动物细胞培养常用技术

动物细胞培育常用技术动物细胞培育中山大学试验动物中心前言1885年Roux最早尝试使组织离体培育，材料是鸡胚神经板，承受生理盐水为培育液，并首次承受组织培育这个术语。1907Harrison1912Carrel的培育。由于组织培育在医学争论中的应用，如抗病的生产等，现已经渐渐进展成为一门精细技术。很多细胞株、细胞系的培育成功，尤其是以人的肿瘤组织为材料建立的各种细胞系，如Hela细胞系〔Gey，1952，可用来进展一系列争论，更加促进了组织培育技术的进展。组织培育中热门的争论领域细胞内部的活动，如DNA的复制和转录、蛋白质合成、能量代谢；细胞内部的流淌，如RNA从细胞核向细胞质方向运转，激素受体复合物的易位等；生态学，如养分、感染、病毒或化学诱变、药物作用；细胞与细胞之间的相互作用，如胚胎诱导、细胞群体的动力学等。组织培育的分类及根本概念分类:组织培育(TissueCulture)指的是从体内取出组织，在模拟体内生理环境，无菌、适当温度和肯定养分条件下，使之生存和生长并维持其构造和功能的方法。细胞培育(CellCulture)培育物是单个细胞和细胞群。器官培育〔OrganCulture〕培育的是器官的原基、器官的一局部或整个器官，使之在体外生存、生长和保持肯定功能的方法。组织培育的细胞生物学特点:体内外细胞的差异：当人工条件和体内实际状况不完全一样时，细胞在体外培育后，一旦失去神经体液调整和细胞间相互影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，发生变化则是必定。细胞最多见的表现是：返祖〔Atavism〕现象，即失去原有组织构造和细胞形态、分化减弱或不显、细胞趋单一化、不死性、恶性状。细胞增殖和分化：是细胞生命进化中所获得的根本属性，增殖使细胞数量增多；分化使机体构造和功能多样化，最终演化成完整的有机体。培育细胞的分化细胞分化机制是极其简单的，是在细胞与细胞、细胞与体液和细胞与细胞外基质相互作用下，众多基因参与、经过多阶段和多环节完成的动态演化过程。不适应〔Deadaption〕酸转移酶的特性。脱分化〔去分化Dedifferentiation〕酶的特性后，储存肝糖元的力量丧失，并很难再现。不适应和脱分化两个概念不同：不适应是由于生存条件转变而使分化发生抑制；从分子水平考虑，脱分化很可能是基因变异所致。培育细胞的形态贴附型：成纤维细胞：心肌细胞，血管内皮细胞等上皮型细胞：消化管外皮细胞，肝脏上皮细胞等游走型细胞：神经胶质细胞多形型细胞：神经组织细胞悬浮型：如癌细胞培育细胞的生长和增殖原代培育〔PrimaryCulture〕阶段：或称初代培育。从体内取出组织接种培育到第一次传1~4w传代培育〔Subculture〕阶段：或称继代培育。也就是细胞系〔Cellline〕阶段，细胞增10-50。衰退阶段：自发性转化SpontaneousTransformation：其标志是获得永生性Immortality〕〔Malignancy〕(Infinitecellline)或连续细胞系(Continuouscellline)。如：BHK〔仓鼠肾成纤维细胞F9〔小鼠胚胎癌细胞M2R〔黑色素瘤细胞〕培育细胞的传代培育当细胞生长到达肯定密度后，都需要做传代处理，传代的频率或间隔与培育液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖速度有关。50代即该细胞50细胞传代的三个阶段1〕埋伏期〔Latentphase：细胞从接种到贴壁生长生殖的一段时间。二倍体细胞该期时间长〔24~96h；连续细胞系时间短〔10~30min。指数生长期〔Logarthmicgrowthphase：细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指数〔Mitoticindex，MI〕表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培育细胞分裂指数介于0.1~0.5%，且受细胞种类培育液成分、pH、温度等影响。