分子生物学的酶学基础

分子生物学的酶学基础概述核酸酶第一节限制性内切酶第二节

甲基化酶第三节

DNA聚合酶第四节

其它酶图4-1基因工程概略

基因组DNA目的基因目的基因基因载体重组体(复制子)基因重组核酸核酸水解酶类核酸合成酶类核酸修饰酶类核酸内切酶核酸外切酶DNA聚合酶RNA聚合酶DNA连接酶甲基化酶核苷酸激酶核苷酸转移酶磷酸酶基因工程中的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等表4－1核酸酶（nuclease）

定义：通过切割相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶。分类据酶切方式分为：核酸外切酶、核酸内切酶据底物不同分为：DNA酶和RNA酶

核酸酶

核酸外切酶：编号为EC3.1,11-16

从核酸分子的末端开始，一个核苷酸一个核苷酸的消化降解多核苷酸链。核酸外切酶是非特异性的磷酸二酯键的酶，如蛇毒磷酸二酯酶是从DNA或RNA的游离3ˊ-羟基端开始，逐个水解下5ˊ-核苷酸，牛脾磷酸二酯酶则相反，从游离5ˊ-羟基端开始，逐个水解下3ˊ-核苷酸。核酸酶

核酸内切酶：编号为EC3.1,21-31

核酸内切酶特异地切割断裂多核苷酸内部磷酸二酯键，它们是特异性强的磷酸二酯酶.

如：牛胰核酸酶作用于嘧啶核苷酸的磷酸二酯键生成嘧啶核苷-3ˊ-磷酸或末端为嘧啶核苷-3ˊ-磷酸的寡核苷酸。如RnaseA也叫牛胰核糖核酸酶具有一定的专一性。

RnaseT（从米曲霉制备得到的酶）：专一性切开，鸟苷酸3-P与相邻核苷酸之间的磷酸二酯键。产物是3ˊ-鸟苷酸和末端带有3ˊ-鸟苷酸低聚核苷酸。5’5’GCAATGCTTAGCCATCGTTACGAATCGGTA核酸外切酶核酸内切酶核酸外切酶第一节限制性内切酶一、限制与修饰二、限制酶识别的序列

三、限制酶产生的末端四、DNA末端长度对限制酶切割的影响

五、位点偏爱六、酶切反应条件七、星星活性八、单链DNA的切割九、酶切位点的引入十、影响酶活性的因素

十一、酶切位点在基因组中分布的不均一性一、限制与修饰

（Restrictionandmodification）

1．限制与修饰现象

20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染，如EcoliK株的噬菌体只能感染EcoliK株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“限制现象”。到上世纪50年代初，有许多学者发现了限制与修饰现象，当时称作寄主控制的专一性（hostcontrolledspecificity）。

一、限制与修饰

1．限制与修饰现象

甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤A成为N6甲基-腺膘呤，胞嘧啶C成为5‘甲基胞嘧啶。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的，维护宿主遗传稳定的保护机制。

噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题。

在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。

EcoliK株噬菌体

EcoliK株其他Ecoli菌株图4－2限制现象E.coli菌株

噬菌体感染率

K

B

CE.coliK110-410-4E.coliB10-4110-4E.coliC111

一、限制与修饰

1．限制与修饰现象

如表4-2，说明K和B菌株中存在一种限制系统，可排除外来的DNA。10-4

的存活率是由宿主修饰系统作用的结果，此时限制系统还未起作用。而在C菌株不能限制来自K和B菌株的DNA。表4-2

噬菌体在不同宿主菌的转化率一、限制与修饰1．限制与修饰现象

由两种酶来控制核酸限制性内切酶：降解进入细胞的外源含有其识别的特定位点的核酸。修饰的甲基化酶：对内源含同样序列的核酸进行甲基化，使限制性内切酶是无法作用的一、限制与修饰

1．限制与修饰现象

核酸限制性内切酶

定义：能识别并水解外源双链DNA的核酸内切酶，能识别DNA双链上的特定位点，按对称顺序将两条链切断，称为限制性内切酶，也称限制酶。作用特点：①专一性很强；②对底物DNA有特异的识别位点，这些位点的长度一般在4-8碱基对范围，底物通常具有回文结构，切割后形成粘性末端或平末端。限制性内切酶

能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称为限制性核酸内切酶。切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。5’5’GCAAGCTTTAGCCATCGTTCGAAATCGGTA限制性核酸内切酶一、限制与修饰

（Restrictionandmodification）

1．限制与修饰现象

限制性内切酶和它的“搭档”--甲基化酶一起就构成了寄主控制的限制与修饰现象，即限制-修饰（R-M）系统，该系统类似于免疫体系。在一些R-M系统中，限制性内切酶和修饰酶是两种不同的蛋白，它们各自独立行使自己的功能。而在另一些系统中，两种功能由同一种限制-修饰酶的不同亚基，或是同一亚基的不同结构域来执行。

