种DNA分子的新组合是按工程学的方法进行设计和操作的，这就赋予基因工程跨越天然物种屏障的能力，克服了固有的生物种间限制，扩大和带来了定向创造生物的可能性，这是基因工程的最大特点。

基因工程要素：包括外源DNA，载体分子，工具酶和受体细胞等。第4页,共172页，2024年2月25日，星期天

一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有：（1）外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。此工作是整个基因工程的基础，又称为基因工程的上游部分；（2）适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组；（3）外源基因的导入；（4）外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选；（5）外源基因表达产物的生理功能的核实；（6）转基因新品系的选育和建立，以及转基因新品系的效益分析；（7）生态与进化安全保障机制的建立；（8）消费安全评价。第5页,共172页，2024年2月25日，星期天二基因工程诞生的理论依据（1）DNA是遗传物质不同基因具有相同的物质基础。地球上的一切生物，它们的基因都是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段。而所有生物的DNA的基本结构都是一样的。因此，不同生物的基因（DNA片段）原则上是可以重组互换的。（2）DNA双螺旋结构

1953年JamesD.Watson和FrancisH.C.Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。（3）中心法则和遗传密码遗传密码是通用的。一系列三联密码子（除极少数的几个以外）同氨基酸之间的对应关系，在所有生物中都是相同的。现在，基因是可以人工会成的。第6页,共172页，2024年2月25日，星期天（4）基因是可切割的基因直线排列在DNA分子上。作为DNA分子上一个特定核苷酸序列的基因，允许一个一个完整地被切割下来。（5）基因是可以转移的发现有的基因可以在染色体DNA上移动，甚至可以在不同染色体间进行跳跃，插入到靶DNA分子之中。（6）多肽与基因之间存在对应关系普遍认为，一种多肽就有一种相对应的基因。因此，基因的转移或重组可以根据其表达产物多肽的性质来检查。（7）基因可以通过复制把遗传信息传递经重组的基因一般来说是能传代的，可以获得相对稳定的转基因生物。第7页,共172页，2024年2月25日，星期天基因工程的研究内容

1、基础研究基因工程问世以来，科技工作者始终十分重视基础研究，包括构建一系列克隆载体和相应的表达系统，建立不同物种的基因组文库和cDNA文库，开发新的工具酶，探索新的操作方法等，各方面取得了丰硕的研究成果，使基因工程技术不断趋向成熟。第8页,共172页，2024年2月25日，星期天

(1)、基因工程克隆载体的研究基因工程的发展是与克隆载体构建密切相关的，由于最早构建和发展了用于原核生物的克隆载体，所以以原核生物为对象的基因工程研究首先得以迅速发展。

Ti质粒的发现以及成功地构建了Ti质粒衍生的克隆载体后，植物基因工程研究随之就迅速发展起来。动物病毒克隆载体的构建成功，使动物基因工程研究也有一定的进展。可以认为构建克隆载体是基因工程技术路线中的核心环节。至今已构建了数以千计的克隆载体。但是构建新的克隆载体仍是今后研究的重要内容之一。尤其是适合用于高等动植物转基因的表达载体和定位整合载体还须大力发展。第9页,共172页，2024年2月25日，星期天(2)基因工程受体系统的研究基因工程的受体与载体是一个系统的两个方面。前者是克隆载体的宿主，是外源目的基因表达的场所。受体可以是单个细胞，也可以是组织、器官、甚至是个体。用作基因工程的受体可分为两类，即原核生物和真核生物。

原核生物大肠杆菌是早期被采用的最好受体系统，应用技术成熟，几乎是现有一切克隆载体的宿主；

酵母菌是较早被用作基因工程受体的真核生物。有人把酵母菌同大肠杆菌一起看作是第一代基因工程受体系统。

高等植物也已用作基因工程的受体，一般用其愈伤组织、细胞和原生质体，也用部分组织和器官。第10页,共172页，2024年2月25日，星期天

高等植物也已用作基因工程的受体，一般用其愈伤组织、细胞和原生质体，也用部分组织和器官。目前用作基因工程受体的植物有双子叶植物拟南芥、烟草、番茄、棉花等，单子叶植物水稻、玉米、小麦等，获得了相应的转基因植物。动物鉴于体细胞再分化能力差，目前主要以生殖细胞或胚细胞作为基因工程受体，获得了转基因鼠、鱼、鸡等动物。

