分子生物学实验

分子生物学实验一、核酸的提取、纯化与鉴定1.1哺乳动物细胞总RNA的提取与纯化经典方法：异硫氰酸胍-酸酚法实验原理：高浓度强变性剂异硫氰酸胍作用：a.可使细胞结构迅速破坏，释放出RNA，包括核糖体RNA。b.使RNA酶失活，使释放出的RNA不被RNA酶降解。采用酸性苯酚/氯仿/异戊醇抽提细胞裂解物时，蛋白质变性不溶，而在酸性pH条件下，DNA溶于酚相中，RNA仍留于水相中。取水相用冰异丙醇沉淀，70%乙醇洗涤晾干后即可得到高质量总RNA。商品化方法：trizol法trizol法实验步骤1.提取组织RNA时，每50～100mg组织（已研磨成粉沫）用1mlTrizol试剂进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10×106个细胞加1mlTrizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30℃下放置5分钟；3.在上述EP管中，按照每1mlTrizol加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖紧管口，用力震荡15秒，室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；4.取上层水相置于新EP管中,按照每1mlTrizol加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；5.弃上清，按照每1mlTrizol加1ml75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；6.沉淀的RNA在室温下自然干燥数分钟，用Rnase-freewater溶解RNA沉淀。1.2病毒RNA的提取Trizol法提禽流感病毒Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌的总RNA提取，样品量从几十毫克至几克。实验步骤1、取鸡胚尿囊液，加入5-10倍体积

Trizol液，混匀；2、室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧管口，用手剧烈摇荡离心管15秒；3、取上层水相于新EP管，按每1mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟；4、弃去上清液，按每1mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，混匀，4℃下7500g离心5分钟；5、重复第4步；6、小心弃去上清液，然后室温干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度；7、将RNA溶于Rnase-freewater中，放置10分钟。注意事项1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。1.3mRNA的分离纯化亲和层析法：原理：除血红蛋白及某些组蛋白外，绝大多数mRNA在其3'末端带有一个长短不一的多聚腺苷酸（polyadenylicacid）结构，即poly(A)尾巴。以总RNA为起始材料，利用核酸的碱基配对原理，通过oligo(dT)-纤维素或poly(U)-琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地同时分离不同种类与大小的mRNA。实验方法1．将0.5-1.0g寡聚（dT）-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。2．用DEPC处理的1ml注射器或吸管，将寡聚（dT）-纤维素装柱0.5-1ml，用3倍柱床体积的DEPC处理过的H2O洗柱。3．使用1×上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。4．将RNA溶解于DEPC处理过的H2O中，于65℃温育10min左右，冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后，再用1×上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。5．将所有流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。6．用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，OD260测定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其内含物为无Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。7．用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A+)RNA，分部收集，每部分为1/3-1/2柱体积。8．OD260测定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10体积3MNaAc（pH5.2）、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。9．4℃离心，10000g×15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。[注意：此时Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃离心，10000g×5min，弃上清，室温晾干。10.用适量的DEPC处理H2O溶解RNA。附：磁珠分离mRNA试剂盒1.1.5mlEP管中加入500ul待提取样品，加入400ul核酸提取液，震荡10秒；2.将EP管置于60℃保温10分钟；

3.将EP管置于室温放置10分钟，转移到磁珠分离器上，静置5分钟；待磁珠吸附于管壁后，吸净管中的气泡和液体，保留磁珠；4.向管中加入1ml洗涤液，取下后震荡10秒，再置于磁珠分离器上，静置5分钟；重复步骤3，共用洗涤液漂洗2次，最后尽量吸净液体；

5.若后续试验无特殊要求，加入50ulDEPC处理H2O，震荡，使磁珠悬浮即可；

6.若需要将磁珠洗脱下来，可向管中加入50ul洗脱液（DEPC处理H2O或Long-termRNAStorageBuffer），取下并震荡10秒，再将管置于恒温装置上60℃保温5分钟；