一、限制与修饰

2．限制酶的发现

20世纪60年代，人们就注意到DNA在感染宿主后会被降解的现象，从而提出限制性切酶和限制酶的概念。其中W．Arber于1962年提出一个假设来解释上述现象。他认为这是细菌中有2种以上功能不同的酶，一种是核酸内切酶，能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称为限制性核酸内切酶。

1968年，首次从E.coliK中分离到限制酶，它有特定的识别位点但没有特定的切割位点，其中切割位点离识别位点达1000bp以上。

一、限制与修饰

2．限制酶的发现

1970年，美国约翰·霍布金斯大学的H.Smith于偶然中发现，流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）能迅速降解外源的噬菌体DNA，其细胞提取液可降解E.coliDNA，但不能降解自身DNA，从而找到HindⅡ限制性内切酶。

HindⅡ限制性内切酶位点和切割位点如下：

5'…GTPy↓PuAC…3'

3'…CAPu↑PyTG…5'

一、限制与修饰

2．限制酶的发现

从此以后，发现的限制酶越来越多，并且许多已经在实践中得到应用。

EcoRⅠ是应用最广泛的限制性内切酶，酶切位点和切割位点如下：

5'G↓AATTC3'

3'CTTAA↑G5'

一、限制与修饰

3．限制酶的命名

限制性内切酶的命名遵循一定的原则，主要依据来源来定，涉及宿主的种名、菌株号或生物型现采用的是Smith和Athens提议的方案。

一、限制与修饰

3．限制酶的命名

命名时，名称的第个1字母来源于宿主菌属名的第1个字母，大写；第2，3二个字母来源于宿主菌种名的头2个字母，小写如果来源菌还有株系，则有第4个字母；最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同限制酶的编号，即发现的先后顺序。前三个字母用斜体表示，后面字母用正体。

一、限制与修饰

3．限制酶的命名

如HindⅢ限制性内切酶代表从流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzac)d株中分离到的第3个限制酶，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来自菌株Rd，Ⅲ表示序号。以前在限制性内切酶和修饰酶前加R或M，且菌株号和序号小写，但现在限制性内切酶名称中的R省略不写。

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子等因素，限制与修饰系统一般划分为I，Ⅱ，Ⅲ三大类。然而，蛋白测序的结果表明，限制性内切酶的变化多种多样，若从分子水平上分类，则应当远远不止这三种。

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅰ型（typeⅠ）限制与修饰系统

是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多亚基双功能蛋白复合体，对DNA的甲基化和切割由同一种酶来完成。它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链。以前人们认为I型限制性内切酶很稀有，但现在通过对基因组测序的结果发现这一类酶其实很常见。从蛋白的角度来看，该系统的种类很少，只占1%。

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅰ型（typeⅠ）限制与修饰系统

该系统由3种亚基S、M、R组成：①S亚基为识别亚基，可以识别夹着一定任意碱基对长度两边的特定序列。②M亚基具有甲基化酶活性，需甲基由S-腺苷蛋氨酸（SAM）提供。③R亚基具有限制酶活性，可在远离识别位点1kb以上处随机进行切割。

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅰ型（typeⅠ）限制与修饰系统如EcoK和EcoB。其限制酶和甲基化酶（即R亚基和M亚基）各作为一个亚基存在于酶分子中，另外还有负责识别DNA序列的S亚基，分别由hsdR、hsdM和hsdS基因编码，属于同一操纵子（转录单位）。

EcoK编码基因的结构为R2M2S，

EcoB编码基因的结构为R2M4S2

。

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅰ型（typeⅠ）限制与修饰系统

EcoB酶的识别序列为

TGA*（N）8TGCT，即识别一端为TGA，另一端为TGCT，中间夹着8个任意碱基的序列；其中两条链中的A为甲基化位点，N表示任意碱基。

EcoK酶的识别序列为

AA°C（N）6GTGC，其中两条链中的A为可能的甲基化位点。

但是

EcoB酶和

EcoK酶的切割位点在识别位点1000bp以外，且无特异性

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅰ型（typeⅠ）限制与修饰系统

如DNA两条链都已甲基化，类型I酶不对其进行切割如只有一条链甲基化，则类型I酶使另一条链甲基化如两条链都未甲基化，则发生随机切割作用，使

DNA变成短的碎片。

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅰ型（typeⅠ）限制与修饰系统

I型酶在生化研究中很有意义，其可以识别DNA序列中特定的核苷酸序列，但它的切割作用是在离识别特异性位点至少1000bp的地方随机发生的，产生不确定的限制片段和不明确的跑胶条带，因而不具备实用性，在基因克隆中没有什么实用价值。

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅱ型（typeⅡ）限制与修饰系统限制与修饰系统所占的比例最大，达93%。

II型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组成，因而任意一种限制性内切酶的氨基酸序列可能与另一种限制性内切酶的氨基酸序列截然不同。实际上，从已知的情况上看，这些酶很可能是在进化过程中各自独立产生的，而非来源于同一个祖先。

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅱ型（typeⅡ）限制与修饰系统

基本特性1、一般性状最适pH为6～8；

NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巯基有保护作用，对热不稳定，通常是溶于含有50％甘油的缓冲液中贮存于–20℃环境下，取出使用时必须立即置于冰浴中。