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(3)目的基因研究

基因是一种有限的战略性资源。因此开发基因资源已成为发达国家之间激烈竞争的焦点之一，谁拥有基因专利多，谁就在基因工程领域占主导地位。基因工程就是开发人们特殊需要的基因产物，这样的基因统称为目的基因。具有优良性状的基因理所当然是目的基因。而致病基因在特定情况下也具有很大的开发价值。即使那些尚不清楚功能的基因，随着研究的深入，也许以后成为具有很大开发价值的目的基因。

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获得目的基因的途径很多，主要是通过构建基因组文库或cDNA文库，从中筛选出特殊需要的基因。近年来也广泛使用PCR技术直接从某生物基因组中扩增出需要的基因。对于较小的目的基因也可用人工化学合成。现在已获得的目的基因大致可分为三大类：第一类是与医药相关的基因；第二类是抗病、虫害和恶劣生境的基因；第三类是编码具特殊营养价值的蛋白或多肽的基因。第13页,共172页，2024年2月25日，星期天

(4)基因工程工具酶的研究基因工程工具酶指体外进行DNA合成、切割、修饰和连接等系列过程中所需要的酶，包括DNA聚合酶、限制性核酸内切酶、修饰酶和连接酶等。限制性核酸内切酶用于有规律地切割DNA把提供的DNA原材料切割成具特定末端的DNA片段。现已从不同生物中发现和分离出上千种限制性核酸内切酶，基本上可满足按不同目的切割各种DNA分子的需要。耐热性限制性核酸内切酶和长识别序列稀切酶仍是当前研究的热门课题。

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DNA连接酶用于连接各种DNA片段，使不同基因重组。现在常用的DNA连接酶只有两种，即大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶。

DNA聚合酶用于人工合成连杆、引物等DNA小片段以及含基因的较大的DNA片段，还用于制备DNA探针。多种耐热性DNA聚合酶的发现，使使PCR技术迅速发展．给当今生命科学提供了先进的研究手段。第15页,共172页，2024年2月25日，星期天

(5)基因工程新技术研究围绕外源基因导人受体细胞，发展了一系列用于不同类型受体细胞的DNA转化方法和病毒转导方法，特别是近年来研制的基因枪和电激仪克服了某些克隆载体应用的物种局限性，提高了外源DNA转化的效率。围绕基因的检测方法，在放射性同位素标记探针的基础上，近年来又发展了非放射性标记DNA探针技术和荧光探针技术，如生物素标记DNA探针、Dig标记DNA探针、荧光素标记DNA探针等。

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PCR技术的发展提高了基因检测的灵敏度，为分离基因提供了快速简便的途径。PCR技术自从1985年建立以来，发展很快，除一般采用的常规PCR技术外还发展了多种特殊的PCR技术，如长片段PCR技术、反转录PCR技术、免疫PCR技术、套式引物PCR技术、反向PCR技术、标记PCR技术、复合PCR技术、不对称PCR技术、定量PCR技术、锚定PCR技术、重组PCR技术、加端PCR技术等等。凝胶电泳技术可以在凝胶板上把不同分子大小的DNA分子或DNA片段分开，但是只能分辨几万碱基的DNA分子或片段。脉冲电泳技术的问世，不仅能分开上百万碱基的DNA分子或片段，而且能够使完整的染色体彼此分开。第17页,共172页，2024年2月25日，星期天

2应用研究基因工程技术已广泛应用于医、农、牧、渔等产业，甚至与环境保护也有密切的关系。研究成果最显著的是基因工程药物，转基因植物的研究也取得了喜人的成果。第18页,共172页，2024年2月25日，星期天

在农业的应用

应用重组DNA技术培育具有改良性状的粮食作物的工作已初见成效。现在已经培育成功了一批分别具有抗病、抗虫和抗除草剂性状的转基因农作物。例如，应用反义RNA技术培育成功的具有耐贮藏的转基因西红柿已开始在美国投放市场。利用植物合成微生物甚至哺乳动物的一些特殊蛋白质，例如干扰素、人血清蛋白等也已有—些成功的报道。从理论上讲，在将来还有可能通过转基因植物生产更多的药用蛋白质。我们有理由相信，重组DNA技术在农业生产中的应用，是具有光辉的前景的。第19页,共172页，2024年2月25日，星期天

重组DNA技术显著特点:可以使一个生物获得与之固有性状完全无关的新功能，从而引起生物技术学发生革命性的变革，使人们可以在大虽扩增的细胞中生产哺乳动物的蛋白质，其意义无疑是相当重大的。

将控制这些药物合成的目的基因克隆出来，转移到大肠杆菌或其它生物体内进行有效的表达，于是就可以方便地提取到大量的有用药物。目前在这个领域中已经取得了许多成功的事例，其中最突出的要数重组胰岛素的生产。