7.立即将上述EP管重新置于磁珠分离装置上，静置3分钟，保持样品处理管于磁珠分离装置上，取出清液（弃磁珠），即为提取的RNA。2．DNA的提取与纯化2.1细菌质粒DNA的提取与纯化质粒DNA的小量制备原理：采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（

SDS）可使细胞壁裂解，经溶菌酶和阴离子去污剂（

SDS）处理后，细菌

DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒

DNA则留在上清液中。用酒精沉淀洗涤，可得到质粒

DNA。质粒DNA的小量制备可采用下述的碱裂解法或煮沸法（一）细菌的收获和裂解1.收获

1）将2ml含抗生素的LB加入到容量为15ml并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于30℃剧烈振摇下培养过夜。

2）将1.5ml培养物倒入EP管中，于4℃以12000g离心30秒。

3）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥，注意吸头远离细菌沉淀。2.碱裂解法1）将细菌沉淀，所得重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。溶液I

50mmol/L葡萄糖

25mmol/LTris.Cl（pH8.0）

10mmol/LEDTA（pH8.0）溶液I可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2（6.895×104Pa）高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。2）加200μl新配制的溶液Ⅱ。溶液Ⅱ

0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）

1%SDS盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。3）加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ溶液Ⅲ

5mol/L乙酸钾

60ml冰乙酸

11.5ml水

28.5ml盖紧管口，将EP管倒置后振荡10秒钟，溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3－5分钟。4）用微量离心机于4℃12000g离心5分种，将上清转移到新EP管中。5）可做可不做：加等量酚：氯仿，振荡混匀，于4℃以12000g离心2分钟，将上清转移到另一新EP管中。有些工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会影响限制酶切反应。6）用2倍休积的乙醇于室温沉淀DNA.振荡混合，于室温放置2分钟。7）用微量离心机于4℃以12000g离心5分钟。8）小心吸去上清液，将EP管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出，将附于管壁的液滴除尽。注意吸头远离核酸沉淀。9）用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤8）所述方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。注意事项i.此法制备的高拷贝数质粒（如Xf3或pUC），其产量一般约为：每毫升原细菌培养物3－5μg。ii.如果要通过限制酶切割反应来分析DNA，可取1μlDNA溶液加到另一含8μl水的微量离心管内，加1μl10×限制酶缓冲液和1单位所需限制酶，37℃温育1－2小时。将剩余的DNA贮存于－20℃。iii.此方法按比例放大可适用于100ml细菌培养物：3.煮沸裂解1）将细菌沉淀，所得重悬于350μlSTET中。

