《甘蔗叶片赤腐病抗性评价技术规程》草案

1T/CATEAXXXX—2024本文件确立了甘蔗叶片赤腐病抗病性评价技术规程，规定了术语和定义、评价程序、接种体制备、接种、病情调查及抗病性评价的要求。本文件适用于甘蔗种质材料和甘蔗品种（系）对叶片赤腐病的抗性评价。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。T/CSTC02-2023甘蔗梢腐病抗性评价技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1甘蔗叶片赤腐病sugarcaneleafredrotdisease由镰孢炭疽菌（ColletotrichumfalcatumWent）引起的发生在甘蔗叶片上的真菌病害。4评价程序甘蔗叶片赤腐病评价流程包括6个步骤，评价流程图见图1。图1甘蔗叶片赤腐病抗性评价流程2T/CATEAXXXX—20245接种体制备5.1病原菌分离评价用真菌分离培养的方法从叶片赤腐病病叶上的病原物，并用病原物的特异引物ITS1/ITS4进行PCR分子评价。叶片赤腐病病原菌的详细信息见附录A。5.2病原菌的保存用50%甘油悬浮，于-80℃超低温冰箱进行长期保存。5.3病原菌接种体制备将保存的菌株活化至PDA培养基平皿上，置于28℃培养箱培养5d，用5mm打孔器制成菌饼用于接种。6接种6.1田间自然接种6.1.1田间鉴定圃田间鉴定圃设置参照T/CSTC02-2023的要求执行。6.1.2田间试验设计每个材料挑选蔗芽饱满、一致的种芽300个于春季种植在鉴定圃中。试验采用完全随机区组设计，单行区，行长8m~10m、行距1.2m，3次重复，每个小区种植100个芽，试验区四周设置保护行。试验材料包括高感和高抗对照种，标准对照品种见附录B。6.2人工接种6.2.1室内苗期接种温室环境温度保持在27℃~33℃,湿度保持在75%~88%。采用完全随机区组设计，设置3个重复，每个材料每个重复30株苗，将待评价材料种植于桶内，每个桶内保留3株苗，试验材料包括高感和高抗标准对照品种，详见附录B。待甘蔗材料长到4叶~5叶期时，使用无菌注射器在甘蔗叶片中部中脉造成微创伤口，将菌饼贴在创伤处，用保鲜膜包裹，用PDA无菌菌饼作阴性对照。6.2.2离体叶段接种拔节初期选取长势一致的待评价甘蔗材料+1叶30片，设置3个重复，包括高感和高抗标准对照品种，详见附录B。剪取8cm~10cm整齐对称无裂痕叶段，使用无菌注射器在甘蔗叶片中部中脉造成微创伤口，将菌饼贴在创伤处，置于含有三层消毒湿润滤纸的方盘中，每个品种每个重复接种叶片放置于同一个方盘，保证相同的湿度条件，用保鲜膜将方盘密封，置于25℃~30℃光照培养箱中培养，光周期为12h光照/12h黑暗，用PDA无菌菌饼作阴性对照。7病情调查7.1调查时间3T/CATEAXXXX—20247.1.1田间自然接种在甘蔗伸长盛期7月、8月、9月，每月调查一次。7.1.2室内苗期在接种后7d~10d观察到叶片赤腐病症状，每隔24h记录发病情况，持续观察30d直至病情稳定。7.1.3离体叶段在接种后24h观察到叶片赤腐病症状，每隔24h记录发病情况，持续观察7d直至病情稳定。7.2分级标准甘蔗叶片赤腐病评价分级标准见附录C。7.3记载方法田间自然接种和室内苗期抗性评价记载方式为分别记录每个重复的总株数，用目测法统计甘蔗叶片的发病株数及每一株的病害级别，调查并记载病害级别。甘蔗叶片赤腐病田间自然接种和室内苗期抗性评价调查记载汇总表见附录D表D.1。离体叶段抗性评价记载方式为通过观察和测量病斑的长度，统计记录甘蔗叶段的病害级别。甘蔗叶片赤腐病离体叶段抗性评价调查记载汇总表见附录D表D.2。8抗病性评价8.1病情指标计算根据病情症状描述，计算发病率（IC）。发病率按式（1）计算×100....................................................................根据病情症状描述，计算病情指数（DI）。病情指数按式（2）计算。×100..............................................................式中：IC——为发病率；DI——为病情指数；S——为最高病级值；M——为发病总株数；N——为调查总株数；n——为各级病株数；s——为发病等级值。8.2抗性评价标准8.2.1田间自然接种抗性评价标准依据评价材料的最高病情指数确定抗性水平，划分标准见附录E表E.1。