第20页,共172页，2024年2月25日，星期天在医药业的应用

转基因细菌生产激素类药物转基因细菌生产抗生素：转基因微生物生产疫苗：在工业原料生产上的应用

转基因微生物生产高分子多聚物转基因微生物与环境净化和废料再生第21页,共172页，2024年2月25日，星期天

四基因工程的安全性

1基因工程的安全隐患

对环境的影响:重新组合一种在自然见尚未发现的的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。

新型病毒的出现:

制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。

癌症扩散:

将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。

人造生物扩散:

新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。第22页,共172页，2024年2月25日，星期天

2控制措施

对转基因生物的控制措施有物理的方法和生物的方法。

物理的方法就是通过各种严格的管理措施和物理屏障尽量使转基因生物不能从实验室逃逸进入到自然环境里去。这种措施只能用于控制在实验室里的转基因生物，而且用于控制转基因微生物和通过花粉进行扩散的植物的效力实际上是非常有限的。当转基因动、植物必须用于开放的环境里生产时，物理控制的方法便不再有实际的意义。

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根本性的措施还是生物学的控制方法。即造成转基因生物与非转基因生物之间的生殖隔离。如利用三倍体不育的特性，将用于生产的转基因动物或植物成为三倍体，这样，转基因生物在进入到自然环境里后就不可能自行繁殖，因此也就不可能对生态系统造成长期的影响。也可以利用生理学原理，如激素诱导等方法使转基因生物不育等。第24页,共172页，2024年2月25日，星期天1什么是基因工程技术?2基因工程基础研究的有哪些内容?第25页,共172页，2024年2月25日，星期天PCR技术及其应用第26页,共172页，2024年2月25日，星期天PCR的反应原理PCR的类型和应用PCR示例第27页,共172页，2024年2月25日，星期天

多聚酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)

KaryB.Mullis

PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。第28页,共172页，2024年2月25日，星期天体内DNA的复制体系DNA聚合酶（IIIIII）拓扑异构酶解旋酶类SSB

引物dNTPMg2+5’3’第29页,共172页，2024年2月25日，星期天Mullis的PCR构思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段第30页,共172页，2024年2月25日，星期天Taq

DNA聚合酶（水生栖热菌(Thurmusaquaticus，简称Taq)

)酶活性(%)温度(℃)40506070809010010080604020耐热DNA聚合酶Saiki（1988）将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。第31页,共172页，2024年2月25日，星期天PCR反应循环72℃94℃55℃PCR循环变性退火延伸第32页,共172页，2024年2月25日，星期天第33页,共172页，2024年2月25日，星期天

PCR的指数扩增（2n）引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火第34页,共172页，2024年2月25日，星期天TaqP1P2PCR反应体系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：DNA引物：P1P2DNA聚合酶：Taq原料：dNTP反应缓冲液辅助因子：Mg2+第35页,共172页，2024年2月25日，星期天1）PCR反应成分（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。

DNA模板一般100ng/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。

PCR反应条件第36页,共172页，2024年2月25日，星期天（2）引物浓度

0.1-0.5mol/L

浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq

DNA聚合酶

0.5-2.5U/50l

酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。第37页,共172页，2024年2月25日，星期天（4）dNTP

dNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量

dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。第38页,共172页，2024年2月25日，星期天（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。适宜浓度为0.5-2.5mmol/L反应体系。

Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。

Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。第39页,共172页，2024年2月25日，星期天2）循环参数变性

使双链DNA解链为单链

94℃，20-30秒(2)退火

温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。第40页,共172页，2024年2月25日，星期天（3）延伸

70-75℃,一般为72℃

延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数

主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加第41页,共172页，2024年2月25日，星期天PCR技术的特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍第42页,共172页，2024年2月25日，星期天2）特异性引物引物

引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。第43页,共172页，2024年2月25日，星期天引物设计：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。第44页,共172页，2024年2月25日，星期天3）操作简便易行

利用PCR扩增,只需要数小时,就可以扩增出可用电泳法检出的DNA，可用于检测基因组中仅含数个拷贝的模板序列。

第45页,共172页，2024年2月25日，星期天1）不对称PCR

目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针；基因组DNA结构功能的研究

PCR的类型第46页,共172页，2024年2月25日，星期天

高浓度引物低浓度引物第47页,共172页，2024年2月25日，星期天2)反向PCR(reversePCR)

用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。

未知序列未知序列已知序列第48页,共172页，2024年2月25日，星期天已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶第49页,共172页，2024年2月25日，星期天3）多重PCR（复合PCR）用于检测特定基因序列的存在或缺失。第50页,共172页，2024年2月25日，星期天电泳引物12341234第51页,共172页，2024年2月25日，星期天4）LP-PCR（Labelledprimers)