STET

0.1mol/LNaCL

10mmol/LTris.Cl（pH8.0）

1mmol/LEDTA（pH8.0）

5%TritonX-1002）加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml，用10mmol/LTris.Cl（pH8.0）配制]，振荡3秒钟以混匀。如果溶液中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。3）将离心管放入煮沸的水中，时间恰为40秒。4）室温以12000g离心10分种。5）用无菌牙签从EP管中去除细菌碎片。6）在上清中加入40μl5mol/L乙酸钠（pH5.2）和420μl异丙醇，振荡混匀，于室温放置5分钟。7）用微量离心机于4℃以12000g离心5分种，回收核酸沉淀。8）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出,轻缓抽吸，尽可能使吸头远离核酸沉淀。9）加1ml70％乙醇，于4℃以12000g离心2分钟。10）按步骤8）所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体（2－5）分钟。11）用50μl含无DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE（pH8.0）溶解核酸稍加振荡，贮存于-20℃。注意事项当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌株（endA+株，如HB101）中小量制粒尤其DNA时，建议舍弃煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶A，以后在Mg2+存在下温育质粒DNA可被降解。在上述方案的步骤9）之间增加一步，即用酚：氯仿进行抽提，可以避免这一问题。（二）质粒DNA小量制备的问题与对策裂解和煮佛法都极其可靠，重复性也很好，而且一般没有会么麻烦。多年来，在我们实验室中日常使用这两种方法的过程中，只碰到过两个问题：1）有些工作者首次进行小量制备时，有时会发现质粒DNA不能被限制酶所切割，这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果总是依然存在，可用离心柱层析注纯化DNA.2）在十分偶然的情况下，个别小时制备物会出现无质粒DNA的现象。这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。质粒DNA的大量制备（一）在丰富培养基中扩增质粒许多年来，一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效，然而在带有pMBl或ColEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌中，采用以下步骤可提高产量至每500ml培养物2－5mg质粒DNA，而且重复性也很好。实验步骤1）将30ml含有目的质粒的细菌培培养到对数晚期（DNA600约0.6）。2）将含相应抗生素的500mlLB或Terrific肉汤培养基（预加温至37℃）放入25ml对数晚期的培养物，于37℃振摇培养25小时（摇床转速300r/min），所得培养物的OD600值约为0.4.3）可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇），使终浓度为170μg/ml.像pBR322为中等拷贝质粒，有必要通过扩增。pUC质粒为高拷贝质粒，因此无需扩增。这些质粒只要从生长达到饱和的细菌培养物即可大量提纯。用氯霉素进行处理，具有抑制细菌复制的优点，可减少细菌裂解物的体积和粘稠度，极大地简化质粒纯化的过程。一般说来，尽管加入氯霉素略显不便，但用氯霉素处理还是利大于弊。4）于37℃剧烈振摇（300r/min），继续培养12-16小时。（二）细菌的收获和裂解1.收获1）于4℃4000r/min离心15分钟，弃上清，倒置离心管使上清全部流尽。2）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。

STE

0.1mol/LNaCl

10mmol/LTris.Cl（pH8.0）

1mmol/LEDTA（pH8.0）3）按步骤1）所述方法离心，以收集细菌细胞。2.碱裂解法1）将洗过的来源于500ml培养基中细菌沉淀物[来自收获细菌的步骤3]重悬于10ml（18ml）溶液I中。溶液I

50mmol/L葡萄糖

25mmol/LTris.Cl（pH8.0）

10mmol/LEDTA（pH8.0）溶液I可成批配制，在10lbf/in2（6.895x104Pa）高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。2）加1ml（2ml）新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml，溶于10mmol/LTris.Cl（pH8.0）].当溶液的pH值低于8.0时，溶菌酶不能有效发挥作用。3）加20ml（40ml）新配制的溶液Ⅱ。溶液Ⅱ

0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）

1％SDS盖紧瓶口，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。4）加15ml（20ml）冰预冷的溶液Ⅲ。溶液Ⅲ

5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放置10分钟，应形成一白色絮状沉淀。该沉淀应包括染色体DNA、高分子量RNA和钾－SDS－蛋白质－膜复合物。5）于4℃4000r/min离心15分钟，如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000r/min再度离心20分钟，然后尽可能将上清全部转到另一EP管中，弃去管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分（步骤4）.6）上清过滤至一250ml离心瓶中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10分钟。7）室温以500r/min离心15分钟，回收DNA。如于4℃离心，盐也会形成沉淀。8）小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用70％乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相连的巴斯德吸管吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸巾上，使残余的乙醇挥发干净。9）用3mlTE（pH8.0）溶解DNA沉淀。10）纯化。

质粒DNA的纯化纯化方法聚乙二醇沉淀法氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心法（一）聚乙二醇沉淀法1）将DNA溶液转入15mlCorex管中，加3ml冰预冷的5mol/LLiCl溶液，充分混匀，于4℃

