工业菌种扩大培养技术（微生物育种技术课件）

工业菌种的扩大培养技术

种子的制备过程

种子扩大培养：将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。菌种扩大培养的目的：为发酵提供足够数量的代谢旺盛的种子（纯种培养物）。优良种子应具备的条件菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；生理性状稳定；菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；无杂菌污染；保持稳定的生产能力。一种子的制备过程种子制备的过程大致可分为：实验室种子制备阶段生产车间种子制备阶段制备过程：实验室：保存菌种→斜面上活化→悬浮液（如为孢子叫孢悬液）→生产车间：一级种子罐→二级种子罐→发酵罐二、实验室阶段1.细菌菌体的制备细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度一般为37˚C。细菌菌体培养时间一般为1-2天，产芽孢的细菌培养则需要5-10天。放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。碳源和氮源不要太丰富（碳源约为1％，氮源不超过0.5％），干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。放线菌斜面的培养温度大多数为28℃，少数为37℃，培养时间为5～14天。（1）放线菌孢子的制备菌种接入种子罐有两种方法：孢子进罐法——将斜面孢子制成孢子悬浮液直接接入种子罐，可减少批与批之间的差异，具有操作方便、工艺过程简单、便于控制孢子质量等优点；摇瓶菌丝进罐法——适用于某些生长发育缓慢的放线菌，可以缩短种子在种子罐内的培养时间。菌种母斜面（孢子）摇瓶种子（菌丝）种子罐发酵罐子斜面（孢子）放线菌发酵生产的工艺过程：①①制备母斜面孢子、子斜面孢子、摇瓶种子，菌丝接入种子罐②制备母斜面孢子、摇瓶种子，菌丝接入种子罐③制备母斜面孢子、子斜面孢子，孢子接入种子罐④制备母斜面孢子，孢子接入种子罐②③④（2）霉菌孢子的制备霉菌的孢子培养，一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。霉菌的培养一般为25～28℃，培养时间为4～14天。（3）细菌培养物的制备细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方，牛肉膏、蛋白胨常用作有机氮源。细菌培养基温度大多数为37℃，少数为28℃，细菌菌体培养时间一般为1～2天，产芽孢的细菌需培养5～10天。三、生产车间种子制备实验室制备的液体种子移种至种子罐扩大培养。1.种子罐的作用主要是使菌体数量进一步增加，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。2.种子罐级数的确定种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数1．种子罐级数的决定（1）根据生产菌的特性：生产繁殖快慢，如生长繁殖快则级数少（2）根据发酵罐的接种量：（3）发酵罐与种子罐的体积比V发酵罐/V种子罐比数越大，种子级数越大。

发酵罐接种量少，则级数少，接种量决定于①根据菌的生长特性（生长快接种量少），看接种菌，如细菌接种量1-5%，酵母菌10%，霉菌放线菌7-15%（但霉菌也有少的，如制霉菌素，只用1%）

②根据种子质量：活力高则接种量少现相当多的产品采用大接种量，如庆大霉素发酵的接种量达20-25%，大接种量优点和缺点:优点：a.可缩短发酵罐中菌的生长期，则产物合成的时间可提前，则整个合成时期就增加了，不少种子液中会有水解酶类，有利于发酵利用。b.可有效地防止发酵罐的前期染菌，有相当部分的特别是抗生素的生产，种子液中就有抗生素，可利用之抑菌。缺点：a.要求种子罐多b.种子液中含代谢废物，副产物，在发酵罐中可能抑制菌的生长和产物的合成。具体接种多少要经过实验和生产检验。细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。

摇瓶→种子罐→发酵罐

细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。摇瓶→种子罐→发酵罐霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵孢子悬浮液→一级种子罐（27℃,40小时孢子发芽，产生菌丝）→二级种子罐（27℃，10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐放线菌：生长更慢，采用四级发酵酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子一般50t发酵罐多采用三级发酵，有的也采用四级发酵如链霉素生产；确定种子罐级数需注意的问题种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。