利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记,用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分第52页,共172页，2024年2月25日，星期天标记引物ＰＣＲ观察PCR产物第53页,共172页，2024年2月25日，星期天5）锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）

锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3’锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增第54页,共172页，2024年2月25日，星期天cDNA末端核酸转移酶3’GG…GG5’CC…CC锚定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC第55页,共172页，2024年2月25日，星期天6）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR扩增探针亲和固相介质检测探针信号可用于基因芯片的制作第56页,共172页，2024年2月25日，星期天第57页,共172页，2024年2月25日，星期天7）原位ＰＣＲ

原位聚合酶链式反应（InStillPCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较少的靶序列。第58页,共172页，2024年2月25日，星期天操作步骤1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2.PCR扩增细胞内目的片段3.原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达第59页,共172页，2024年2月25日，星期天8）ＲＴ－ＰＣＲ逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增第60页,共172页，2024年2月25日，星期天9)荧光定量PCR（real-timePCR)

通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。内掺式染料 SYBRGreenI序列特异性探针 Taqman MolecularBeacons DualProbes(FRET)引物特异性探针

Amplifluor(Intergen)第61页,共172页，2024年2月25日，星期天5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

第62页,共172页，2024年2月25日，星期天

实时荧光定量PCR仪梯度PCR仪普通PCR仪第63页,共172页，2024年2月25日，星期天PCR示例一、实验目的学习PCR分析的原理与技术。第64页,共172页，2024年2月25日，星期天1、材料：含1Kb插入片段的克隆载体Pmd18-T

质粒DNA2、仪器：微量移液器及吸头、PCR仪及PCR管琼脂糖凝胶电泳设备3、试剂：10XPCR 反应缓冲液

25mmol/LMgCl2

10mmol/LdNTP10μmol/L引物1和引物2二、实验材料、仪器和试剂第65页,共172页，2024年2月25日，星期天1.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂并混匀：

10XPCR反应缓冲液2.5μL25mmol/LMgCl22.0μL

10mmol/LdNTP1.0μL10μmol/L引物11.0μL10μmol/L引物21.0μL质粒DNA1.0μLTaq0.1μL(5U)水补充至25.0μL三、操作步骤第66页,共172页，2024年2月25日，星期天2.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂并混匀：

10XPCR反应缓冲液2.5μL25mmol/LMgCl22.0μL

10mmol/LdNTP1.0μL10μmol/L引物11.0μL10μmol/L引物21.0μL质粒DNA1.0μLTaq0.1μL(5U)水补充至25.0μL三、操作步骤第67页,共172页，2024年2月25日，星期天第68页,共172页，2024年2月25日，星期天3.反应完成后,将反应液与凝胶电泳缓冲液按比例混匀,上样电泳。三、操作步骤琼脂糖凝胶电泳第69页,共172页，2024年2月25日，星期天TheEnd！第70页,共172页，2024年2月25日，星期天第71页,共172页，2024年2月25日，星期天分子杂交技术

互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。第72页,共172页，2024年2月25日，星期天一.分子杂交种类

1.按其分子种类划分

1）DNA杂交—探针为DNA或RNA

2）RNA杂交—探针为DNA或cDNA3）蛋白质免疫分析—探针为抗体第73页,共172页，2024年2月25日，星期天2.按样品制备过程划分

1）原位杂交(insituhybridization)

i.原位菌落杂交

ii.原位噬菌斑杂交

iii.原位细胞杂交

iv.原位组织块杂交原位裂解细胞，不需要分离DNA，RNA或蛋白质样品，可同时处理大量样品，常用于目的基因的筛选或检测某类细胞或组织中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白质序列。2）斑点杂交(dothybridization)

先分离DNA，RNA或蛋白质，然后将样品液直接点在固体基质上进行杂交，不能测定分子量大小。第74页,共172页，2024年2月25日，星期天3）转移杂交或印迹杂交(blottinghybridization)

先纯化样品，然后使不同大小的分子在凝胶上分离，转移到固体基质上，与探针杂交。该法可检测出感兴趣分子的分子量。用于转移的方法有：

i.扩散法

ii.毛细管法

iii.电泳转移法

iv.真空转移法

4)夹心杂交法(sandwichhybridization)它利用两种探针与待测DNA结合，先将不带标记的探针固定在基质上，然后用待测样品与之杂交，洗去非特异性结合后，再与第二种带标记的探针杂交。这种方法可用于粗制DNA样品，可检测出0.2ng的DNA样品第75页,共172页，2024年2月25日，星期天3.分子杂交的一般程序