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅱ型（typeⅡ）限制与修饰系统

II型限制性内切酶的基本特性2、识别序列

多数限制酶的识别序列为回文对称序列（上海自来水来自海上），通常的识别序列是4bp～6bp，有些则为7bp～8bp，甚或多于8bp，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列。切割位置因酶而异，有些是隔开的；常在识别序列内或其附近水解DNA链中的磷酸二酯键，产生带3‘-羟基和5’-磷酸基团的DNA产物。

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅱ型（typeⅡ）限制与修饰系统

基本特性2、识别序列识别位点有些是连续的：EcoRIG↓AATTC。有些是不连续的：SatIGC↓NGC

识别位点的共同特征是具有回文结构，即双重螺旋对称的结构形式

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅱ型（typeⅡ）限制与修饰系统2、识别序列

和类型I酶相同，类型II酶只对2条链都没有甲基化的DNA进行切割，对1条链甲基化的使另一条链甲基化，

2条链都甲基化的不发生作用。

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅱ型（typeⅡ）限制与修饰系统基本特性3、酶切切口

有些酶在识别序列内的对称轴上切割，其切割产物具平头末端；

SmaICCC↓GGGGGG↑CCC

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅱ型（typeⅡ）限制与修饰系统基本特性3、酶切切口

很多限制酶不能精确地在2个对称轴部位切割，而在识别序列2条链对应位上错位切割，切割产物有些形成5’-突出的粘性末端,另一些为3’-突出的粘性末端。

EcoRI位点G↓AATTCCTTAA↑G

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅱ型（typeⅡ）限制与修饰系统基本特性（4）限制片断末端的连接作用分为：分子间连接和分子内连接许多种限制酶切割DNA分子形成的短片断能够自发的重新环化起来，环化分子加热后又会重新线性化。但是，如果马上使用连接酶处理，使他们的3-OH基团和5-P基团之间封闭起来，环化就是永久的了。酶切形成的粘性末端任何一侧都能和另一末端互补配对，使任何含有该识别序列的DNA分子都能和另一个含相同识别序列的DNA分子容易地连接成新的重组分子（4）限制片断末端的连接作用5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAAppAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAAppAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’（4）限制片断末端的连接作用

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅱ型（typeⅡ）限制与修饰系统

该系统可以分为三种第一种，在识别序列中进行切割的酶

最普遍的是象HhaI、HindIII和NotI，这一类酶是构成商业化酶的主要部分。这些酶一般都比较小，亚基一般都在200-300个氨基酸左右，大部分都以同源二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列。

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅱ型（typeⅡ）限制与修饰系统

该系统可以分为三种第一种，在识别序列中进行切割的酶但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的序列（如EcoRI识别GAATTC）；而另一些识别不连续的序列（如BglI识别GCCNNNNNGGC）。限制性内切酶的切割后产生一个3’羟基端和一个5’磷酸基团。它们的活性要求镁离子，而相应的修饰酶则需要S-甲硫氨酸腺苷（SAM）的存在。

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅱ型（typeⅡ）限制与修饰系统

第二种，IIs型（移动切割限制酶）

比较常见，占5%，具有辅因子要求，比如FokI和AlwI。这些酶的大小居中，约为400-650个氨基酸左右，有一个结合识别位点的域和一个专门切割DNA的功能域。一般认为这些酶主要以单体的形式结合到DNA上，但与临近的酶结合成二聚体，协同切开DNA链。

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅱ型（typeⅡ）限制与修饰系统第二种，IIs型（移动切割限制酶）其识别位点是连续的非对称序列，长度为4-7bp，在识别位点之外切开DNA，切割位点可能在识别位点一侧的20bp范围内。

因此一些IIS型的酶在切割有多个识别位点的DNA分子时，活性可能更高。

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅱ型（typeⅡ）限制与修饰系统第二种，IIs型（移动切割限制酶）

1）具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有对称结构，即其识别位点是连续的非对称序列，长度为4-7bp。

2）酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点的一侧，1--20bp。因此一些IIS型的酶在切割有多个识别位点的DNA分子时，活性可能更高。3）酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。4）产生粘性末端可以是1--5个核苷酸。5）均为单体，分子量为47—108kD。

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅱ型（typeⅡ）限制与修饰系统

第三种，II型限制性内切酶（有时也被称为IV型限制性内切酶）是一类较大的、集限制和修饰功能于一体的酶，通常由850-1250个碱基组成，在同一条多肽链上同时具有限制和修饰酶活性。这些酶的氨基酸序列各不相同，但其结构组成是一致的。他们在N端由一个负责切开DNA的功能域，这个域又与DNA修饰域连接；此外还有一到两个识别特异DNA序列的功能域构成C端，或以独立的亚基形式存在。当这些酶与底物结合时，它们或行使限制性内切酶的功能切开底物，或作为修饰酶将其甲基化。

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅱ型（typeⅡ）限制与修饰系统

第三种，II型限制性内切酶有些酶识别连续序列，并在识别位点的一端切开DNA链；而另一些酶识别不连续的序列（如BcgI：CGANNNNNNTGC），并在识别位点的两端切开DNA链，产生一小段含识别序列的片段。表4-3一些类型II限制性内切酶的识别位点和切割部位限制性内切酶作用位点和切割部位限制性内切酶作用位点和切割部位BamHI(5’)G↓GATCC(3’)CCTAG↑GHind