10000r/min离心10分钟。LiCl可沉淀高分子RNA.2）将上清转移到另一30mlCorex管内，加等体积异丙醇，充分混匀，用SorvallSS34转头（或与其相当的转尖）于室温以10000r/min离心10分钟，回收沉淀的DNA。3）小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使残留的液滴流尽。于室温用70％乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置相连的巴斯德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管倒置，于纸巾上放置几分钟，以使残余的乙醇挥发干净。4）用500μl无DNA酶的含胰RNA酶（20μg/ml）的TE（pH8.0）溶解DNA，将溶液转到另一EP管中，于室温放置30分钟。5）加500μl含13％（w/v）聚乙二醇（PEG8000）的1.6mol/LNaCl，充分混合，4℃12000g离心5分钟，以回收质粒DNA.6）吸出上清，用400μlTE（pH8.0）溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽1次。7）将水相转到另一EP管中，加100μl10mol/L乙醇铵，充分混匀，加2倍体积（约1ml）乙醇，于室温放置10分钟，4℃12000g离心5分钟，以回收沉淀的质粒DNA.8）吸去上清，加200μl处于4℃以12000g离心2分钟。9）吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到残余的痕量乙醇挥发干净。10）用500μlTE（pH8.0）溶解沉淀1：100稀释（用TE）

后测量OD260，计算质粒DNA的浓度（1OD260＝50μg质粒DNA/ml），然后将DNA贮于－20℃。细菌基因组DNA提取纯化CTAB/NaCl法：细菌基因组DNA的制备

一、材料

细菌培养物。

二、试剂

1、CTAB十六烷基三甲基溴化铵/NaCl溶液：4.1g

NaCl溶解于80ml

H2O,缓慢加入10g

CTAB,加水至100ml。

2、其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70%

乙醇，TE，10%

SDS，蛋白酶

K

(20mg/ml或粉剂)，5mol/L

NaCl。三、操作步骤：1.将菌株接种于LB培养基，37℃震荡培养过夜。2.取1.5ml培养物12000r/min离心2min。3.弃上清，沉淀物中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.4.加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后于65℃温育10min。

5.加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入新EP管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。6.沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇。哺乳动物细胞DNA的提取与纯化盐析法原理：细胞中的DNA和RNA分别与蛋白质相结合，形成脱氧核糖核蛋白及核糖核蛋白。在细胞破碎后，这两种核蛋白将混杂在一起。因此，要制备DNA首先要将这两种核蛋白分开。已知这两种核蛋白在不同浓度的盐溶液中具有不同的溶解度，如在0.15mol/LNaC1的稀盐溶液中核糖核蛋白的溶解度最大，脱氧核糖核蛋白的溶解度则最小（仅约为在纯水中的1%）；而在lmol/LNaCl的浓盐溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度增大，至少是在纯水中的2倍，核糖核蛋白的溶解度则明显降低。根据这种特性，调整盐浓度即可把这两种核蛋白分开。因此，在细胞破碎后，用稀盐溶液，反复清洗，所得沉淀即为脱氧核糖核蛋白成分。分离得到的脱氧核糖核蛋白，用十二烷基硫酸钠（SDS）使蛋白质成分变性，使DNA游离出来，再用含有异戊醇的氯仿沉淀除去变性蛋白质。最后根据DNA只溶于水而不溶于有机溶剂的特点，加入95%的乙醇即可从溶液中把DNA沉淀出来，获得产品。细胞破碎时，细胞内的脱氧核糖核酸酶（DNase）立即开始降解DNA，如不及时采取抑制措施，最后将会得不到任何DNA。为此，如在本实验中加入柠檬酸盐、EDTA等螯合剂以除DNase必需的Mg2＋离子，使DNase活性降低，并要求整个操作均在4℃以下进行，最后加入SDS使所有的蛋白质（包括DNase）变性。如果希望获得更大分子的DNA，则在细胞破碎后，及时加入SDS使蛋白质（包括DNase）变性，并加入蛋白酶K，降解所有的蛋白质成为碎片或氨基酸，及时阻止DNase的降解作用。DNA分子很大、很长，在水中呈黏稠状，但DNA链的双螺旋结构不宜小角度的折叠，使之DNA分子具有刚性，即分子是僵直的（stiff），小角度的折叠和压挤等剪切力，将使DNA断裂成碎片。为保证获得大分子DNA，操作时应避免剧烈振摇，或过大的离心力。转移吸取DNA时不可用过细的吸头，不可猛吸猛吹，更不能用细的吸头反复吹吸。试剂及器材（1）0.15mol/LNaCl–0.015mol/LpH7.0柠檬酸钠溶液：称取8.77gNaCl，4.41g柠檬酸三钠（Na3C6H507·2H20），用约800ml蒸馏水溶解，调节pH至7.0，最后定容至1000ml。（2）0.15mol/LNaCl–0.1mol/LEDTANa2溶液：称取8.77gNaCl，37.2gEDTANa2溶于约800ml蒸馏水中，以NaOH调pH至8.0，最后定容至1000ml。（3）5%（W/V）十二烷基硫酸钠（SDS）溶液：称取5gSDS溶于45%（V/V）100ml的乙醇中。

