单倍体细胞培养、植物原生质体培养

Shoot

and

root

regeneration

in

natureHow

in

vitro?Direct

and

indirectorganogenesisPlant

embryogenesis：zygoteCell

dedifferentiationDirect

and

indirect

embryogenesis愈伤组织分化与植株再生⚫

细胞分化(cell

differentiation):

是指同一来源的细胞逐渐产生出形态结构

、功能特征各不相同的细胞类群的过程，其结果是在空间上细胞产生差异，在

时间上同一细胞与其从前的状态有所不同。➢

细胞分化的本质:

基因组在时间和空间上的选择性表达，通过不同基因表达的

开启或关闭，最终产生标志性蛋白质。一般情况下，细胞分化过程是不可逆的⚫

细胞再分化(cell

redifferentiation

):

已经去分化形成的胚性细胞在某些刺激条

件下，重新启动开始分化发育的过程。植物形态发生(Plant

morphogenesis):

植物外部形状和内部结构的起源、发育和建成的过程⚫

器官发生(organogenesis):指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不

定芽/根(adventitious

shoots/roots）等器官的过程

(包括直接和间接器官发生）间接器官发生在适合的条件下，愈伤组织细胞(第一阶段：形成愈伤组织)会发生生理代谢上的改

变，促使细胞分裂部位和方向改变，首先出现分生细胞，经细胞分裂逐渐形成分生

细胞团和分生组织(第二阶段：形成分生中心)，进一步再分化形成维管结节直至分

化成芽和根等器官(第三阶段：器官原基及器官形成)。⚫

单极分化：愈伤组织中的分生中心在刺激物质的影响下向着一极分化，形成有根

无芽或有芽无根的现象。⚫

双极分化：愈伤组织中随着细胞分裂出现两个或两个以上分生中心，分化成芽和

根，根芽之间并无输导等组织沟通。⚫

先芽后根：愈伤组织中产生多个分生细胞形成分生中心，从中仅分化出芽，待芽

长到一定大小时在其基部可分化出根。⚫

先根后芽：有些植物外植体脱分化后在愈伤组织上先分化出根，而后在靠近愈伤

组织的根部上再分化出芽。In

vitro

regeneration

of

Ledebouria

revoluta

through

callus

mediated

indirect

shoot-organogenic

pathway.

(A)

Root

explants

derived

callus.

(B)

Leaf

derived

callus.

(C)

Bulb

scale

derived

callus.

(D)

Shoot

induced

from

the

surface

of

the

callus.

(E)

Maturation

of

unipolar

shoots

(or

bulblets).

(F)

Root

induction

of

in

vitro

derived

shoots.

(G)

Tissue

culture

derived

ex

vitro

plantsJ

Genetic

Engin

Biotech,

2018,

16:

645-651影响器官发生的关键因素⚫

激素及其配比:

高浓度的生长素和低浓度的分裂素可以促使细胞连续繁殖—

—无组织的生长。相反，高浓度的分裂素能引起茎-芽(shoot-bud)形成。◼

基本的规律：生长素促进根分化，分裂素促进芽分化(BAP是最有效)。⚫

光照：很多光照条件下，一些植物均能进行器官发生，说明光周期并不是非常

重要的因子，可有的植物在光、暗交替条件下才能形成芽，而在连续光照下则

不能。尽管如此，多数植物需要一个稳定的光周期，多数培养条件是14-16h光

照，8-10h黑暗。光质对于某些植物可能也很重要。⚫

温度：不同植物不一样，需要摸索，如烟草和棉花就不一样。Cell

dedifferentiation⚫

体细胞胚胎发生(Somatic

embryogenesis):离体培养下没有经过授精过程，但经过

了胚胎发育过程所形成的再生植物体细胞胚胎发生胚胎发生的细胞学观察Histological

sections

of

calluses

with

embryogenic

structures

cultured

on

medium

supplemented

with

9.0

μM

2,4-D

after

8

months

of

culture.