III(5’)A↓AGCTT(3’)TTCGA↑AClaI(5’)AT↓CGAT(3’)TAGC↑TANotI(5’)GC↓GGCCGC(3’)CGCCGG↑CGEcoRI(5’)G↓AATTC(3’)CTTAA↑GPstI(5’)CTGC↓AG(3’)GA↑CGTCEcoRV(5’)GAT↓ATC(3’)CTA↑TAGPvuII(5’)CAG↓CTG(3’)GTC↑GAC图4-3限制性内切酶的作用

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅱ型（typeⅡ）限制与修饰系统

Ⅱ型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在DNA链的两个互补位点上。修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。

在Ⅱ型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链DNA中的一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶（nickingenzyme），如N.BstNBI

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅱ型（typeⅡ）限制与修饰系统限制与修饰系统所占的比例最大，达93%。Ⅱ型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割DNA，产生带3‘-羟基和5’-磷酸基团的DNA产物，需Mg2+的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需SAM。识别序列主要为4-6bp，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅱ型（typeⅡ）限制与修饰系统

在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链，特异性最强，产生确定的限制片段和跑胶条带，因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一类，在基因工程中大量使用，是基因工程中主要的限制酶。

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

Ⅲ型（typeⅢ）限制与修饰系统限制与修饰系统的种类更少，所占比例不到1%。

是兼有限制-修饰两种功能的双亚基酶，M亚基负责识别与修饰，R亚基负责切割。它们在识别序列下游24～26bp处切开DNA链，并且要求识别位点是反向重复序列。特异性比较差，很少能产生完全切割的片段，因而不具备实用价值，也没有人将其商业化。如EcoP1和EcoP15，它们的识别位点分别是AGACC和CAGCAG，切割位点则在下游24-26bp处比较内容

ⅠⅡⅢ酶分子三亚基双功能酶内切酶与甲基化酶分子不在一起二亚基双功能酶识别位点二分非对称4-6bp,大多数为回文对称结构5-7bp非对称切割位点无特异性，至少在识别位点外1000bp在识别位点中或靠近识别位点在识别位点下游24-26bp限制反应与甲基化反应互斥分开的反应同时竞争限制作用是否需用ATPYesNoYes

表4－4各种限制与修饰系统的比较

一、限制与修饰

4．限制与修饰系统的种类

I类：不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。Ⅱ类：基因工程的工具酶。Ⅲ类：切割位点不在识别位点，一般离识别位点25bp～27bp，对分子克隆操作亦无实用意义。

在基因操作中，一般所说的限制酶或修饰酶，除非特指，均指Ⅱ型系统中的种类。

一、限制与修饰

5．限制酶发现与鉴定的现状

从大小上来说，它们限制性内切酶可以小到如PvuII（157个氨基酸），也可以比1250个氨基酸的CjeI更大。

1986年下半年发现615种限制酶和98种甲基化酶；1998年发现10000种细菌或古细菌中存在3000种酶，且酶有200多种特异性。到2005年1月，共发现4342种限制酶和甲基化酶，其中限制酶有3681种，包括Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型限制酶各有59、3612、10种，甲基化指导的限制酶有3种，商业化的限制酶有588种，在Ⅱ型限制酶中共有221种特异性。

二、限制酶识别的序列

1．限制酶识别序列的长度

限制酶识别序列的长度一般为4-8个碱基，最常见的为6个碱基（表4－3）。当识别序列为4个和6个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每256个和4096个碱基中会出现一个识别位点（44=256，46=4096）。

以下是几个有代表性的种类，箭头指切割位置。

4个碱基识别位点：Sau3AⅠ↓GATC

5个碱基识别位点：EcoRⅡ↓CCWGG

NciⅠCC↓SGG

6个碱基识别位点：EcoRⅠG↓AATTC

HindⅢ

A↓AGCTT

7个碱基识别位点：BbvCⅠ

CC↓TCAGC

PpuMⅠ

RG↓GWCCY

8个碱基识别位点：NotⅠ

GC↓GGCCGC

SfiⅠGGCCNNNN↓NGGCC

以上序列中部分字母代表的碱基如下。

R=A或GY=C或TM=A或C

K=G或TS=C或GW=A或T

H=A或C或TB=C或G或TV=A或C或G

D=A或G或TN=A或C或G或TNNNNNNNNNNNNGGATTCNNNNNNNNNNNNNNNBamHⅠ5’3’NNNNNNNNNNNNAGCTNNNNNNNNNNNNNNNAluⅠ5’3’AGCTAGCTAGCTAGCTAGCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAluⅠ（+）（-）电泳

5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’5’-GTTAAC-3’3’-CAATTG-5’EcoRⅠ的识别序列HaeⅠ的识别序列5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAApEcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端）pAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’