4T/CATEAXXXX—20248.2.2室内苗期抗性评价标准依据评价材料的最高病情指数确定抗性水平，划分标准见附录E表E.2。8.2.3离体叶段抗性评价标准依据评价材料微创伤口接种处的病害扩展程度确定抗性水平，划分标准见附录E表E.3。8.3有效性判别感病对照品种或任一评价材料的抗性类别达到感病或以上时，该批次评价有效。8.4重复评价初次评价中表现为中抗和感病的材料，用相同的病原菌进行重复评价，不同批次间评价结果不一致时，宜以最低抗性类别为准。8.5抗病性评价报告宜以单个品种单独出具，如集中批量送样，也可多个品种出一份报告。评价结果报告单见附录D表D.3，原始记录应保存完好备查。5T/CATEAXXXX—2024（资料性）甘蔗叶片赤腐病病原菌的生物学特性及分离鉴定和保存方法A.1生物学特性甘蔗叶片赤腐病病原菌为镰孢炭疽菌（Colletotrichumfalcatumwent将叶片分离到的病原菌侵染蔗茎，发现该病原菌未对蔗茎造成侵染，同时在广西田间赤腐病主要以叶片赤腐病形式存在，茎赤腐病发生较少，有研究表明叶片赤腐病分离到的病原菌不会对蔗茎造成伤害，与本研究结果一致。筛选到强致病菌株CF5，菌落呈圆形，菌丝体白色或灰色，分生孢子半月形，平均25μm×6μm，单孢，色浅，无隔膜，内含粒状物及优点，常具一个中央大液泡，分生孢子密集时呈粉红色或橙红色，分生孢子长55μm~65μm，分生孢子梗长圆形，淡色，无隔膜，着生于分生孢子盘中，在分生孢子梗中杂有刚毛。除分生孢子外，此菌还常产生能抵抗干旱和不良环境的厚垣孢子，呈墨绿色，圆形或椭圆形，含油点，多生在菌丝的顶端，脱落后即发芽入侵寄主（图A.1）。图A.1甘蔗叶片赤腐病菌的菌落和分生孢子形态A.2病原菌分离、保存与鉴定A.2.1分离A.2.1.1分离病原菌取病健交界处（病斑与健康部分的交界处）的甘蔗叶片，剪成边长为0.3cm~1.5cm大小的长方形叶片，在超净工作台中，将叶片置于0.1%升汞中灭菌30s，而后在70%的酒精溶液中浸泡30s，最后用ddH2O清洗三遍，置于灭菌滤纸上自然晾干。用镊子将3片~5片叶片置于含100μg/mL氨苄青霉素的PDA培养基上，28℃倒置暗培养3d~4d。A.2.1.2培养纯化6T/CATEAXXXX—2024待菌落长出后，挑取不同形态的菌落进行划线纯化培养，28ºC倒置培养2d~3d后，纯化3~4代，直到菌株为纯合。A.2.1.3真菌微生物的制备在无菌操作的条件下，取二代纯化后的培养平板，使用灭菌的无菌枪头挑取单个菌落边缘的真菌置于PDW液体培养基中，于28ºC摇床200rpm震荡培养5d。A.2.2菌株保存及病原菌DNA提取无菌操作条件下，吸取菌液400μL于2mL离心管中，加入等体积的50%甘油混匀，用封口膜密封，置于-80ºC保存菌株。基因组DNA使用真菌基因组试剂盒提取。A.2.3鉴定A.2.3.1病原菌分子鉴定利用特异引物ITS1/ITS4进行PCR评价（ITS15’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS45’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。PCR反应体系总体积为25μL，内含2×Taqmix12.5μL，引物（10μmol/L）各1.0μL，40ng模板DNA1μL，ddH2O9.5μL。反应结束后，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用Bio-Rad公司凝胶成像系统照相，400bp处观察到单一条带，PCR产物纯化后进行测序、比对（序列GenBank登录号：PP217426）。A.2.3.2致病性测定依据人工接种高感材料的病情指数确定菌株致病力，当病情指数达到25以上，表明菌株致病力强。抗病性评价应选取强致病力的菌株进行。取纯化后目标菌株的培养平板，无菌条件下挑取单菌落边缘菌丝接种于PDA培养基，28℃培养箱培养5d，即菌株处于生命力极旺盛的指数生长期时，用5mm打孔器制成菌饼用于接种。使用无菌注射器在甘蔗叶片中部中脉造成微创伤口，将菌饼贴在创伤处，用保鲜膜进行包裹，用PDA无菌菌饼作阴性对照。接种于易感品种中蔗9号，7d时开始记录发病情况，此后每24h调查一次，持续观察30d，直至病情稳定。7T/CATEAXXXX—2024标准对照品种B.1标准对照品种在同一试验环境下，待测材料的抗性要参照已知抗性的标准对照品种见表B.1。