Arrows

indicate

a

pro-embryo

(A),

globular

(B),

early-

heart

shaped

(C),

heart-shaped

(D),

torpedo-like

(E),

and

cotyledonary

somatic

embryos

(F).Front

Plant

Sci,

2018,

9:

1769➢

直接胚胎发生(Direct

embryogenesis):

从培养中的器官、组织、细胞或原生质体直接分化成胚(胚状体)。如下胚轴、子叶、茎表皮等外植体细胞脱分化后，由表皮细胞经不等分裂，产生一个胚细胞和一个胚柄细胞，后者发育类似胚柄,前者进一步分裂，由原胚发育为成熟胚。在悬浮培养液中有各种类型的细胞，其中有一种细胞具有深厚的细胞质，液泡相对较小，保持旺盛的分裂能力，经多次分裂产生的多细胞间仍保持着联结，形成称为“胚性细胞团”的聚集团块Somatic

embryo

formation

from

the

hypocotyl

of

somatic

embryosPlant

Biotechnol

Rep

(2007)

1:5

–9➢

间接胚胎发生(Indirect

embryogenesis):

外植体先愈伤化，再由愈伤组织细胞分

化成胚。在愈伤组织中，可能出现液泡小、细胞质浓的小细胞，这种小细胞聚集

成EC，其表面是高度分生组织化的细胞团。一个EC表面可产生大量的胚状体。在

原培养基中，EC表面的胚状体不能进一步发育，但EC中心的细胞分裂和分离会促

使EC崩溃。崩溃后分生性的表面细胞结合成群，又形成新的EC。EC在转入合适的

培养基中才能完成胚状体的发育，以类似合子胚的分裂方式发育至成熟胚状体:

植物组织培养中起源于非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程形

成的胚状结构。这一定义有以下几方面的界定：➢

胚状体是组织培养的产物，只限于组织培养范围使用，区别于无融合生殖的胚；

➢

胚状体起源于非合子细胞，区别于合子胚➢

胚状体的形成经历胚胎发育的过程，区别于组织培养中分化的芽体。胚状体可按其来源分为两大类：⚫

体细胞胚：由普通植物体（孢子体）的各种器官等双倍体的体细胞产生的胚状体

⚫

花粉胚:由小孢子或其分裂产物等单倍体细胞产生的胚状体，通常称为花粉胚，可发育成单倍体植株。以上两种胚状体的特点：➢

第一：两极性，即在其发生的最早阶段就具有根端（胚根）和茎端（胚芽）；

➢

第二：它与母体植物或外植体的维管组织无解剖结构上的联系。体细胞胚胎发生途径的优势：➢

数量多。在细胞、愈伤组织和器官的培养中，一个培养物上诱导胚状体的数量，

往往比诱导芽的数量要多得多。➢

结构完整(胚状体具有两极性)。胚状体一旦形成即可长成为小植株，成苗率高。➢

发生过程中的相关材料是研究胚发育的良好材料体系。用于人工种子研究与生

产，可节约大量种子，且可固定杂种优势。体细胞胚胎发生与器官发生总结体细胞胚胎发生途径器官发生途径细胞内出现方向相反的两极分化，具有根

端和芽端两个分生中心单向极性，单个分生中心不定胚维管组织与外植体维管组织不相连不定芽和不定根与愈伤组织的维管相连具有典型的胚胎形态发生过程无胚胎形态，分生中心直接分化为器官形成的幼苗具有子叶不定芽的苗无子叶胚状体发育的苗，根和芽齐全先长芽后长根，或先长根后长芽影响胚状体发生和发育的因素⚫

基因型、培养基与激素：脱分化与再分化：第一阶段包括外植体细胞的脱分

化、愈伤组织的诱导、胚性细胞或细胞团的形成，所用的培养基必须含有生

长素类物质，主要是2,4-D；第二阶段包括胚状体的形成和发育，必须降低2

，4-D浓度或完全去除2,4-D;

还有其他激素.培养个体的遗传基础决定了离体

培养的反应能力。培养基的部分成分：如不同的无机N；

以及逆境胁迫NH4NO3对不同品种胚分化的影响KNO3

对胚分化的作用氯化钾对棉花愈伤组织质地和胚分化的影响KCl

(mg/L)愈伤组织质地愈伤颜色胚分化率0疏松颗粒状淡黄色14.5±3.6500疏松颗粒状淡黄色28.5±4.51000疏松颗粒状黄色35.0±5.91500块状黄褐色6.5±2.5不同棉花品种（系）的愈伤组织增殖及分化能力比较试管苗的移栽与护理⚫