5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘

3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTT

pAACNNNNN3’3‘NNNNNCAAp

TTGNNNNN5’HaeⅠ的识别序列和酶切切口（平端）二、限制酶识别的序列2．限制酶识别序列的结构

限制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在DNA两条链相对称的位置。

EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切割位置如下。

EcoRⅠG↓AATTCHindⅢA↓AGCTT

CTTAA↑GTTCGA↑A

二、限制酶识别的序列2．限制酶识别序列的结构

有一些限制酶的识别序列不是对称的，如

AccBSⅠ[CCGCTC（-3/-3）]和

BssSⅠ[CTCGTG（-5/-1）]，识别序列后面括号内的数字表示在两条链上的切割位置。

AccBSⅠCCG↓CTCBssSⅠC↓TCGTG

GGC↑GAGGAGCA↑C二、限制酶识别的序列2．限制酶识别序列的结构

有一些限制酶可识别多种序列，如

AccⅠ识别的序列是GT↓MKAC，也就是说可识别4种序列，其中两种是对称的，另两种是非对称的。

HindⅡ识别的序列是GTY↓RAC。二、限制酶识别的序列2．限制酶识别序列的结构

有一些限制酶识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意碱基。如

AlwNⅠ和DdeⅠ，它们的识别序列如下。

AlwNⅠCAGNNNC↓TGDdeⅠC↓TNAG

GT↑CNNNGACGANT↑C二、限制酶识别的序列3．限制酶切割的位置

限制酶对DNA的切割位置大多数在内部，但也有在外部的。在外部的，又有两端、两侧和单侧之别。

切点在两端的有

Sau3AⅠ（↓GATC）、NlaⅢ（CATG↓）和

EcoRⅡ（↓CCWGG）等；二、限制酶识别的序列3．限制酶切割的位置

在两侧的有BcgⅠ[（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）]和

TspRⅠ（CASTGNN↓），

BcgⅠ酶的切割特性与其它酶不同，它们在识别位点的两端各切开一个断点，而不是只产生一个断点。

BcgⅠ↓10（N）CGA（N）6TGC（N）12↓TspRⅠNNCAC（G）TGNN↓

↑12（N）CGA（N）6ACG（N）10↑

↑NNGTG（C）ACNN

切点在识别位点外侧的还有BbvⅠ[GCAGC（8/12）]和

BspMⅠ[ACCTGC（4/8）]等。表4－5内切酶为4，6bp回文结构的识别序列和酶切位点

三、限制酶产生的末端

1．限制酶产生匹配粘端（matchedends）

识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesiveend），这样形成的两个末端是相同的，也是互补的。若在对称轴5'侧切割底物，DNA双链交错断开产生5'突出粘性末端，如

EcoRⅠ；若在3'-侧切割，则产生3'突出粘性末端，如

KpnⅠ。

EcoRⅠ

5

NNG↓AATTCNN

3

3NNCTTAA↑GNN5三、限制酶产生的末端

2．限制酶产生平末端（Bluntend）

在回文对称轴上同时切割DNA的两条链，则产生平末端，如HaeⅢ（GG↓CC）和EcoRV（GAT↓ATC）。产生平末端的DNA可任意连接，但连接效率较粘性末端低。三、限制酶产生的末端

3．限制酶产生非对称突出端

许多限制酶切割DNA产生非对称突出端。

当识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物的末端是不同的，如

BbvCⅠ的识别切割位点如下。

CC↓TCAGC

GGAGT↑CG

三、限制酶产生的末端

3．限制酶产生非对称突出端

有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几种是非对称的。如

AccⅠ，它的识别切割位点如下，其中GTAGAC和GTCTAC为非对称。

GT↓AT/CGAC

CATA/GC↑TG

有些限制酶识别间隔序列，间隔区域的序列是任意的，如DraⅢ和

EarⅠ，它们的识别切割位点分别是CAC↑NNN↓GTG和CTCTTC（1/4）。三、限制酶产生的末端

4．同裂酶（isoschizomer）

是指一些来源不同但识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。具体可分为：

①同序同切酶

这些酶识别序列和切割位置都相同，如HindⅡ与

HincⅡ识别切割位点为GTY↓RAC，

HpaⅡ与HapⅡ识别切割位点为C↓CGG，

MobⅠ与

Sau3AⅠ识别切割位点为↓GATC。三、限制酶产生的末端

4．同裂酶（isoschizomer）

是指一些来源不同但识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。具体可分为：

②同序异切酶

KpnⅠ和

Acc65Ⅰ识别的序列是相同的，但它们的切割位点不同，分别为GGTAC↓C和G↓GTACC。另外，Asp718Ⅰ识别和切割位点为G↓GTACC。

三、限制酶产生的末端

4．同裂酶（isoschizomer）

③“同功多位”许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。如EcoRⅠ识别和切割位点为G↓AATTC，ApoⅠ识别和切割位点为R↓AATTY，后者可识别前者的序列。另外，

HpaⅠ和HincⅡ的识别位点也有交叉，它们的识别和切割位点分别为GTT↓AAC和

HincⅡ。

三、限制酶产生的末端

4．同裂酶（isoschizomer）

④其它有些限制酶识别的序列有交叉，如在pUC系列质粒的多克隆位点中有一个

SalⅠ位点（识别切割位点为G↓TCGAC），该位点也可被AccⅠ（识别切割位点为GT↓MKAC）和HincⅡ（识别切割位点为GTY↓RAC）切割。三、限制酶产生的末端

