微生物基因工程培训讲义

微生物基因工程

李刚副教授微生物基因工程培训讲义第1页教学内容一、PCR引物设计与试验操作技巧；

二、基因组文库建立与筛选；

三、定向进化技术在微生物酶制剂研究中应用；

四、原核表示系统选择和高效表示策略；五、真核表示系统选择和高效表示策略。微生物基因工程培训讲义第2页四、原核表示系统选择和高效表示策略

原核生物表示系统主要包含：

大肠杆菌表示系统、枯草芽孢杆菌表示系统、链霉菌表示系统等,其中应用最广泛是大肠杆菌表示系统。微生物基因工程培训讲义第3页原核表示系统优点1、细菌培养操作简单、生长繁殖快、价格低廉；2、外源基因表示产物水平高(如大肠杆菌中目标蛋白表示量可超出细菌总蛋白量80%)；3、基因背景和表示特征清楚。微生物基因工程培训讲义第4页大肠杆菌表示系统自20世纪70年代以来,大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛表示系统。尤其是进入后基因组时代以来,相关蛋白结构以及功效研究开展,对基因表示要求更高,这时大肠杆菌往往是表示第一选择。微生物基因工程培训讲义第5页大肠杆菌表示系统优缺点优点：大肠杆菌含有培养条件简单、生长繁殖快、安全性好、能够高效表示不一样外源基因产物等特点,是许多外源基因表示系统中最好一个,是当前研究最深入、发展也最完善表示系统,大量有价值多肽和蛋白质已在大肠杆菌中取得了超量表示。缺点：大肠杆菌表示体系与其它表示体系相比,也含有一些缺点:①高效表示易形成包涵体。②不能进行翻译后加工修饰,如糖基化、磷酸化及酰基化等。微生物基因工程培训讲义第6页大肠杆菌表示系统操作流程

大肠杆菌表示系统操作普通程序以下：

取得目标基因－准备表示载体－将目标基因插入表示载体中（测序验证）－转化表示宿主菌－诱导靶蛋白表示－表示蛋白分析－扩增、纯化、深入检测。微生物基因工程培训讲义第7页大肠杆菌表示系统基本概念首先讲述一些大肠杆菌表示基本概念：一个完整表示系统通常包含配套表示载体和表示菌株，假如是特殊诱导表示还包含诱导剂，假如是融合表示还包含纯化系统或者Tag检测等等。选择表示系统通常要依据试验目标来考虑，比如表示量高低，目标蛋白活性，表示产物纯化方法等等。主要归结在表示载体选择上。表示载体：我们关心质粒上元件包含开启子，多克隆位点，终止密码，融合Tag（假如有话），复制子，筛选标识/汇报基因等。通常，载体很贵，我们能够经过试验室之间交换得到无偿载体。不过要小心，辗转多个试验室和多个试验室组员之手载体是否保持原来遗传背景？MCS是否还是原来那个MCS？是我们要尤其注意。

微生物基因工程培训讲义第8页大肠杆菌表示系统基本概念复制子：通常表示载体都会选取高拷贝复制子。pSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，pCoE1，pMBI(pUC)类复制子拷贝数高达500以上，是表示载体惯用。通常情况下质粒拷贝数和表示量是非线性正相关，当然也不是越多越好，超出细胞承受范围反而会损害细胞生长。假如恰巧需要2个质粒共转化，就要考虑复制元是否相容问题。

筛选标识和汇报基因：氨苄青霉素抗性是最常见筛选标识，卡那霉素或者是新霉素次之，四环素，红霉素和氯霉素等已经日渐式微。抗性基因选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留心抗性基因编码酶是否和代谢物相互作用。在表示筛选中要注意问题应该就是LB倒板前加抗生素温度，温度过高轻易造成抗生素失效。今天耐青霉素超级细菌泛滥，不知道是否有我们试验人员功劳呢？大家“随便倒掉”已经取得氨苄抗性大肠杆菌之前有没有经过煮沸或者消毒等处理呢？从以前一针50万单位到现在100多万个单位，青霉素剂量似乎越来越大了。

微生物基因工程培训讲义第9页大肠杆菌表示系统基本概念对于做表示来说，假如不是要研究开启子强弱，通常比较少关心或者用到汇报基因吧。绿色荧光蛋白是最惯用汇报基因了（注意选择适用原核表示版本GFP），其它还有半乳糖苷酶，荧光素酶等等。一些融合表示Tag也有汇报基因功效。

开启子、终止子和核糖体结合位点：

开启子：开启子强弱是对表示量有决定性影响原因之一。从转录模式上看有组成型表示和诱导调控型表示。lac和Tac，PL和PR，T7是最惯用开启子。

转录终止子对外源基因在大肠杆菌中高效表示有主要作用——控制转录RNA长度提升稳定性，防止质粒上异常表示造成质粒稳定性下降。放在开启子上游转录终止子还能够预防其它开启子通读，降低本底。转录终止子有两类，分别是Rho因子作用下使mRNA转录终止终止子和依据模版上对称序列形成发夹结构而终止mRNA转录终止子。常见是rrnB

、rRNA操纵子T1T2串连转录终止子。

微生物基因工程培训讲义第10页大肠杆菌表示系统基本概念

核糖体结合位点：开启子下游从转录起始位点开始延伸一段碱基序列，其中能与rRNA16S亚基3'端互补SD序列对形成翻译起始复合物是必需，多数载体开启子下游都有SD序列，也有些载体没有，适合自带SD序列基因表示，要留心。