指数生长期是细胞活力最好的时期，在接种细胞数量适宜状况下，指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋削减，细胞相互接触集合成片，呈现接触抑制〔Contactinhibition一。〔Densityinhibition〕停滞期〔Stagnatephase：即细胞数量到达饱和密度后，细胞与养分液的交换面积削减，代谢产物积存，PH下降细胞停顿增殖，进入停滞期。在此时应准时进展换液传代，否则因细胞中毒受损，大量细胞消灭1-2细胞培育的根本条件仪器和设备:CO2培育器材：如培育瓶，纯水设备，枯燥消毒除菌设备，清洗设备等。培育液:目前常用的根底培育液均已商品化，如RPMI1640，MEM，DMEM，F12等，可依据培育需求合理选择。细胞培育的根本条件血清：一般常用为小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它动物血清。的争论时，需要使用无血清培育基。细胞培育的根本条件平衡盐溶液:主要用于作为稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压，供给缓冲系统，使培育液的酸监度维持在培育细胞生理范围内，供给细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。PBS，Hank’s〔50~100〔50~100。其它添加成分：缓冲系统，常用为HEPES〔’-2-hydroxy-ethylpiperazine-N’-ethanesulfonicacid，缓冲效能(pKa)20℃7.55，37℃7.31；HEPESpHpHpHNaHCO3有机补充物，如丙酮酸钠，谷胺酰氨等。促细胞分裂因子，如生长因子类的FGF(成纤维细胞生长因子)，EGF(表皮生长因子)。贴壁和铺展因子，如胶原蛋白，纤粘蛋白等。可依据培育细胞的特别要求进展添加。培育液的物理性质pHpH7.46.8，7.6。酚红是常用的指示剂，用来检测PH--pH7.4，橙色--pH7.0，黄色--pH6.5，蓝红色--pH7.6，紫色--pH7.8。pHCO2pH。260~320mosm/kg290mosm/kg310mosm/kg。粘度：由于血清的存在，直接影响培育液粘度。外表张力：培育液的外表张力有利于培育物粘着于底物上面。细胞培育的根本方法组织、细胞的解离方法解离组织：在无菌状况下实行动物的组织或器官，放在含有抗生素的平衡盐溶液(BSS)中，然后尽快在超净台或无菌室内进展解离处理。解离时应留意:尽可能将脂肪和坏死组织去除干净；剪碎组织时，避开损伤组织块；解离组织用的各种酶系，需要先进展低速离心。解离细胞常用酶和鳌合剂进展解离：当试验室需要制备具有均匀细胞层的培育物；从单个细胞动身获得细胞群体；从肯定量的组织中获得最多的细胞量时。解离细胞的方法胰蛋白酶解离细胞法：所需时间较短，主要缺点是破损细胞。胶原酶解离细胞法：这种方法对解离胚胎性、正常和恶性组织是很有效的。胶原酶最终200u/ml，36.5℃4-48h。胶原酶和透亮质酸酶协同作用有助于分别大鼠或兔的肝脏组织。机械解离细胞法：比酶法所需时间短，但细胞存活率较低。螯合剂解离细胞法：分别效果差原代细胞培育外植块培育：外植块在肯定限度内可保持其原有组织构造，有利于其适应体外培育环境。短期培育的外植块成为细胞培育的材料来源之一。单层细胞培育：每隔1~3d换液一次，细胞长成单层后传代培育。悬浮细胞培育：使细胞成悬浮状态在培育液中连续生长。由于细胞本身是不粘附的，如小鼠白血病细胞和腹水肿瘤细胞；通过机械搅动使细胞保持悬浮状态；通过选择培育得到能悬浮生长的细胞进展悬浮培育。细胞培育中应留意的几个问题培育液和培育物的比例：肯定浓度的培育液仅能支持肯定数量的细胞生长，不能盲目增加每单位体积的细胞浓度。PHpH7.4，7.0。培育瓶内的空间：一般培育瓶内培育液与液面上的空间体积之比为1:10。0.2~0.5ml/cm2。需高浓度氧的，在浅的培育液〔2mm〕中生长较好；需要低浓度氧的。