1)DNA和RNA的杂交制备DNA或RNA样品→与固定基质结合→80℃真空固定→预杂交→加入标记探针杂交→洗涤→放射自显影或显色反应。

2）蛋白质的免疫分析制备蛋白质样品→与固定基质结合→常温空气中固定→封闭剂封闭→一抗反应→洗涤→二抗-酶偶联物反应→洗涤→显色反应（EIA）或→一抗放射标记物→洗涤→放射自显影（RIA）二.杂交样品膜的制备

1.固定基质的种类与特性

1）硝酸纤维素滤膜(Nitrocellulosefilter,NCF)

可与三类大分子的结合，其机理不清楚，可能为被动吸附。NCF不能结合小分子DNA，RNA和蛋白质（<20,000）第76页,共172页，2024年2月25日，星期天优点：i.用于DNA，RNA杂交分析时结果可靠，灵敏，本底低。

ii.用于蛋白质分析时，容量大（80μg/cm2)；可直接染色；分辨率高；不需要预激活；易于操作缺点：结合低分子蛋白质不稳定，反复使用探针次数有限（2-3次）

2）重氮化纸：DBM纸与DPT纤维素纸最大特点是能结合小分子的DNA，RNA和蛋白质，共价结合，可用不同探针进行多次杂交分析。该类基质结合生物大分子的能力差，需要激活，分析蛋白质时最好用放射性标记物。这类基质对生物大分子是主动吸附。

3)尼龙膜

i.阳离子尼龙膜（如Zeta-prob,Zeta-bind等）第77页,共172页，2024年2月25日，星期天i)容量大,蛋白质可结合480μg/cm2ii)可结合不同大小的DNA(6n.t.)，RNA和蛋白质。

iii)韧性好

iv)可用于电转移

v)可进行反复多次杂交试验

vi)广泛的化学耐受性和可高温消毒*不能用于蛋白质的直接染色。

ii.尼龙66

广泛用于核酸印迹分析，静电荷可从pH4时阳离子状态转变为pH7时阴离子状态，电转移时要注意。

4）离子膜

i.DEAE-纤维素纸(可用于ss-DNA,ds-DNA,RNA的制备回收)ii.CM-纤维素纸(可用于碱性蛋白质的结合)第78页,共172页，2024年2月25日，星期天2.固定基质的选择依据

1）强度，耐久性，操作简便

2）高信噪比（低本底高信号）

3）生物大分子的结合容量和稳定性

4）重现性好3.各种杂交样品膜的制备

1）原位杂交样品膜的制备

i.原位菌落杂交样品膜第79页,共172页，2024年2月25日，星期天i)细胞培养（高密度，几百—十万个菌落或低密度，几百个以下）

ii)细菌细胞原位裂解与DNA变性

ii.原位噬菌斑杂交样品膜

i)细胞感染和噬菌斑形成（10,000-20,000/平板）

ii)噬菌体转移—用NCF作影印

iii)DNA变性与固定（与上同）第80页,共172页，2024年2月25日，星期天

2）斑点杂交样品膜的制备制备样品→点样→固定（可用斑点杂交仪或直接点样）3）转移杂交样品膜的制备

i.扩散法（Difusionblottingmethod)第81页,共172页，2024年2月25日，星期天

ii.毛细管法(Capillaryblottingmethod)Southern印迹第82页,共172页，2024年2月25日，星期天iii.电转移法(electroblotting)iv.真空转移法(Vaccumbllotting)

转移速度与凝胶的速度和厚度成反比，在相同转移率（50%）时，真空法比毛细管法快13倍，其损失仅6%，而毛细管法损失率20%。第83页,共172页，2024年2月25日，星期天v.各种转移方法的比较

i)扩散法和毛细管法：操作简便，不需要特殊转移仪器，但转移效率低,（扩散法为70%，毛细管法80%）耗时多。

ii)电转移法：效率高，耗时少，需特殊转移仪，对转移条件要求较严。

iii)真空转移法：效率高，耗时最少，需特殊真空转移仪。vi.转移的最佳条件

i)固定基质的选择

ii)转移前预处理：DNA和RNA分子变性，蛋白质则需除去凝胶中的SDS。

iii)大分子的转移对于分子量较大的DNA片段，必须进行原位断裂后再进行转移，断裂DNA分子最佳长度为1-2kb。第84页,共172页，2024年2月25日，星期天