试管苗与自然苗的生理区别➢

试管苗的角质层（蜡质层）发育很差，光合作用差，移栽时易失水。➢

根吸收很弱，功能差。➢

自然条件下，植物与真菌、细菌存在一种共生关系，试管苗缺乏这种关系。

⚫

试管苗移栽时应注意如下问题：➢

防止被病菌感染：琼脂要冲洗干净，最好用无菌土➢

为防止根受伤，可以用过筛的细土，最好是富含有机质、疏松的合成的基质。

➢

为了保证移栽时顺利成活，幼苗应先在低盐培养基上生根（1/2MS或knop营养液）后，再移栽。➢

有时移栽后在低温处理一段时间以打破休眠（主要用于灌木、树种等）➢

应该采取保持湿度的措施➢

可以用嫁接的方式移栽试管苗A

BCDEFG

H

I

J花药培养:

是植物雄性生殖器

官-花药为其外植体离体培养

技术，就培养方法和技术来

讲，属于器官培养的范畴。单倍体细胞培养单倍体(haploid)：体细胞染色体组数等于本物种配子染色体组数的个体或细胞包括一倍单倍体(monohaploid)和多倍单倍体(polyhaploid)单倍体的来源⚫

Wide

crossing:

种间和属间杂交(Interspecific

cross)。结合胚挽救技

术获得单倍体。Chinese

cabbageRed

cabbageScientia

Horticulturae

250

(2019)

33

–37⚫

孤雌/雄生殖(partheno/patro-genesis),

或物理照射和化学诱变(Irradiation

and

–

chemical

treatment

or

Pollen

treatment)。

花粉用射线照射后失去了受精能力

，与母株授粉，卵细胞在花粉的刺激作用下进行孤雌发育，从而产生单倍体。这

方面的例子可在烟草、小麦、金鱼草中发现。蜜蜂发育与分工Pollination

of

female

flowers

with

irradiated

male

flowersSci

World

J

2013:

529502.⚫

双生苗的筛选(selection

of

twins).

有些植物可产生多胚种子，即两个或多个胚被

共同的种皮包裹着，这些种子可产生单倍体-单倍体、二倍体-二倍体和单倍体-二

倍体植株。在Capiscum中，双生苗的频率受母本基因型控制。通过筛选可以提高

双生苗的频率。Classification

based

on

the

phenotype

of

twin-embryo

kernelsBMC

Plant

Biology

18:

313

(2018)⚫

小孢子/花培(Microspore/Anther

and

Pollen

Culture)：最广泛应用的方法。

Haploids

develop

directly

from

pollen

grains

in

culture,

either

through

direct

formation

of

embryos

from

pollen

grains

or

formation

of

callus

and

subsequent

plant

regeneration.⚫

Ovule/ovary

culture⚫

Inducer

linesTrends

in

Genetics,

2019Genes/QTL

and

their

function

with

regard

to

haploid

induction

and

doublingPlant

Biotechnology

Journal

(2017)

15,

pp.

1361

–1370单倍体培养途径总结Current

Biology

27,

R1089

–R1107,

2017n2n单倍体培养的意义(应用价值)

⚫

缩短育种年限,提高选择效率花粉单倍体是纯和配子体，选择某一基因型的概率是(1/2)

，常规杂交选

择同一基因型的概率(1/2)

,

两者之间相差2n倍Traditional

breedingDouble

haploid

breedingJournal

of

Natural

Sciences

Research,

2017,

7:

10-20⚫

排除杂种优势对后代选择的干扰⚫

遗传研究的良好实验材料体系(如创造永久作图群体)

、高应用价值的材料⚫

突变体的筛选⚫

消除致死基因⚫

选育新型自交系⚫

遗传转化的受体材料⚫

克服远缘杂交后代不育Anther/microspore

culture任何时期的花药/小孢子都适合单倍体培养？要选择何种时期的？MicrogametogenesisMicrosporogenesis双子叶植物花粉发育Pollination

and

fertilizationPlant

Physiol.

2009;149:694-707活体或离体花粉/小孢子发育如何花药培养？影响花药成功培养的因素？基本过程：选择花蕾—花蕾预处理—消毒—剥取花药—诱导培养—分化培养花药预处理胁迫处理的目的：提高并诱导孤雄生殖(induce

androgenesis)抑制体细胞(anther

wall

and

tapetum)的愈伤诱导。胁迫处理类型：cold,

heat,

osmotic

stress,

sugar

starvation,

gamma

irradiation,and

chemical

treatment

(Ethrel

and

ethephon))Rice

Science,

23:

57-68,

2016Growth

chart

of

callus

formation

from

anther

culture

in

balsam

pearEffect

of

pretreatments

on

callus

induction

from

anthers

in

balsam

pear.35℃

6h2000rpm

12h4℃

24hJournal

of

Medicinal

Plants

Research

，6

：3393-3395，2012Effect

of

cold

pretreatment

time

on

callus

induction

from

anthers

in

balsam

pear.Effect

of

anther

pretreatment

on

embryo/callus

induction

and

plant

development/100

anthers)

in

three

barley

cultivarsJ

Med

Plants

Res

，6：3393-3395，2012

J.