（4）氯仿–异戊醇溶液：按氯仿:异戊醇=24:1配制。5）pH8.0TE缓冲液或0.01mol/LNaOH：120mol/LTris–HCl，lmol/LEDTANa2。或取NaOH0.4g加蒸馏水至1000ml。

（6）95％（V/V）乙醇1000ml。（7）75％（V/V）乙醇1000ml。（8）组织捣碎机。（9）玻璃匀浆器。（10）冷冻离心机。（11）冰、粗盐。实验步骤（1）本实验以兔肝脏作材料（其他动物肝脏也可）。实验前将兔饥饿24h以上，以避免糖原的干扰。（2）用烧杯（500ml）装1/3体积的冰，加入少量水及约20g食盐，制成冰盐水。（3）将经过饥饿的兔颈部放血致死，迅速开腹取出肝脏，称取约10g浸入在冰盐水预冷的0.15mol/LNaCl–0.015mol/L柠檬酸钠溶液中。除去脂肪、血块等杂物，再用少量溶液反复洗涤几次，直至组织块无血为止。（4）将洗净的组织剪成碎块。先加入20ml0.15mol/LNaCl–0.015mol/L柠檬酸钠溶液，放在组织捣碎机中迅速捣成匀浆，再放入玻璃匀浆器中匀浆2～3次，使细胞充分破碎。最后加入0.15mol/LNaCl–0.015mol–L柠檬酸钠溶液至50ml。（5）匀浆液于4℃6000r／min离心15min，弃上清。在沉淀中加入4倍体积冷的0.15mol/LNaCl–0.015mol/L柠檬酸钠溶液，搅匀，按上述条件，离心弃上清。如此重复操作2～3次，尽量洗去可溶的部分（目的是什么?）。最后弃去上清，留沉淀。（6）将沉淀物（约5m1）悬浮于5倍体积的pH8.0，0.015mol/LNaCl–0.1mol/L

EDTANa2溶液中，搅匀，然后边搅拌边慢慢滴加5%SDS溶液，直至SDS的最终浓度达1%为止（应加多少毫升?）。（此时溶液变得十分黏稠，若不黏稠应重做。）然后，加入固体NaCl使最终浓度达1mol/L。继续搅拌30～45min，以确保NaCl全部溶解，此时可见溶液粘稠度下降。（7）将上述混合溶液倒于一个300ml的带塞三角瓶中，加入等体积的氯仿–异戊醇，振荡10min。室温3000r/min离心10min（为什么可以在室温操作?），此时可见离心液分为3层：上层为水溶液，中层为变性蛋白块，下层为氯仿–异戊醇。小心吸取上层水相，记录体积，放入三角瓶中，向水相中加入等体积氯仿–异戊醇，振荡，离心，如此重复抽提2–3次，除净蛋白质。（8）最后1次离心后，小心吸取上层溶液（不要吸取下层氯仿），记录体积，放入干燥小烧杯中，加入2倍体积预冷的95%乙醇。边加边用玻璃棒慢慢搅拌，随着乙醇的不断加入可见溶液出现黏稠状物质，将黏稠丝状物尽可能多的缠在玻璃棒上。黏稠丝状物即是DNA。（9）将所得的DNA从玻璃棒上取下，用75%乙醇洗2次，置于干燥器中抽干，称取重量，计算产率。（10）按200μg/ml的浓度称取一定量DNA，溶于0.01mol/LNaOH溶液或pH8.0TE缓冲液中（干燥DNA不易溶解，应在测定前几天预先溶解）。有机溶剂抽提法1.