其步骤是：0.25MHCl处理凝胶两次（每次15分钟）→水洗→0.5MNaOH/1MNaCl两次，每次15分钟→转移。对于大分子蛋白质，可采用下述三种方法之一：

解偶联剂使凝胶解聚；蛋白酶作用；转移缓冲液中加入SDS。三.标记探针的制备

1.标记化合物的种类

1）放射性同位素标记物125I，3H，14C用于蛋白质标记；32P，3H，35S 用于核酸标记，其中32P和35S使用频率高。32P标记核苷酸的α位或γ位，35S则是标记核苷酸的α位.第85页,共172页，2024年2月25日，星期天2)非放射性标记物

i.生物素分离自蛋黄的水溶性维生素，它可以和分离自蛋清中的一种碱性蛋白—抗生物素蛋白牢固地结合。每个抗生物素蛋白可结合4个生物素分子。此外，链霉菌抗生蛋白与生物素结合更牢固，可大大提高其灵敏度。生物素可以经过化学法与不同的化合物结合形成标记化合物。

ii.半抗原包括汞，2-乙酰胺二苯丙茂，地高辛配体和金属铕。地高辛配体是一种脂质半抗原，可将其连在dUTP上，然后用酶将其掺入新合成链中。检测上述标记物的方法是利用二抗-酶偶联物反应和显色反应。第86页,共172页，2024年2月25日，星期天iii.蛋白质检测标记物

i)酶偶联二抗（0.05ng）

ii)蛋白质A（来自金黄色葡萄球菌）。可作用于大多数哺乳动物的IgG，灵敏度较低（5ng）

iii)免疫金（immunogold）0.1-0.5ng3)两类标记化合物的比较

i.灵敏度i)检测蛋白质，两种方法差不多。

ii)检测核酸，放射法比酶法敏感。

ii.稳定性酶法探针可在4℃保存一年，放射性标记需每次制备。

iii.安全性非放射性标记安全。

iv.效率非放射性标记所需时间短。第87页,共172页，2024年2月25日，星期天2.标记探针的制备

1）链标记法

i.切口移位法

ds-DNA+DNaseI+DNApolI+dNTP(32P-dCTP)ii.随机DNA引物延伸法

ds-DNA→ss-DNA-(6n,t)→Klenow片段+dNTP(32P)iii.反转录法

mRNA+dNTP(32P)→cDNA（标记）iv.转录法

含有待标记DNA片段的重组质粒+NTP(32P)→SP6聚合酶→RNA（标记）v.引物延伸法含待标记DNA的单链DNA分子(M13mp系列)+引物(15-17n.t)+dNTP(32P)→待标记DNA链第88页,共172页，2024年2月25日，星期天

vi.T4DNA聚合酶法

ds-DNA→T4DNA聚合酶,无dNTP→3’-5’外切酶活性→加入dNTP和标记核苷酸→新合成链（32P）

2)末端标记

i.5’-末端标记

ss-和ds-DNA,RNA→脱磷酸化反应(CIP)→T4DNA激酶(γ-32P)ATPii.3’-末端标记

i)TdT加尾反应，用于dsDNAii)补齐反应第89页,共172页，2024年2月25日，星期天iii)T4RNA连接酶反应RNA-OH+*pNp（3’-5’-二磷酸核苷）+ATP—RNA-*pNPp+pA+ppi3)标记化合物的纯化

i.柱层析利用SephadexG-50，前峰-标记物，后峰-核苷酸

ii.旋转柱层析

快速，简便,可同时纯化多个样品。

四.分子杂交与结果检测

1.核酸杂交与结果检测

1）预杂交：预杂交液中常加入鲑鱼精DNA，若标记探针是cDNA或RNA，预杂交液中还需加入多聚A以阻止特异性结合,42℃4-6h或过夜。

2）杂交：探针100℃变性，迅速冷却，加入预杂交液中，42℃一天第90页,共172页，2024年2月25日，星期天3）洗涤：2×SSC+0.1%SDS常温洗涤两次，1×SSC+0.1%SDS65℃洗涤两次，每次15分钟。若使用低聚核苷酸探针，洗涤温度按下式计算：T=4GC+2AT*高强度与低强度杂交：若具高度特异性同源序列，采用高强度杂交条件；若使低同源性DNA之间杂交，则采用低强度杂交条件。这两种条件之差异表现在杂交液和洗涤液的离子强度以及杂交和洗涤时的温度。4）放射自显影或显色反应使用放射性同位素标记物，采用放射自显影。若采用非放射性同位素标记物，则采用显色反应。显色反应将依据偶联的酶类而定。主要有两种酶：