5．同尾酶

来源各异，识别的靶序列也各不相同，但都产生相同的粘性末端，且是对称的，这些限制酶统称为同尾酶。这些酶切割DNA得到的产物可进行粘端连接。如：·

EcoRⅠ

G↓AATCCMfeⅠ

C↓AATTCApoⅠR↓AATTY

·SpeⅠA↓CTAGT

NheⅠG↓CTAGCXbaⅠT↓CTAGA·BamHⅠG↓GATCCSau3AⅠ↓GATC

StyⅠC↓CWWGG

·ClaⅠAT↓CGAT

AccⅠ

GT↓MKAC（pUC19）三、限制酶产生的末端

6．识别特殊系列的I-prefix和pI-prefix系列酶

有些线粒体、叶绿体、核DNA、T偶数噬菌体含有一些编码内切酶的内含子，有些intein（proteinsplicingelement）也有内切酶的活性，这两类内切核酸酶称为I-prefix和pI-prefix系列内切酶，它们识别的序列很长。

I-prefix是由在RNA水平上剪切和编码的，pI-prefix在蛋白质水平上剪切的产物，这类内切酶也称为homingendonuclease，目前商业化的种类有6种。三、限制酶产生的末端

6．识别特殊系列的I-prefix和pI-prefix系列酶

从因特网上可以找到Intein的数据库Inbase（InteinDatabase），该网站由NewEnglandBioLabs公司维护（）。三、限制酶产生的末端

7．其他限制性内切酶

I-CeuI酶是衣滴虫（Chlamydomonaseugametos）叶绿体大rRNA基因的内含子编码的产物，识别位点为26bp，识别的核心部位为-12至+7位置的19bp。反应温度为37℃，识别位点如下，方框内为核心识别序列：TAACTATAACGGTC↑CTAA↓GGCA四、DNA末端长度对限制酶切割的影响

限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。

用20单位（Units）限制酶切割1

g标记的寡核苷酸做测试时，发现不同的酶对识别序列两端的长度有不同的要求。

EcoRⅠ对两端的序列长度要求较小，在识别序列外侧有一个碱基对时在2小时的切割活性可达90%。而

AccⅠ和HindⅢ对两端的序列长度要求较大。表4－5靠近DNA片段末端的切割效率%（用寡核苷酸检测）限制酶待测的寡核苷酸序列待测的寡核苷酸序列2hr20hrAccⅠCCGGTCGACCGG00HindⅢCAAGCTTG

CCAAGCTTGG

CCCAAGCTTGGG0

0

100

0

75EcoRⅠGGAATTCC>90>90PstⅠ

GCTGCAGC

TGCACTGCAGTGCA

AACTGCAG（N）14

CTGCAG（N）200

10

>90

00

10

>90

0四、DNA末端长度对限制酶切割的影响

用DNA片段（线性载体）检测末端长度对切割的影响时，同样发现识别序列的末端长度对酶切效率有明显影响，不同的酶对末端长度的要求是不同。

在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切割扩增的PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。另外，了解末端长度对切割的影响还可帮助在双酶切多克隆位点时选择酶切秩序。五、位点偏爱（Sitepreference）

某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。五、位点偏爱（Sitepreference）某些噬菌体DNA中的某些相同的酶切位点对酶的敏感性是不同。λ噬菌体DNA为48502bp，含12bp粘端。

EcoRⅠ酶切割

噬菌体中的5个位点时并不是随机的，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快10倍；EcoRⅠ对腺病毒2（adenvirus-2）DNA不同位置切点的切割速率也不同。

EcoRⅠ和HindⅢ在

噬菌体DNA中的切割速率分别有10倍和14倍的差异。五、位点偏爱（Sitepreference）

噬菌体DNA有4个SacⅡ位点，三个在中央，一个在右臂，对中央三个位点的酶切速度快50倍。在φX174噬菌体（单链环状，5386bp，DNA复制时可以双链形式存在）DNA中发现

HgaⅠ切割某些位点比其它的快。在腺病毒2中，CTCGAG位点对

PaeR7Ⅰ完全抵抗，但同裂酶

XhoⅠ却很易切割，原因是5'末端有一个CT二核苷酸，与甲基化完全无关。五、位点偏爱（Sitepreference）造成上述现象的原因有以下几种情况：

NarⅠ，NaeⅠ和SacⅡ三种酶属于在切割DNA之前需要同时与两个识别位点作用的一类酶。

BspMⅠ、EcoRⅡ和HpaⅡ则属另一种情况，它们对要求作用的DNA序列上有两个明显不同的结合位点，其中一个是为DNA切割激活另一个的变构位点（allosteric）。这两序列可由顺式（cis）方式提供，即相互靠近或形成环（loop）；或由反式（trans）方式提供，其变构位点由含识别序列的寡核苷酸提供。