Appl.

Genet.

43

：

287-296，2002花粉/小孢子培养花蕾的选择？花粉/小孢子释放？花粉小孢子培养？⚫花粉发育时期对成胚至关重要油菜花蕾、花药长度与小孢子发育时期和培养效果的关系一般认为，甘蓝型油菜的单倍体培养常采用单核晚期至二核早期不同植物诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期发育时期物种减数分裂期草莓、番茄四分孢子期葡萄单核早中期石刁柏、大麦、马铃薯单核晚期荔枝、茄子、小麦、大白菜单核早期至晚期烟草、萝卜单核早期至双核期梨、水稻、甘蔗、甜瓜四分孢子期至双核期玉米花粉/小孢子分离方法1.自然释放法，无菌花药在液体或固体培养基上自然开裂。在油菜和禾本科

植物有应用，但效率低。2.研磨过滤收集法，无菌研磨器中研磨花蕾或花药，释放花粉/小孢子，过

筛并纯化花粉/小孢子

。常用于油菜和茄科作物。3.剖裂释放法，借助工具剖裂药壁，使花粉释放出来。在药草中有应用花粉/小孢子培养方式⚫

平板培养(Plateculture)，是指将琼脂或明胶等凝胶状固体培养基制成平

面状，然后在此平面上接种花粉或小孢子。⚫

液体培养(Liquid

culture)，是指将花粉或小孢子直接接种于液体培养基中,

并不断振荡或搅拌，使其均匀地在液体培养基中生长繁殖的一种培养方法⚫

双层培养(double

layer

culture)，是指将花粉或小孢子直接接种于固体-

液体双层培养基中培养。⚫

看护培养(nurseculture)⚫

微室培养法(micro-chamber

culture)：取一滴载有花粉的液体培养基，滴于盖

玻片上，然后翻转盖玻片使液体培养基悬挂在盖玻片下，再置于一凹形载玻片上

，最后用石蜡密封盖玻片四周。⚫

条件培养基(conditioned

medium)：将培养过花药的培养基去掉花药并离心收集

上清液；或者花药经沸水杀死细胞后碾碎、离心收集上清液；两种上清液(含有

促进花粉发育的物质)都可以加入培养基中，用于花粉/小孢子培养。6⚫影响花药/小孢子培养的关键因素

基因型Mean

number

of

embryos

per

Petri

dish

in

different

induction

media

for

responsive

genotypes不同Brassica

napus基因型的小孢子产胚率GenotypeEmbryoid/10

microsporeSeedling

(%)Topas10000-2000001-20Westar1000-100000.1-1Delta100-100000.01-1Bounty10-1000.001-0.01Acta

Physiol

Plant

(2016)

38:74⚫

供体植株的生理状态和环境条件(Physiological

status

of

donor

plant)光周期、光照强度、温度等对以后的花粉离体培养有很大影响。一般田间比温室，

幼龄比老龄植株易于培养。主茎易于侧(次)分枝Plantlet

regeneration

throughout

the

year

in

barleyM.S.:

Main

Shoot;

T1:

Tiller

no.

1;

T2:

Tiller

no.

2;

T3:

Tiller

no.

3;

T4:

Tiller

no.

4.Plant

Cell

Rep

(2006)

25:

375

–381⚫

Culture

ConditionEffects

of

temperature

treatment

and

bud

size

on

microspore

embryogenesis

in

cabbageScientia

Horticulturae

233

(2018)

178

–187花药/小孢子培养中常存在的问题

⚫

Higher

frequency

of

albino

plants:

由于质体和/或核DNA降解Anther

culture

response

of

six

barley

cultivarsCultivasTypePlated

anthersResponding

anthers

(%)RP/100RAG/AG/100RAIgriWinter50049.3108.77.295.4CorkSpring50045.8109.20.033.2DouchkaSpring50047.645.40.052.2MadrasSpring50036.439.60.041.5PrismaSpring50021.346.90.14.3ScarletSpring50031.937.10.031.1RP/100RA

–

regenerated

plantlets/100

responding

anthers;

G/A

–

Green/Albinos

ratioPlant

Cell

,Tissue

and

Organ

Culture

76:

35

–

43,

2004(A–D)

Plastid

features

in

microspore

derived

embryos

and

androgenetic

plantlets

in

the

winter

cv.