i.辣根过氧化物酶:可将3，3’-二氨基苯胺氧化成褐色沉淀或将4-氯萘酚氧化成紫色沉淀物。第91页,共172页，2024年2月25日，星期天第92页,共172页，2024年2月25日，星期天ii.碱性磷酸酶的作用底物是5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，在酶作用下，该化合物可转变为兰色沉淀物，该反应中释放的氢离子可将硝基兰四唑还原成深紫色沉淀，这些沉淀物都是沉积在酶的作用位点。

iii.两种酶偶联物的比较

i)碱性磷酸酶的灵敏度比辣根过氧化物酶高10倍左右，但噪声大。

ii)碱性磷酸酶的显色反应可持续几个小时，其显色结果可长期保存，但辣根过氧化物酶的显色反应仅能持续30分钟。

5)杂交结果2.蛋白质的免疫分析封闭剂，明胶，牛血清蛋白，卵清蛋白等。第93页,共172页，2024年2月25日，星期天杂交结果示意图第94页,共172页，2024年2月25日，星期天

核酸序列的测定第95页,共172页，2024年2月25日，星期天一.DNA的核苷酸序列分析

1.种类

1)酶法

i.加减法

ss单-DNA→与引物退火→加入4种dNTP和DNA聚合酶→分离纯化ds-DNA→加减法定序系统测序。

加法系统：ds-DNA4份，每份中加入一种脱氧核苷酸和DNA聚合酶。

减法系统；ds-DNA4份，每份加入三种脱氧核苷酸和DNA聚合酶。该法操作复杂，读序较难，但其前半部反应可在其他定序方法中用于序列延伸。第96页,共172页，2024年2月25日，星期天ii.双脱氧核苷酸链终止法(dideoxy-terminationsequencing)

原理：双脱氧（2'，3'）-核苷酸可以象2'-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中，但因3’端不具OH基，DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列。第97页,共172页，2024年2月25日，星期天第98页,共172页，2024年2月25日，星期天

过程：制备ss-DNA→与引物退火→分为4个反应系统→每个系统中加入dNTP（其中dATP常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸→DNA聚合酶定序反应→反应产物变性后电泳→凝胶干燥→放射自显影。`

该法也适合mRNA的序列分析。

GC富集区常出现“隐影”或“停止”现象，如在反应中加入dITP（脱氧三磷酸次黄嘌呤）或脱氧三磷酸-7-脱氧鸟苷可解决GC富集区的测序。

2)化学法

原理：DNA链上的不同碱基可以和碱基修饰剂发生反应，然后发生碱基脱落或取代，最后发生链断裂，不同位置断裂的DNA分子经凝胶电泳就可确定其核苷酸序列。第99页,共172页，2024年2月25日，星期天i.嘌呤（A和G）序列测定

硫酸二甲酯处理DNA链时，G的7位和A的3位氮原子被甲基化，甲基化后的嘌呤环可被哌啶取代，从而导致链断裂。由于G比A更易甲基化（5倍），且mG比mA更不稳定，因而易发生链断裂。控制好反应温度与时间，只使G反应而A不反应，从而可测出G序列。若用甲酯代替硫酸二甲酯，A与G均会发生反应。比较两反应系统电泳结果，就可知道A的序列。

ii.嘧啶（C和T）序列的测定用肼处理ss-DNA时，可使嘧啶开环，被哌啶取代后而导致磷酸二酯键断裂。若反应在高盐浓度下进行，T与肼的反应受抑制，因而可测得C的序列，比较加盐与不加盐反应的结果，就可测定T的序列。该法的一大优点是不需要模板，引物和DNA聚合酶。待测DNA链的检测用32p末端标记。第100页,共172页，2024年2月25日，星期天哌啶硫酸二甲酯甲基化第101页,共172页，2024年2月25日，星期天肼哌啶第102页,共172页，2024年2月25日，星期天第103页,共172页，2024年2月25日，星期天2.DNA定序的一般程序

酶法测序(Sanger)

化学测序法(Maxam-Gilbert)

待测DNA片段待测DNA片段

↓

↓次克隆5’-末端标记

↓筛选重组子链分离限制酶切

↓模板增殖与纯化↓

↓纯化标记的ss-DNA

与引物退火↓

↓定序反应定序反应

↓聚丙烯酰胺凝胶电泳

↓真空干燥

↓放射自显影

↓阅读序列和计算机录入

↓核苷酸序列的分析与比较第104页,共172页，2024年2月25日，星期天

3.两种定序方法的比较

1)化学法

i.优点:所有片段具有相同的标记强度；一次可以读出250-400个核苷酸；定序分析不需要次克隆；不受二级结构区的影响；多A区定序清楚；适合500bp或以下DNA片段的定序分析。

ii.缺点:需限制酶图；需放射自显影时间较长和增感屏；DNA片段需经凝胶纯化；多嘧啶区定序不够清楚；所用试剂为诱变剂和致癌物质。

2)酶法

i.优点:反应简单，易于操作；具有配套载体和宿主菌；不一定需要详尽的限制酶图；可采用多种方法进行次克隆。

ii.缺点:DNA带放射强度不均匀；下游碱基阅读困难；需要大量的次克隆和鉴定工作；二级结构区和多C区定序困难。定序方法的选择主要依据所需测序DNA长度，实验目的等。第105页,共172页，2024年2月25日，星期天二.酶法定序系统

