布鲁氏菌病检测

布鲁氏菌病检测一、概念：布鲁氏菌病（以下简称布病）是由布鲁氏菌引起的人、畜共患的传染病。在家畜中，牛、羊、猪最常发生，且可由牛、羊、猪传染给人和其他家畜。其特征是生殖器官和胎膜发炎，引起流产、不育和各种组织的局部病灶。二、检测技术血清学检测技术病原学检测技术（一）血清学检测技术1、凝集反应

抗原与抗体之间具有特异性的化学亲和力，当它们比例合适时，则构成一个大复合物，在电解质(一般用生理盐水)的作用下,形成肉眼看可见凝集现象，因此称为凝集反应。2、虎红平板凝集试验2.1材料准备2.1.1抗原、标准阳性血清、阴性血清由制标单位提供，按说明书使用。2.1.2受检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血和腐败气味。2.1.3洁净的玻璃板，其上划分成4cm的方格。2.1.4吸管或分装器，适用于滴加0.03ml。2.1.5牙签或火柴杆，供搅拌用。2.2操作方法2.2.1将玻璃板上各格标记受检血清号，然后加相应血清0.03ml。2.2.2在受检血清旁滴加抗原0.03ml。2.2.3用牙签类小棒搅动血清和抗原使之混合。2.2.4每次试验应设阴、阳性血清对照。2.3判定2.3.1在阴、阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进行判定。2.3.2受检血清在4min内出现肉眼可见的凝集现象者判为阳性（+），无凝集现象，呈均匀粉红色者判为（-）。虎红平板凝集试验照片虎红平板凝集试验照片虎红平板凝集试验照片虎红平板凝集试验照片虎红平板凝集试验照片3布病试管凝集试验3.1材料准备3.1.1稀释液

0.5%石炭酸生理盐水，检验羊血清时用含有0.5%

石炭酸的10%盐溶液，如果稀释用含0.5%石炭酸的10%盐溶液，抗原的稀释亦用含0.5%石炭酸的10%盐溶液。

3.1.3凝集试验管（三分管）、试管架、吸管及温箱。3.1.2抗原、阳性血清和阴性血清由制标单位提供，按说明书使用。3.2操作方法3.2.1按常规方法采血分离血清。3.2.2运送和保存血清样品时防止冻结和受热，以免影响凝集价。若3d内不能送到实验室，按每9ml血清加1ml0.5%石炭酸生理盐水（徐徐加入）防腐，也可用冷藏方法运送血清。3.2.3受检血清的稀释3.2.3.1第1管标记检验编码后加1.15ml稀释液。3.2.3.2第2~4管各加入0.5ml稀释液。3.2.3.3然后用1ml吸管取被检血清0.1ml；加入第1管内，并混合均匀。混合方法是将该试管中的混合液吸入吸管内，再沿试管壁吹入试管中，如此吸入、吹出3~4，充分混合后以该吸管吸混合液0.25ml弃去。3.2.3.4取0.5ml混合液加入第2管，用该吸管如前述方法混合。3.2.3.5再吸第2管混合液0.5ml至第3管，如此倍比稀释至第4管，从第4管弃去混匀液0.5ml。3.2.3.6稀释完毕，从第1至第4管的血清稀释度分别为1:12.5;1:25;1:50和1:100。3.2.3.7牛、马、鹿、骆驼血清稀释法与上述基本一致，差异是第1管加1.2ml稀释液和0.05ml被检血清。3.2.3.8将0.5ml20倍稀释的抗原加入已稀释好的各血清管中，并振摇均匀，羊和猪的血清稀释则依次变为1:25;1:50;1:100和1:200，牛、马和骆驼的血清稀释度则依次变为1:50;1:100；1:200和1:400。大规模检疫时也可只用2个稀释度，即牛、马、骆驼用1:50和1:100，猪、山羊、绵羊和狗用1:25和1:50。

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3

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n血清稀释度1:501:1001:2001:4001:8000.5%石炭酸生理盐水1.20.50.50.50.50.5弃去0.5被检血清或阳阴性血清对照0.050.75弃去0.25

0.50.50.50.5

总量0.50.50.50.50.50.5加抗原（1：20）

0.50.50.50.50.50.5充分混匀37℃18-24小时温育

结果判定

++++++++++--布鲁氏菌病试管凝集反应试验（牛）

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3

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5

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n血清稀释度1:251:501:1001:2001:4000.5%石炭酸10%盐水1.150.50.50.50.50.5弃去0.5

被检血清或阳阴性血清对照0.10.75弃去0.25

0.50.50.50.5

总量0.50.50.50.50.50.5加抗原（1：20）

0.50.50.50.50.50.5充分混匀37℃18-24小时温育

结果判定

++++++++++--布鲁氏菌病试管凝集反应试验（羊）

3.2.3.10每次检验均应设阳性血清、阴性血清和抗原对照，即

a)阴性血清对照：阴性血清的稀释和加抗原的方法与受检血清同。

b)阳性血清对照：阳性血清须稀释到原有滴度，加抗原的方法与受检血清同。

c)抗原对照：1:20稀释抗原液0.5ml，再加0.5ml稀释液，观察抗原是否有自凝现象。

注：试管凝集试验简便方法试管凝集试验也可用较简便方式进行，即将血清以0.08毫升、0.04毫升、0.02毫升及0.01毫升分别加入四支小试管内，然后每管加入1：40稀释的抗原1毫升，充分摇匀，这样4管血清的最后稀释度分别为1：25、1：50、1：100和1：2003.3判定3.3.1供判定参照比浊管制备方法管号1：40稀释抗原液mL稀释液mL清亮度记录标记123450.000.250.500.751.001.000.750.500.250.001007550250++++++++++-3.3.2置37℃~40℃温箱24h，取出检查并记录结果。3.3.3结果判定3.3.3.1凝集反应程度分为：参照比浊管，按各试管上层液清亮度判读