六、酶切反应条件

1．缓冲液

常规缓冲液一般包括提供稳定pH值的缓冲剂、Mg++、DTT（二硫苏糖醇）以及BSA（小牛血请白蛋白）。

pH经常为7.0-7.9（在25℃时），用Tris-HCl或乙酸调节；

Mg++

作为酶的活性中心，由MgCl2

和MgAc提供，浓度常为10mM；

DTT浓度常为1mM。有时缓冲液中还要加入100

g/mlBSA，但只是少数反应需要。

六、酶切反应条件

1．缓冲液

不同的酶对离子强度的要求差异很大，并依次将限制酶缓冲液按离子强度的差异分为高、中、低三种类型，离子强度以NaCl来满足，浓度分别为100mM、50mM和0mM。六、酶切反应条件

1．缓冲液

要对DNA进行双酶切时，如何选择缓冲液是相当重要的。一方面可选用都合适的缓冲液或通用缓冲液；若找不到共用的缓冲液则先用低浓度的，再加适量NaCl和第二种酶；或先用低盐缓冲液再用高盐缓冲液（DNA可纯化或不纯化）

六、酶切反应条件

2．反应温度

反应温度大多数为37℃，一部分为50-65℃，少数25-30℃。高温作用酶在37℃下的活性会下降，多数仅为最适条件下的10-50%。如Taq

限制酶（正常反应温度为65℃），在37℃只有在65℃活性的10%；

ApoⅠ（正常反应温度为50℃），37℃只有在50℃时活性的50%。销售商在产品说明中都会标明最佳反应温度。

六、酶切反应条件

3．反应时间

反应时间通常为1小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶的用量。

EcoRⅠ反应时间为16小时，则所用酶量为只切1小时的1/8。其它一些酶也有类似情况，如HindⅢ为1/8；KpnⅠ为1/4；BamHⅠ为1/2。

六、酶切反应条件

4．终止酶切的方法

EDTA可鏊合镁离子，从而可终止酶切反应，终止浓度为10mM；加热是常用的方法，对于最佳反应温度为37℃的酶，在65℃或80℃处理20分钟可使酶活性大部分丧失。但是对于在80℃作用20分钟也有不失活的酶，如最佳反应温度为37℃的酶

BglⅡ、HpaⅠ和PvuⅡ，65℃酶

Tth111Ⅰ和

TspRⅠ，以及50℃酶

Bc1Ⅰ，可用苯酚抽提去除蛋白，或用试剂盒纯化DNA。

七、星星活性（staractivity）

1、定义

在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。实际上星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点，如

ApoI（2）、AseI（2）、BamHI（3）、BssHII（2）、EcoRI（4）、EcoRV（5）、HindIII（1）、HinfI（6、7）、PstI（8）、PvuII（9）、SalI（8）、ScaI（2）、TaqI（10）、XmnI（2）、KpnⅠ等酶皆可表现出星星活性。

七、星星活性（staractivity）

2、导致星号活性的因素

酶识别特异性的改变受酶本身的性质及可能引起星号活性的反应条件影响，常见的引起酶识别改变的条件有：

单碱基替换－1个碱基的变化；

识别序列外侧碱基缩短－识别位点外层碱基的随意性

单链切刻－单链缺口

七、星星活性（staractivity）

2、导致星号活性的因素较高的甘油浓度（>5%v/v）；酶与底物DNA比例过高（不同的酶情况不同，通常为>100U/

l

）；

离子强度低，即低盐浓度（<25mM）高pH值（>pH8.0）存在有机溶剂（如DMSO、乙醇、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane等）用其他二价离子替代镁离子,如Mn2+、Cu2+

、Co2+、Zn2＋等。

七、星星活性（staractivity）

2、导致星号活性的因素以上因素的影响程度因酶的不同而有所不同，如EcoRI比PstI对甘油浓度更敏感，而后者则对高pH值更敏感一些。

Polisky等对EcoRI的早期研究表明，在低盐浓度、高pH值条件下，EcoRI可能切割N/AATTN序列；最近，Gardner等的研究表明，只要识别中心的四碱基序列（AATT）不出现A/T替换，EcoRI可以切割其它任何单碱基替代序列。

七、星星活性（staractivity）

3、抑制星号活性的方法星星活性在绝大多数情况下是可控制的尽量用较少的酶进行完全消化反应，这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染。将离子浓度提高到100-150mM（若酶活性不受离子强度影响）。将反应缓冲液的pH值降到7.0。二价离子用Mg2+。

七、星星活性（staractivity）

3、抑制星号活性的方法大多数星号活性是可以控制的，只要在正常条件下使用随酶提供的Buffer就不会出现星号活性。

八、单链DNA的切割

部分切割双链DNA的酶也可消化其单链，但是切割效率不同。

HinPⅡ、HhaⅠ、MnlⅠ切割单链DNA的效率是切割双链的50%

HaeⅢ切割单链DNA的效率是切割双链的10%

BstNⅠ、DdeⅠ、HgaⅠ、HinfⅠ、TaqⅠ切割单链DNA的速度比切割双链慢100倍。

八、单链DNA的切割

还有一些酶不切割单链DNA，如AluⅠ、BbvⅠ、DpnⅠ、FnuDⅡ、FokⅠ、HpaⅡ、HphⅠ、MobⅠ、MobⅡ、MspⅠ、Sau3AⅠ、SfaNⅠ等等。