Igri.

(A)

Cell

global

view

showing

the

general

morphology

of

plastids

(P)

including

a

dividing

plastid

(arrowheads).

S

–

starch;V

–

vacuole.

6000.

(B)

Higher

magnification

showing

the

initiation

of

thylakoid

formation

(arrowheads)

in

the

stroma.

S

–

starch.

32000.

(C)

Immunolocalization

of

DNA

in

plastid

stroma

(arrowhead).

S

–

starch.

43000.

(D)

Typical

chloroplast

in

a

green

microspore

derived

plantlet

showing

organized

thylakoids

(arrowheads),

grana

(G)

and

a

small

starch

grain

(S).V

–

vacuole;

W

–

cell

wall.

21000.Plant

Cell

,Tissue

and

Organ

Culture

76:

35

–

43,

2004产生的因素内因：基因型和花粉发育时期的影响最为明显；外因：如高温、高浓度2,4-D、延迟再分化培养时间等均可促进白化苗产生。解决办法：⚫

Temperature

and

Light

Intensity，适当提高温度，对于光照强度(有的认为

增加有用，有的则反之)；⚫

Media

Composition

Including

Plant

Growth

Regulators

，改变碳源，如用

Glucose/Mannitol替换，使用生长素(2,4-D/IAA)配细胞分裂素(BA)等；⚫

花药/花粉来源：尽可能取主分枝上的小花；⚫

尽早再分化，⚫小孢子培养的优越性排除了药壁、药隔、花丝等体细胞组织的干扰，获得的再生植株都是来源于单倍体的小孢子；⚫花药培养中，有时会因花药中的某些物质而影响小孢子的启动分裂，而小孢子培养则不存在这种问题；⚫小孢子培养中，由于小孢子是游离的单倍体细胞，除不受等位基因影响外，能均匀地接触外部环境条件(如化学、物理诱变)，因此是研究转

化和诱变的理想材料；⚫便于系统观察小孢子在离体条件下的生长发育过程，是研究发育极好的材料体系：⚫小孢子培养从每个花药中能获得更多的再生植株，花药和小孢子培养差异类别AntherMicrospore发展历史1964年首次成功1973年首次成功成功培养案例数>120物种>18物种组培角度分类器官培养细胞培养外植体花药小孢子预处理需要不需要小花(花蕾)标准单核早期-单核晚期单核晚期-双核早期培养基状态固体液体操作培养程序简单复杂精细培养途径愈伤组织或直接成胚胚状体单倍体纯度不能排除母体组织的影响

可为单、双活非整倍体排除母体组织的影响，纯

度高的单倍体群体胚胎学、遗传学机理研究及诱变筛选情况因细胞组织的干扰，研究不方便因单细胞离散性好、群体数量大，研究方便单倍体产量及稳定性低且不稳定较高且较稳定单倍体植株：一般植株矮小，生长瘦弱，高度不育。对单倍体进行加倍处理，

使其成为双单倍体，是稳定其遗传行为和为育种服务的必要措施(a)

Tetraploid;

(b)

Triploid;

(c)

Diploid;

(d)

Haploid.Front

Plant

Sci

2015;

6:

1118.Haploid

branchDiploid

branch.Front

Plant

Sci

2015;

6:

1118.单倍体植株的加倍处理⚫自然加倍⚫人工加倍：化学药剂处理(有丝分裂抑制剂）➢

有毒化学药剂秋水仙素(colchicine)(微管解聚剂)，能与微管蛋白亚基结合

并组装到微管末端，阻止新的微管蛋白二聚体继续在此末端添加，但微

管在另一端的去组装不受影响，从而导致微管解聚。长春花碱（

catharanthus

alkaloid

）和诺可脞（nocodazole）具有类似的作用。✓

过滤灭菌的秋水仙素溶液处理花粉/再生植株✓

秋水仙素处理上部叶片的顶芽/腋芽✓

添加到培养基中培养花药/花粉。➢

无毒化学药剂氟乐灵和氨磺乐灵单倍体/双单倍体的鉴定⚫

染色体直接计数法。取茎尖、根尖等分生组织区压片，计数染色体数目。⚫

间接鉴定法➢

流式细胞仪确定细胞DNA含量➢

细胞形态学鉴定。叶片保卫细胞大小、单位面积气孔数及保卫细

胞中叶绿体的大小和数目与倍性高度相关➢

植株形态学鉴定。单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花

粉粒小，不结实➢

杂交鉴定法，自交或测交，看后代分离情况。➢

分子标记鉴定，包括生化标记(同工酶标记)或分子标记Determination

of

ploidy

using

flow

cytometry.