a)++++菌体完全凝集，100%下沉，上层液体100%清亮；

b)+++菌体几乎完全凝集，上层液体75%清亮；

c)++菌体凝集显著，液体50%清亮；

d)+凝集物有沉淀，液体25%清亮；

e)–凝集物无沉淀，液体均匀浑浊。3.3.3.2牛、马、鹿和骆驼1:100血清稀释，猪、山羊、绵羊和狗用1:50血清稀释，出现“++”以上凝集现象时，受检血清判定为阳性。3.3.2.3牛、马、鹿和骆驼1:50血清稀释，猪、山羊、绵羊和狗用1:25血清稀释，出现“++”以上凝集现象时，受检血清判定为可疑反应。布病试管凝集试验照片布病试管凝集试验照片布病试管凝集试验照片布病试管凝集试验照片布病试管凝集试验照片可疑反应家畜经3周~4周后重检，如果仍为可疑，该牛、羊判为阳性。猪和马经重检仍保持可疑水平，而农场的牲畜没有临床症状和大批阳性患畜出现，该畜被判为阴性。

猪血清偶有非特异性反应，须结合流行病学调查判定，必须要时应配合补体结合试验和鉴别诊断，排除耶森氏菌交叉凝集反应。布鲁氏菌病检测结果记录表检品编号：

**号

样品名称：检测方法：虎红平板凝集、试管凝集检测时间：

备注:GB/T18646-2002

共

页第

页检测编号原始编号

检测结果检测编号原始编号

检测结果11722833944105阳性对照+116阴性对照-12结果分析：共检样品多少,其中阳性多少,可疑多少,阴性多少备

注（使用方法）:使用方法,使用试剂厂家及批号检验人员：

复核人：

年

月

日试管凝集反应试验原始结果记录表编号稀释度1:501:1001:2001:4001122334阳性对照####5阴性对照----检验人员：

复核人：

年

月

日病原学技术一、分离培养和培养基1分离培养凡从可疑病畜、野生动物或者可疑物中分离到布鲁氏菌，即可诊断为布鲁氏菌病或带菌。目前已清楚了解，除了外界环境中有布鲁氏菌存在外，还在60多种家畜和野生动物中分离到了布鲁氏菌。分离到布鲁氏菌是了解疫情、分析疫情、判断疫情的最可靠资料。1.1牲畜材料中的布鲁氏菌分离培养方法1.1.1流产胎儿培养方法:

流产胎儿取来后，先用清水把泥土等污物洗净，然后在3%的来苏儿中浸泡半小时以上，取出在无菌条件下进行解剖。分别取出淋巴结、肝、脾、胃内容物、肺和骨髓等接种在普通培养基或者选择性培养基上，置37℃温箱培养。一般情况下3~5天即可获得阳性结果。2周内无阳性结果可停止培养。牲畜流产胎儿或者死羔犊是布鲁氏菌分离培养最可靠、最有价值的细菌学材料。在流产胎儿的细菌分离中各种器官均有较高的分离率，尤其肺、脾和胃内容物。1.1.2胎衣的检查：取流产和正产的胎衣用清水洗去粪便等污物，再剪下数个子叶，用灭菌生理盐水冲净，然后用灭菌研磨器研碎或剪碎，接种在选择培养基上或做生物学检查。2布鲁氏菌的培养基及其制备方法2.1土豆琼脂培养基：蛋白胨10克琼脂15克氯化钠5克牛肉浸膏5克葡萄糖10克甘油8~12克

1:2土豆浸液500毫升蒸馏水500毫升除葡萄糖外，将上述各成分混合熔化，用多层纱布过滤，用20%的氢氧化钠调pH7.2,加入葡萄糖，分装，15磅高压20分钟备用。

1:2土豆浸液的制备：新鲜土豆去外皮，切成块，称取500克，放1000毫升蒸馏水中加热煮沸，熟了为止（约10分钟），用纱布过滤，其液体置15磅高压20分钟备用。2.2肝浸液琼培养基：蛋白胨10克氯化钠5克琼脂15克1:4肝浸液1000毫升将上述各成分混合熔化，用多层纱布过滤，用20%的氢氧化钠调pH7.2,分装，15磅高压20分钟备用。

1:4肝浸液的制备：取新鲜牛肝（羊和猪肝也可以）去其脂肪和结缔组织后用清水轻轻洗，用绞肉机绞碎称取250克，加入蒸馏水1000毫升，在冰箱中浸泡24小时，取出加热煮沸到熟为止，用帆布或纱布脱脂棉过滤，15磅高压20分钟备用。2.3胰蛋白胨琼脂培养基：胰蛋白胨20克葡萄糖10克氯化钠5克琼脂20克蒸馏水1000毫升先把琼脂放在蒸馏水中加热熔化，然后将上述其余各成分加入熔化，用纱布脱脂棉过滤，调pH6.8~7.0，分装，13磅高压30分钟备用。二、防止与个人防护1防止经皮肤感染、粘膜感染和呼吸道感染1.1防止家畜流产物引起感染：接羔助产人员，在接种羔助产和处理胎儿，死羔时，应做好个人防护，除备有工作服，橡皮围裙、帽子、口罩和胶鞋外，还应该戴乳胶手套和线手套，备有接羔袋和消毒液，严禁赤手抓拿流产物。家畜的流产胎儿、胎盘、胎衣或死胎等，不要随意丢弃，以防污染环境或被狗吃掉引起布病传播。1.2防止经粘膜感染:这里所指的粘膜感染主要是指性器官粘膜。实践证明，布氏菌很容易经性器官粘膜感染发病。1.3防止经呼吸道感