基因工程的基本操作程序（第二课时）课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

第2节基因工程的基本操作程序第二课时1.目的基因的筛选与获取（前提）2.基因表达载体的构建（核心）3.将目的基因导入受体细胞（关键）4.目的基因的检测与鉴定（保证）（1）从基因文库中获取（2）人工合成法（3）利用PCR技术获取和扩增（回顾）耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（DNTP）引物待扩增的DNA片段（模板）5’5’变性复性延伸温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。PCR回顾【思考】真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？转录初级RNA成熟mRNA剪切、拼接DNA聚合酶单链DNAcDNA逆转录酶逆转录复制cDNA不含有非编码序列。即启动子、终止子和内含子。非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345启动子终止子基因表达载体启动子：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。终止子：终止目的基因转录的脱氧核苷酸序列。标记基因：目的基因：复制原点：便于重组DNA分子的筛选。能控制表达所需要的特殊性状。注意：目的基因必须插入到

与

之间。启动子终止子DNA复制的起始位点。启动子终止子起始密码子终止密码子位置作用DNAmRNA转录的起点和终点翻译的起点和终点载体≠表达载体二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。二.基因表达载体的构建（核心）重组DNA分子DNA连接酶获取目的基因限制酶目的基因限制酶切割位点基因表达载体构建模式图限制酶启动子限制酶切割位点终止子标记基因复制原点质粒同种限制酶或能产生相同末端的限制酶构建过程1)单酶切法单酶切的方法缺陷是什么？3.构建过程自连目的基因自连质粒自连片段间的连接目的基因与质粒连接质粒与质粒连接目的基因与目的基因连接2)双酶切法双酶切的优点:①

防止质粒重新环化②

防止质粒与目的基因反向连接③

防止目的基因自身环化

选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割根据限制酶的选择原则应选择的限制酶导入植物细胞导入动物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法（常用与双子叶和裸子植物）基因枪法（单子叶植物常用）花粉管通道法1.方法——显微注射法——Ca2+转化法（我国科学家独创，单双都可）三.将目的基因导入受体细胞花粉外源DNA花粉管子房胚珠1)花粉管通道法①用_____________将_________________________直接注入______中；微量注射器含目的基因的DNA溶液子房②

在植物受粉后的一定时间内，剪去______，将____________滴加在___________上，使目的基因借助_____________进入_______；柱头DNA溶液花柱切面花粉管通道胚囊受体细胞：受精卵子房花粉柱头花粉管精子卵细胞胚囊植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。简便经济，但要求花朵较大2)农杆菌转化法（采用最多）①转化：目的基因进入___________内，并且在受体细胞内维持_______和_______的过程。受体细胞稳定表达②农杆菌特点③利用农杆菌进行转化的思路：a.能在自然条件下侵染_____________和___________，而对大多数_____________没有侵染能力；双子叶植物裸子植物单子叶植物b.农杆菌细胞内含有________，当它侵染植物细胞后，能将________上的________（_______________）转移到被侵染的细胞，并且将其_______________________________；Ti质粒Ti质粒T-DNA可转移的DNA整合到该细胞的染色体DNA上

将目的基因插入__________________中，通过农杆菌的_______作用，就可以使目的基因________________。Ti质粒的T-DNA转化进入植物细胞有吸引农杆菌的化学物质。④

农杆菌转化法的过程：T-DNA目的基因构建表达载体含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌含重组Ti质粒的农杆菌导入植物细胞表现出新性状的植物植物细胞将目的基因插入染色体DNA中植物组织培养第一次拼接：将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第一次导入：将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；

提醒：农杆菌转化法中的两次拼接、两次导入两次拼接：两次导入：表现出新性状的植株第二次拼接：指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上(非人工操作)。第二次导入：指含目的基因的T-DNA导入受体细胞(非人工操作)。

构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物过程：为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？①

体积大，易操作。②

全能性高，易培养成完整个体。导入动物细胞3)显微注射法科学家用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内，如腺病毒载体等。病毒侵染法

细胞

处理大肠杆细胞

Ca2+感受态

与感受态细胞混合细胞吸收DNA分子基因表达载体使细胞处于一种能够吸收周围环境中的DNA分子的生理状态。注：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。导入微生物细胞4)Ca2+转化法增加细菌细胞膜的通透性因为没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工。植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法受体细胞转化过程项目种类花粉管通道法或农杆菌转化法显微注射法Ca2＋处理法受精卵或体细胞受精卵原核细胞目的基因插入Ti质粒的T­DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中1.目的检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。2.检测内容及方法类型检测内容方法分子水平的检测个体生物学水平的鉴定受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因目的基因是否转录出了mRNAPCR等技术目的基因是否翻译成蛋白质抗原——抗体杂交技术个体是否具有相应性状抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等四.目的基因的检测与鉴定①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因方法1：PCR扩增转基因生物提取DNADNA作为模板PCR操作M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果DNA半保留复制原理：是否扩增出目的基因以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）电泳操作

引物如何设定？1)分子水平的检测原因：带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因酶切转膜标记的DNA/RNA探针DNA分子杂交（Southern-blot)流程图以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）方法2：

DNA分子杂交技术碱基互补配对原理：1)分子水平的检测②检测目的基因是否转录出了mRNA方法：PCR扩增或分子杂交技术转基因生物提取RNARNA作为模板PCR操作电泳是否扩增出目的基因逆转录cDNA提取RNA转膜标记的DNA/RNA探针RNARNA分子杂交(NorthernBlot)流程图以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）1)分子水平的检测③检测目的基因是否翻译成蛋白质方法：

抗原与抗体的特异性结合原理：苏云金芽孢杆菌提取Bt抗虫蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交转基因生物放射性检测

（杂交带）以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体→是否出现杂交带抗原—抗体杂交技术1)分子水平的检测2)个体生物学水平鉴定没有抗虫基因的棉花植株有抗虫基因的棉花植株棉铃虫没有死亡棉铃虫死亡接种棉铃虫以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）转Bt基因非转基因抗虫鉴定、抗病鉴定、抗逆鉴定等转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒植物抗盐植物抗除草剂植物饲喂害虫害虫死亡病毒感染（病毒接种实验）未出现病斑盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长2)个体生物学水平鉴定第四步：目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序（4个步骤）第一步：目的基因的筛选和获取第二步：基因表达载体的构建第三步：将目的基因导入受体细胞利用PCR获取和扩增人工合成；构建基因文库目的基因、标记基因、启动子、终止子农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物)、Ca2+处理法(微生物)分子检测：是否插入、转录、翻译个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。---核心1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。(1)afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。(2)构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。(3)只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（

）

A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶

B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶

C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则

D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸

3.下列关于PCR技术的叙述，正确的是（）A.该技术应用体内DNA半保留原理，也需要模板、原料、能量、酶等条件B.PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的