用枯草芽孢杆菌生产杆菌肽发酵时种子扩大培养的程序级数培养条件培养时间1保藏菌种接种到4L摇瓶中18-24h2一级培养物接种到750L发酵罐中6h3750L培养物接种到6000L发酵罐中培养到形成最大生物量时46000L培养物接种到12000L生产发酵罐中培养到形成最大生物量时工业微生物培养法分为静置培养和通气培养两大类型。静置培养即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行培养。通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称好气培养法。种子培养要求一定量的种子，在适宜的培养基中，控制一定的培养条件和培养方法，从而保证种子正常生长。四、种子培养表面培养法固体培养法液体深层培养表面培养法是一种静置培养法。针对容器内培养基物态又分为液态表面培养和固体表面培养。相对于容器内培养基体积而言，表面积越大，越易促进氧气由气液界面向培养基内传递。这种方法菌的生长速度与培养基的深度有关，单位体积的表面积越大，生长速度越快。固体培养又分为浅盘固体培养和深层固体培养，统称为曲法培养。起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术。最大特点是固体曲的酶活力高。液体深层种子罐从底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。该法容易按照生产菌种对于代谢的营养要求一级不同生理时期的通气、搅拌、温度与培养基中氢离子等条件，选择最佳培养条件。五、种子质量的控制（二）影响种子质量的因素及控制培养基培养条件种龄接种量（1）营养成分适合种子培养的需要（2）易于被菌体直接吸收和利用；（4）营养成分适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高；（5）营养成分要尽可能与发酵培养基相近。种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。一般细菌的种龄一般为7～24h，霉菌种龄一般为16～50h，放线菌种龄一般为21～64h。种子培养应选择最适温度，培养过程中通气搅拌的控制很重要。接种量接种量：移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例接种量的大小与菌种特性、种子质量和发酵条件等有关。采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。

不同的微生物其发酵的接种量是不同的：制霉菌素发酵的接种量为0.1％～1％；肌苷酸发酵接种量为1.5％～2％；霉菌的发酵接种量一般为10％；多数抗生素发酵接种量为7％～15％，有时可加大到20％～25％。（二）种子质量的控制措施种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。首先必须保证生产菌种的稳定性，其次是提供种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入，以获得优良种子。因此在生产过程中通常进行以下两项检查:（1）菌种稳定性的检查（2）无（杂菌）检查（三）种子质量标准细胞或菌体生化指标产物生成量酶活力菌体形态可通过显微镜观察来确定。以单细胞菌体为种子的质量要求菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列和形态。以霉菌、放线菌为种子的质量要求是菌丝粗壮，对某些染料着色力强、生产旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况良好。种子液的糖、氮、磷含量的变化和pH值变化种子应确保无任何杂菌污染。菌种生长缓慢或过快菌丝结团菌丝粘壁（五）种子异常的分析与孢子质量和种子罐的培养条件有关。生产中通入种子罐的无菌空气温度较低或培养基的灭菌质量较差。因此生产中培养基灭菌后需取样测定其pH值，以判断培养基的灭菌质量。与搅拌效果差、接种量小有关。在种子培养过程中，由于搅拌效果不好，泡沫过多以及种子罐装料系数过小等原因，使菌丝逐步粘在罐壁上，结果使培养液中菌丝浓度减少，最后就可能形成菌丝团。用梭状芽孢杆菌进行丁酮丙酮发酵时种子扩大培养的程序级数培养条件培养基1保藏菌种接种后培养24h马铃薯葡萄糖肉汤21级培养物接种到600mL培养基中培养20-24h糖4%，（NH4）2SO45%，CaCO36%，P2O50.2%(以磷酸盐形式提供)390mL2级培养物接种到含3000mL培养基的4000mL三角瓶中同2级43级培养物接种入25000L发酵罐中糖6%，其余同2级54级培养物接种入300000-500000L生产发酵罐中，接种量为0.5%-3%同4级，发酵过程中补充氨水工业菌种扩大培养技术

种子质量的控制一、影响种子质量的因素及控制培养基培养条件种龄接种量1.培养基营养成分适合种子培养的需要选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；营养上要易于被菌体直接吸收和利用；营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高营养成分要尽可能与发酵培养基相近。2.培养条件（1）温度（2）通气量在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够的通气量可以提高种子质量。3.种龄种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。通常种龄是以处于生命力旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。4.接种量接种量：接入的种子液体积和接种后整个发酵液体积的比例。二、种子质量的控制措施必须保证生产菌种的稳定性提供种子培养的适宜环境条件，保证无杂菌侵入四.种子质量的控制措施1.

菌种稳定性的检查少量菌种--无菌生理盐水--递增稀释--平板划线培养。挑出形态整齐，孢子丰满的菌落进行摇瓶试验，测定其生产能力。

2.无菌检查种子液平板划线、斜面培养用肉眼观察是否有异常菌落、异常现象及镜检是否有杂菌。三、种子质量标准1.细胞或菌体单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐有的还要求有一定的排列或形态2.生化指标

种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化。3.产物生成量在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。4.酶活力种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。四、种子异常分析

菌种生长速度，过快或过慢菌丝结团菌丝粘壁种子扩大培养举例例一、谷氨酸生产的种子制备斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵1、斜面(AS1.299)培养基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化钠0.5

琼脂2%，pH7.0-7.2培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：32℃，生长18-24小时生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过3次2.一级种子（摇瓶）培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培养12小时。培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆2.5%，