a

diploid

or

doubled

haploid

plantlets,

b

haploid

plantlets植物原生质体培养原生质体(Protoplast):

指采用机械或酶解法去掉细胞壁的裸露细胞原生质体的应用基础理论研究⚫

细胞生理与发育：可以用于细胞壁的再生、膜结构、细胞膜的离子转运、细

胞器的动态表现、光合作用、呼吸作用和物质的跨膜运输、气孔开关等、⚫

基因表达调控研究：BiFC,

基因亚细胞定位等。应用科学研究⚫

种质资源保存⚫

体细胞杂交：原生质体融合，克服生殖障碍，创造新种质⚫

筛选无性系变异和突变体⚫

遗传转化➢

同一组织可产生大量遗传上基本一致的原生质体

➢

如具再生能力，易获得转化植株➢

易摄取外源遗传物质➢

转化后固体包埋培养，可避免嵌合体产生原生质体分离与纯化原生质体分离的最基本原则：保证原生质体不受伤害及不损害其再生能力

分离方法⚫

机械法分离：1892年Klercker建立，将细胞高渗糖溶液中，使细胞质壁分离，

再用刀片切割细胞壁,使原生质体释放出来。缺点：产量极低；应用的材料受限制；操作极费力植物细胞壁➢

胞间层:

又称中胶层，位于两个相邻细胞之间，主要成分为果胶质。➢

初生壁:

位于胞间层内侧。主要成分为纤维素、半纤维素。➢

次生壁:

位于质膜和初生壁之间。主要成分为纤维素，并常有木质存在。⚫

酶法分离：1960年

Cocking最早获得纤维素酶的提取方法并分离原生质体；1968

年开始商用纤维素酶和离析酶。1971年Takebe利用“二步法”成功分离烟草叶肉细

胞原生质体；1968年Power和Cocking利用“一步法”成功分离原生质体。

酶法优点：可在短时间内获得大量原生质体缺点：不纯的酶制剂所含杂质对原生质体可能有不同程度的毒害作用一步和二步法分离原生质体影响酶法分离原生质体的因素理论上：任何活组织都可分离得到原生质体。实际上：要得到活性高、能进行分裂

、能形成愈伤组织、最后再生完整植株的的原生质体则受许多因素影响。原生质体分离：考虑取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透压、酶解时间、温度等suspension

culture

embryogenesis

calli

leaf⚫

外植体:生长旺盛、生命力强的组织和细胞是获得高活力原生质体的关键，并

影响着原生质体的复壁、分裂、愈伤组织形成乃至植株再生常用外植体：刚展开的幼嫩叶片叶肉细胞、愈伤组织、悬浮细胞(需每隔3-5天

继代一次，培养一段时间使细胞处于旺盛生长状态)酶制剂:

纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和离析酶等，酶解花粉母细胞和四分体小

孢子时还要加入蜗牛酶。常用的酶制剂：纤维素酶：Cellulase

Onozuka

R-10

（Kinki

Yakult

Manuf.

Co.

Ltd.,

Nishinomiya,

日本），

Cellulase

Onozuka

RS

（Kinki

Yakult

Manuf.

Co.

Ltd.,

Nishinomiya,

日本），Cellulase（Sigma），Driselase

（Kyowa

Hakko

Kogyo

Co.，日本）。果胶酶：Pectolyase

Y23

（Kikkoman

Shoyu

Co.,

Lte.

Nishinomiya

，日本），Macerozyme

（Yakult

Biochemicles

Co.，日本），Pectinase（Serva）等。半纤维素酶：Rhozyme

Hp-150

（Rohm

and

Haas

Co.

inde.

美国宾西法尼亚州）。

大多数植物分离原生质体时，纤维素酶浓度在1%-3%，果胶酶在0.1%-1%。...⚫

渗透压：原生质体操作需要在一定渗透压存在下