切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。

2.

倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。

3.

加1ml

10%

SDS,

混匀,此时样品变得很粘稠。

4.

加50ul或1mg

蛋白酶

K,

37℃保温1-2h,

直至组织完全溶解。

5.

加1ml

5mol/L

NaCl,

混匀,5000rpm离心数秒钟。

6.取上清液于新EP管中，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层后,3000rpm离心

5分钟。

7.

取上层水相至另一新EP管,

加2倍体积乙醚抽提(在通风橱中)。

8.

移去上层乙醚,保留下层水相。

9.

加1/10

体积3mol/L

NaAc,

及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静置10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。

10.

用玻璃棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml

TE中,-20℃保存。

11.

如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm短暂离心,取上清;

如要除去其中的RNA,可加5μl

RNaseA(10μg/μl),

37℃保温30分钟,

用酚抽提后,

按步骤9-10重沉淀DNA。

SDS法实验原理：DNA主要存在于细胞核中。通过研磨和SDS作用破碎细胞；苯酚和氯仿可使蛋白质变性，用其混合液（酚：氯仿：异戊醇）重复抽提，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质；RNase降解RNA，从而得到纯净的DNA分子。

试剂配制1．Tris–HCL1mol/LPH8.050ml

40mlddH2O

，6.057g固体Tris放入烧杯中溶解，用浓盐酸调PH值到8.0，ddH2O定容至50ml，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

2．生理盐水:0.85%NaCL100ml

在20mlddH2O中溶解0.85g固体NaCL，定容至100ml，摇匀后，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

3．EDTA0.5mol/LPH8.050ml

将9.08g的EDTA·Na2·2H2O溶解于40ml

ddH2O，用1g的NaOH颗粒（慢慢加入）调PH值到8.0，定容至50ml，如果EDTA难溶，先加NaOH溶解，然后逐步加EDTA·Na2·2H2O。

4．TES缓冲液（释放DNA）100ml

将0.5844g的5mol/lNaCl溶解于80mlddH2O，在分别加入1ml的0.5mol/lEDTA、0.2ml的Tris-HCl(pH=8.0)，加定容至100ml,摇匀后，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

5．10%SDS（变性剂破细胞壁）100ml

将10g的十二烷基硫酸钠（SDS）溶解于80ml

ddH2O中，于68℃加热溶解，用浓HCl调至PH=7.2，定容至100ml，摇匀后，贴上标签，4℃保存备用。

6．蛋白酶K（降解蛋白质）：20mg/mL无菌三蒸水溶解。

7．RNA酶（降解RNA）

将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/L的Tris·CL（PH7.5）、15mmol/LNaCL中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份存于–20℃。

8．氯仿：异戊醇=24：1100ml

按24:1的比例加入氯仿、异戊醇，摇匀，转到准备好的瓶中，贴上标签，4℃保存备用。

9．TE缓冲液（溶解DNA）PH8.050ml

将0.5ml的10mmolTris-HCl(PH8.0)、0.1ml的0.5mol/lEDTA(PH8.0)加入到50ml的容量瓶中，调PH8.0定容至50ml摇匀后，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