在深的培育液〔5mm〕中生长较好。5〕去除死细胞6〕温度掌握：动物细胞培育对温度波动的敏感性很大。温度低于36.5℃，细胞生长缓慢；37.5℃，细胞存活力降低。细胞系及其鉴定类型也是多种多样的。所以再培育不仅仅是为了维持细胞不断地生长，而且是使培育物逐步成为具有增殖力量、特征专一、类型均匀的培育细胞，即细胞系(Cellline)。细胞克隆技术培育细胞系可承受细胞克隆技术。一个克隆的细胞群体是从一个单一母细胞生殖而来，分别单一细胞并使其生殖为一细胞群体的方法称为克隆化(cloning)。细胞克隆技术的方法稀释铺板法饲养层克隆法胶原膜板或纤维蛋白膜板克隆法琼脂克隆法在琼脂基底上用甲基纤维素克隆法细胞系鉴定当细胞系建立后，应对细胞系进展一系列鉴定后，才能应用于细胞生物学、免疫学、细胞遗传学等方面的争论。鉴定内容应包括:细胞系的细胞来源；鉴定细胞系的纯度，即除了主类细胞外，还杂有哪类细胞；细胞系的稳定性，即在细胞连续培育过程中主要指标应无明显变化；累积细胞系的形态及其表达特征的根本数据，以及其与来源细胞的差异等；细胞系鉴定指标形态学：活细胞观看；固定染色观看培育细胞。染色体：染色体是一种鉴定细胞系的种属、性别来源较为精准的指标；也是检查细胞系是否趋于稳定，在离体培育条件下细胞有否发生转化的牢靠指标；是区分正常细胞与恶性细胞的指标。承受染色体数目、核型分析以及染色体分带技术检测。同工酶谱：通常承受G6PD(葡萄糖-6-LDH(依据条件选择。DNA限制性片断长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphismRFLP)是指那些在生物进化过程中，DNA序列发生某些中性突变，突变的结果是失去或获得一个酶切点，因此当基因组DNA用限制性内切酶酶切后，限制性内切酶片断加长或缩短；用同源的克隆DNADNADNA列序列转变，影响内切酶切点,使内切酶酶切片断呈多态性。Southern培育细胞的污染问题及检测细胞培育的污染问题格外重要，一旦发生污染，将导致前功尽弃。所以细胞培育肯定要建立无菌观念。遇到培育污染要分析缘由，准时处理。细胞污染的种类和判定细胞培育中常见的污染物有细菌、酵母菌、真菌、支原体和病毒等。在消灭以下状况时培育的细胞可能有污染：培育液的酸碱度发生特别的转变。培育液消灭混浊。光镜观看到菌丝和颗粒。细胞消灭死亡或增殖缓慢等。污染物的检测细菌和真菌污染的检测：涂片染色镜检；接种培育：TrypticaseBHI、Thioglycocollate菌检测；SabouraudYM检测到阳性结果后，应高压灭菌处理污染的培育物及其用具。支原体检测:支原体污染细胞后，能抑制细胞代谢和生长，转变核酸合成，影响细胞的抗原性，引起细胞染色体转变，干扰病毒的复制，以及具有类病毒作用。在培育细胞初期，由于支原体对细胞的生殖影响较小而往往被无视。支原体检测方法和处理荧光技术检测：支原体含有DNA，Hoechest33258依据细胞外表的荧光来显示细胞是否污染有支原体。直接培育法：试验室常用。放射自显影检测：DNA检测完毕后，全部试验用具均应经过高压消毒处理。污染支原体后的处理：抗生素处理：如参加泰乐菌素等。共培育法：与巨噬细胞共培育。重克隆法：抗生素处理后，将细胞稀释后传代，每周换2次含抗生素的颖培育液，4~52过滤法：0.22μm污染病毒的检测致细胞病变效应〔CPE〕或集落的检测：承受相差显微镜检测血细胞吸附试验；鸡胚接种。细胞间穿插污染为避开细胞间穿插污染，应留意：了解各细胞系的特征；培育各细胞系的操作手续要快速；培育各细胞系不用同一瓶的培育液和酶等；吸过培育液和细胞悬液的吸管，不能放回储存培育液和酶的瓶内；常常检查培育物特征，留意任何突然的形态学转变，通过染色体或同工酶谱分析，检查是否有穿插污染。〔复苏。要获得好的冻存与复苏效果，必需了解如下几个问题：冷冻速率、复温速率、冷冻保护剂，冷冻保存温度。1、冷冻速率冷冻速率太快或太慢都会造成细胞的损伤，只有以最适的冷冻速率冷冻细胞，才能获得最正确的冷冻保存效果。不同细胞最适冷冻速率的值也有所不同，如小鼠骨髓干细胞、酵母、人红细胞最适冷冻速1.6℃、