有些限制酶只切割双链DNA中的一条链，产生单链缺口，即切口酶（nickingenzyme），如N.BstNBⅠ。这类酶在命名时前面要加一个N，目前已经商品化的这类酶共有7种。

N.BstNBⅠ的识别序列和切割位置如下：

5′...GAGTCNNNNN...3′

3′...CTCAGNNNNN...5′

九、酶切位点的引入

通过酶切和连接可产生新的酶切位点

（1）将产生的5‘突出端补平后，再连接可产生新的酶切位点

EcoRⅠ

的识别位点是GAATTC，先用它来切片段，将5'突出端补平后，再连接可产生

XmaⅠ（GAANNNNTTC）和AceⅠ（ATTAAT）酶切位点，而

EcoRⅠ的酶切位点消失。

……GAATTC……补平

….GAATTAATTC….

连接

….GAATTAATTC…

……CTTAAG……….CTTAATTAAG….….CTTAATTAAG…

对

HindⅢ位点（AAGCTT）来说，经酶切和连接可产生

AluⅠ和NheⅠ酶切位点，同时

HindⅢ位点消失九、酶切位点的引入

（2）同尾末端的连接

不同的同尾酶切割DNA产生的末端再相互连接时，可产生新的酶切位点，同时原来的酶切位点却消失如BamHⅠ（G↓AATCC）+BclⅠ（T↓GATCA）→

AlwⅠ（GGATC4/5）

XbaⅠ（T↓CTAGA）+AvrⅡ，或

NheⅠ或SpeⅠ或StyⅠ（CCTAGG）→

BfaⅠ（C↓TAG）也产生了新的酶切位点。九、酶切位点的引入

（3）平端连接平末端的限制酶切割的DNA在连接后也可产生新的酶切位点，如

PvuⅡ（CAGCTG）+EcoRV（GATATC）→

MobⅠ（GATC）。

十、影响酶活性的因素

影响酶切活性的因素有许多，概略的说可分为：外因：反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应体积的选择以及反应时间的长短等等。内因：位点偏爱性、甲基化底物、底物的构象。构象的影响主要指切割线性DNA和超螺旋DNA时的活性，如与切割

DNA相比，EcoRⅠ、PstⅠ、SalⅠ需要至少2.5-10倍的酶来切割pBR322的超螺旋DNA。

PaeRTⅠ与XhoⅠ切割相同的序列（C↓TCGAG），但如果5‘端为CT则

PaeRTⅠ不能切割。十、影响酶活性的因素

1）DNA纯度污染在DNA制剂中的某些物质，如蛋白质、酚、酒精、异丙醇、EDTA、高盐离子等会影响酶切。

克服方法：在纯化过程中，空转一定要时间充足、要彻底。用微碱的TE洗脱。提高限制内切酶的用量。延长酶切时间扩大酶切体积，使潜在的抑制因素被相应得稀释。

十、影响酶活性的因素

2）DNA甲基化的程度识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性通常从大肠杆菌细胞中分离的质粒DNA，都混有特定核苷酸序列的甲基化酶：DAM甲基化酶：催化GATC序列中的腺嘌呤残基甲基化dcm甲基化酶：催化cca\tgg序列中内部的胞嘧啶残基的甲基化。

所以在基因克隆中是使用了失去甲基化酶的大肠杆菌制备质粒DNA。十、影响酶活性的因素

3）酶切消化反应温度酶切标准温度是37℃

，但是某些特殊的酶最适合温度是例外的，比如SmaI是30℃

。过高或者过低的温度会使内切酶失去活性十、影响酶活性的因素

4）DNA的分子结构

DNA分子的不同构型对限制性内切酶的活性也有很大的影响。当DNA分子为线性的时候最容易，当DNA分子存在二级结构的时候，酶切的活力就会大大降低。十、影响酶活性的因素

5）限制性内切酶的缓冲液缓冲液一般的组成部分包括：氯化镁、Tris-HCl,β

－巯基乙醇或者DTT、BSA等。适合的二价金属离子浓度，通常为Mg2＋。适合的pH通常为7.4左右。十一、酶切位点在基因组中分布的不均一性

在基因组中碱基对的排列是非均匀的，因此尽管有的酶切序列中GC含量相同，但在基因组中出现的机率还是不一样。如在

E.coli中，

AsoⅠ（GGCGCGCC）切点平均20kb中出现一个

NotⅠ（GCGGCCGC）切点平均200kb中出现一个（常利用它出现的机会少来构建图谱）

EcoRⅠ

和HindⅢ切点平均5kb中出现一个

SpeⅠ（ACTAGT）切点平均60kb中出现一个。十二、限制性内切酶的贮存与应用

限制酶对热不稳定，贮存于-20ºC，为避免反复冻溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油，使用时添加相应的缓冲液稀释，降低反应液中