实验步骤1．组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取约0.5g组织，放入1.5mlEP管中，剪碎。

2．加入0.45mlTES混匀，再加入50ulSDS（10%），5.0ul蛋白酶K（20mg/ml），充分混匀后，于56°C保温4-6h，每2h摇1次。

3．于室温加入等体积饱和酚（500ul），颠倒混匀，10000r/min离心10min，分离水相和有机相，小心吸取上层含DNA的水相到新的1.5mlEP管。

4．加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，10000r/min，离心10min，取上层转移到新的1.5mlEP管中。

5．加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），颠倒混匀，10000r/min，离心10min，取上清液到新的1.5mlEP管中。

6．加入2.5倍体积的-20°C预冷的无水乙醇沉淀DNA，观察现象。

7．12000r/mim，离心10min，弃乙醇。

8．-20°C保存的75%乙醇洗涤，10000r/min，离心5分钟，去乙醇，55°C干燥DNA。

9．加入适量TE溶解DNA（根据DNA的量），-20°C保存备用。注意事项1．抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对DNA的损伤。

2．取上层清液时，注意不要吸起中间的蛋白质层。

3．乙醇漂洗去除乙醇时，不要荡起DNA。

4．离心后，不要晃动离心管，拿管要稳，斜面朝外。3.RNA和DNA的理化性质鉴定3.1理化性质的初步鉴定：电泳DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理

带电粒子在电场中可以按固定方向移动的现象，称为电泳。DNA分子在pH值高于其等电点的缓冲液中带负电荷，在电场中向正极移动,缓冲液pH值偏离等电点愈远，其所带的电荷愈多。在一定的电场强度下，不同的DNA片段的迁移速度不一样。其迁移速度主要取决于DNA的分子大小、所带电荷量等，分子量愈小、带电荷量愈多，迁移速度愈快，相同分子量的不同构型的DNA分子，其迁移速度也不一样。超螺旋质粒DNA的泳动速度最快，线状质粒DNA次之，开环质粒DNA泳动速度最慢。另外，同一种DNA分子，在高浓度琼脂糖胶中泳动速度较慢，在低浓度琼脂糖胶中泳动速度较快。实验步骤1、琼脂糖胶液的制备：称取1g琼脂糖，置于三角烧瓶中，加入100mlpH8.3Tris-硼酸EDTA缓冲液，

110---115℃加热8-10分钟，琼脂全部融化后溶液变澄清，取出摇匀，即为1%琼脂。（也可加溴化乙啶2.5ul）

2、凝胶板的制备

用橡皮膏将凝胶塑料托盘短边缺口封住，置工作台面上（将样品槽模板（即梳子）插进托盆长边上的凹槽内（距一端约1.5cm），梳子底边与托盘表面保持0.5一1mm的间隙。待琼脂糖冷至65℃左右，加入4μlDNAgreen。混匀后小心地倒入托盘内，使凝胶缓慢地展开直至在托盘表面形成一层厚度均匀胶层．其内不存有气泡．室温下静置0.5一lh。待凝固完全后，在梳齿附近加入少量缓冲液润湿凝胶，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板（注意勿使样品槽破裂）。3、取下封边的橡皮膏，将凝胶连同托盘放人电泳槽中，用缓冲液先填满加样槽，防止槽内窝存气泡。继续倒入缓冲液直至浸没过凝胶面2—3mm。4、加样

将酶解后的DNA样品液与溴酚蓝-甘油溶液以4：1的体积比混合，分别加入到凝胶板的加样槽内．每个糟加10ul左右。加样量不宜超过20ul，避免样品过多而溢出，污染邻近样品，加样时，注射器针头穿过缓仲液小心插人加样槽底部，不要损坏凝胶，然后缓慢加样。

5、电泳

加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极．另一端连接正极（千万不要搞错），接通电源，开始电