表B.1甘蔗叶片赤腐病抗性对照品种抗性类别对照品种高抗（HR）新台糖22号、新台糖16号抗病（R）云蔗99-596、桂糖03-351中抗（MR）CP88-1762、桂糖21号感病（S）中蔗1号、福农04-3504高感（HS）中蔗9号、中蔗6号8T/CATEAXXXX—2024甘蔗叶片赤腐病分级标准C.1甘蔗叶片赤腐病分级标准甘蔗叶片赤腐病分级标准，以每株中发病最严重的叶片为准，田间自然接种和室内苗期划分标准图见图C.1，对应症状描述见表C.1。图C.1甘蔗叶片赤腐病田间自然接种和室内苗期分级标准图表C.1甘蔗叶片赤腐病田间自然接种和室内苗期病害级别病害级别症状描述0无症状1叶片中脉出现少许红色小点或病斑2叶片中脉红色病斑蔓延至全叶五分之一3叶片中脉病斑蔓延至全叶五分之三，呈红褐色，中脉附近叶片褪绿黄化4整片叶中脉均为深红褐色病斑，部分叶片出现折断、下垂9T/CATEAXXXX—2024离体叶段划分标准图见图C.2，对应症状描述见表C.2。图C.2甘蔗叶片赤腐病离体叶段分级标准图表C.2甘蔗叶片赤腐病离体叶段病害级别病害级别症状描述0接种点出现轻微红色病斑≤1.00cm1叶片中脉红褐色病斑蔓延1.01cm~3.00cm2叶片中脉红褐色病斑蔓延3.01cm~5.00cm，叶片出现轻微褪绿黄化3叶片中脉红褐色病斑蔓延5.01cm~8.00cm，叶片褪绿面积增大4整个叶片中脉几乎均为深红褐色病斑，叶片严重褪绿，出现腐烂现象T/CATEAXXXX—2024调查记载汇总表和结果报告单D.1甘蔗叶片赤腐病田间自然接种和室内苗期抗性评价调查记载汇总表见表D.1。表D.1甘蔗叶片赤腐病田间自然接种和室内苗期抗性评价调查记载汇总表鉴定方法调查株数各级病情株数病情指数抗病性水平备注2级4级评价人员：复核人员：日期：注：在开展评价调查时，评价人员与复核人员一同进行，评价人员对评价植株病害级别进行判断，经复核人员确定后记载。D.2甘蔗叶片赤腐病离体叶段评价调查记载汇总表见表D.2。表D.2甘蔗叶片赤腐病离体叶段抗性评价调查记载汇总表离体叶片数量各级叶片数量抗病性水平备注2级4级评价人员：复核人员：日期：注：在开展评价调查时，评价人员与复核人员一同进行，评价人员对评价植株病害级别进行判断，经复核人员确定后记载。T/CATEAXXXX—2024D.3甘蔗品种（系）叶片赤腐病抗性评价结果报告单见表D.3。表D.3甘蔗品种（系）叶片赤腐病抗性评价结果报告单品种编号品种名称委托评价单位评价编号样品接收时间样品数量评价项目评价依据评价结果评价地点评价依据评价方法非自然接种的接种体组成种植日期接种日期调查日期病情指数/病斑长度抗病性水平结论备注制表人：审核人：批准人：日期：注：评价结果报告应盖评价单位公章，应有制表人、审核人和批准人签字。T/CATEAXXXX—2024抗性评价标准E.1田间自然接种抗性评价标准见表E.1。表E.1田间自然接种抗性评价标准抗性级别发病率(IC)病情指数(DI)抗性类别00<IC≤20%0<DI≤10高抗（HR）120<IC≤35%10<DI≤20抗病（R）235<IC≤50%20<DI≤35中抗（MR）350<IC≤70%35<DI≤50感病（S）4高感（HS）E.2室内苗期抗性评价标准见表E.2。表E.2室内苗期抗性评价标准抗性级别病情指数(DI)抗性类别00<DI≤5高抗（HR）15<DI≤10抗病（R）210<DI≤15中抗（MR）315<DI≤25感病（S）4高感（HS）注：苗期接种发病率100%，以病情指数进行抗性评价。E.3离体叶段抗性评价标准见表E.3。表E.3离体叶段抗性评价标准抗性级别症状描述（病斑长度）抗性类别0接种点出现轻微红色病斑≤1.00cm高抗（HR）1红褐色病斑蔓延（病斑晕圈沿中脉方向长度1.01cm~3.00cm）抗病（R）2红褐色病斑蔓延，叶片出现轻微褪绿黄化（病斑晕圈沿中脉方向长度3.01cm~5.00cm）中抗（MR）3红褐色病斑蔓延，叶片褪绿面积增大（病斑晕圈沿中脉方向长度5.01cm~8.00cm）感病（S）4整个叶片中脉几乎均为深红褐色病斑，叶片严重褪绿，出现腐烂现象（病斑晕圈沿中脉方向长度>8.01cm）高感（HS）T/CATEAXXXX—2024参考文献[1]《中华人民共和国农产品质量安全法》2022年修订.[2]AbbottE.PhysiologicformsofColletotrichumfalcatumWent.Phytopathology,1933,23,557-559.[3]李婕,张荣跃,王晓燕,