1.单链定序系统

1）M13mp

系列载体定序系统

i.从细菌细胞中获得ds-DNA，以利待测DNA片段的重组，经转化进入细胞；

ii.从培养液中可获得病毒颗粒，从中提取ss-DNA用于测序，病毒颗粒经感染将-DNA引入细胞；

iii.含有β-半乳糖甘酶α-链基因，易于重组子检测；

iv.多克隆位点区有利于外源DNA插入，因配套载体的多克隆位点区方向相反，有利于待测DNA端靠近载体上的引物变性区；

v.各种引物易于获得；

vi.有与载体配套的各种宿主菌，如：E.coliJM系列，DH5αF’

等。第106页,共172页，2024年2月25日，星期天

2)噬粒载体定序系统

该系统具上述M13mp系统的特点外，它容纳的外源DNA片段较长；直接在同一重组分子进行各种次克隆；操作较简单，同时亦可用于双链定序。与M13mp系统相比较，噬粒载体系统有以下两缺点：

i.形成单链时需辅助噬菌体，它亦可形成病毒颗粒；

ii.制备ss-DNA时需较大量培养液，而M13mp系列载体仅需

1.5ml培养液即可。

2.双链定序系统任何一种质粒载体质粒载体均可用于此目的，只要有适合的引物。该系统的一个最大优点是操作简单，可进行双向定序，大大减少次克隆工作量。与单链定序系统相比较，该系统每次可阅读序列较少，反应中其他干扰较多。第107页,共172页，2024年2月25日，星期天

3．测序引物，同位素和酶

1）引物正向引物与反向引物：凡是含有LacZα基因失活的标记基因的各种载体，与多克隆位点区下游某序列可复性的引物称为正向引物（forwardprimer）；反之，位于多克隆位点区上游的引物称之为反向引物（reversedprimer）当使用噬粒载体定序时，一定要注意包装入噬菌体中单链是+或-链，相应引物只能选用一种。第108页,共172页，2024年2月25日，星期天

2）同位素如果是作链标记，常用的同位素是[α-32P]-dATP或[α-35S]dATP，其放射比活性较低。如果是做引物标记，则用[γ-32P]ATP。当用PCR方法定序时，则常采用引物的5'-端标记。

3）聚合酶

可用DNApolIK，TTDNA聚合酶，DNA定序酶，TagDNApol等。除上述因素外，不同测序系统中使用的dNTP/ddNTP比值对定序结果影响也很大。多克隆位点

第109页,共172页，2024年2月25日，星期天三.DNA序列的快速测定快速测定DNA序列应同时从以下两方面考虑：

i.每次定序反应的核苷酸序列可读数尽可能大，可大大减轻次克隆

(模板)的工作量；

ii.提高次克隆效率，使一次反应就能获得所需的全部重组体，尽量减少重组子鉴定步骤。

1.延伸DNA定序方法

ss-DNA模板→与引物退火→加入dNTP和DNApol反应约5’（室温）→分为4个反应系统进行→双脱氧核苷酸定序（37℃5分钟）→凝胶电泳→放射自显影→读序。

2.DNA片段的次克隆方法第110页,共172页，2024年2月25日，星期天2）双向缺失法1）限制酶切法必备条件：详尽限制酶图；各切点序列必须为另一次克隆片段测序时覆盖。第111页,共172页，2024年2月25日，星期天3）单向缺失法4）鸟枪法（随机片段法）第112页,共172页，2024年2月25日，星期天

3.特殊缺失法

1）洪国藩法

2）郭礼和法第113页,共172页，2024年2月25日，星期天3）单链缺失法

第114页,共172页，2024年2月25日，星期天4.多引物测序4）直接顺序缺失法第115页,共172页，2024年2月25日，星期天四.DNA序列测定的自动化

1.DNA测序步骤与自动化

1）模板制备可自动化

2）定序反应可自动化

3）凝胶电泳自动化有一定困难：制胶，点样，电泳，凝胶干燥，放射自显影。

4）核苷酸序列阅读与计算机输入可自动化

2.自动测序