微生物基因工程培训讲义第11页大肠杆菌表示系统几个表示方式组成型表示：表示载体开启子为组成型开启子，也就是一直努力不停表示目标蛋白开启子，如pMAL系统。连续性表示通常表示量比较高，成本低，不过不适合表示一些对宿主细菌生长有害蛋白。因为过量或者有害表示产物会影响细菌生长，反过来影响表示量积累。

诱导调控型表示：表示载体采取诱导型开启子，只有在诱导剂存在条件下才能表示目标产物。这种方法有利于防止菌体生长前期高表示对菌体生长影响，又可降低菌体蛋白酶对目标产物降解。尤其适合处理有毒蛋白表示。另外也有开启子是组成型，不过开启子所依赖转录酶是诱导表示，也属于诱导表示系统。

微生物基因工程培训讲义第12页大肠杆菌表示系统几个表示方式融合表示：表示载体多克隆位点上有一段融合表示标签（Tag），表示产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表示），方便后继纯化步骤或者检测。对于尤其小分子提议用较大Tag（如GST）以取得稳定表示；而普通基因多项选择择小Tag以降低对目标蛋白影响。His-Tag是最广泛采取Tag。

分泌表示：在起始密码和目标基因之间加入信号肽，能够引导目标蛋白穿越细胞膜，防止表示产物在细胞内过分累积而影响细胞生长，或者形成包涵体，而且表示产物通常是可溶活性状态，不需要复性。通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞壁之间周质空间。

可溶性表示：大肠杆菌表示效率很高，尤其是强开启子，目标蛋白来不及折叠而形成不溶包涵体颗粒，包涵体轻易纯化不过复性效率不高。分泌表示能够得到可溶产物，也有部分融合Tag有利于提升产物可溶性，比如Thio，pMAL系统。微生物基因工程培训讲义第13页提升大肠杆菌表示系统重组蛋白可溶性策略大致有八种策略：（1）在细胞中表示分子伴侣（天然或异源），辅助新生肽链折叠，防止肽链相互聚合（比如TakaraChaperoneplasmidSet）；（2）共表示折叠酶，催化共价键形成；（3）经过降低培养温度和摇床速度来降低蛋白合成速度，以降低有聚合倾向中间体浓度；（4）选择中等强度或低强度开启子代替强开启子，降低重组蛋白合成速度；（5）选择适合宿主菌株；（6）表示含可溶性多肽或信号肽重组蛋白，提升可溶性；（7）蛋白质可溶性往往与本身氨基酸序列相关，所以可利用诱突技术改变其氨基酸序列，提升目标蛋白可溶性；（8）诱导过程中加入化学物质，以增加渗透压或改变培养基pH值。微生物基因工程培训讲义第14页大肠杆菌表示系统中几个惯用开启子最早应用于大肠杆菌表示系统是Lac乳糖操纵子，由开启子Plac、操纵基因lacO和结构基因组成。其转录受CAP正调控和lacI负调控。lacUV5突变能够在没有CAP存在下更有效地起始转录，该开启子在转录水平上只受lacI调控，因而随即得到了更广泛采取。lacI产物是一个阻遏蛋白，能结合在操纵基因lacO

上从而阻遏转录起始。乳糖类似物IPTG能够和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录。这种可诱导转录调控成为了大肠杆菌表示系统载体构建惯用元件。微生物基因工程培训讲义第15页大肠杆菌表示系统中几个惯用开启子tac开启子是trp开启子和lacUV5拼接杂合开启子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。trc开启子是trp开启子和lac开启子拼合开启子，一样含有比trp更高转录效率和受lacI阻遏蛋白调控强开启子特征。在常规大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表示量不高，仅能满足细胞本身lac操纵子，无法应付多拷贝质粒需求，造成非诱导条件下较高本底表示，为了让表示系统严谨调控产物表示，能过量表示lacI阻遏蛋白lacIq突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表示系统表示菌株。微生物基因工程培训讲义第16页大肠杆菌表示系统中几个惯用开启子现在Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq基因，以表示更多lacI阻遏蛋白实现严谨诱导调控。IPTG广泛用于诱导表示系统，不过IPTG有一定毒性，有些人认为在制备医疗目标重组蛋白并不适当，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物研究。另外一个研究方向是用lacI温度敏感突变体，30度下抑制转录，42度开启转录。热诱导不用添加外来诱导物，成本低，不过因为发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会造成大肠杆菌热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物稳定。

微生物基因工程培训讲义第17页大肠杆菌表示系统中几个惯用开启子以λ噬菌体载体转录开启子PL、PR构建载体也为大家所熟悉。这两个强开启子受控于λ噬菌体cI基因产物。cI基因温度敏感突变体cI857(ts)经常被用于调控PL、PR开启子转录。一样也是30度下阻遏开启子转录，42度下解除抑制开发转录。一样，PL、PR

表示载体需要携带cI857(ts)菌株作为表示载体，现在更常见做法是在载体上携带cI857(ts)基因，所以能够有更大宿主选择范围。另外一个思绪是经过严谨调控cI产物来间接调控PL、PR开启子转录。比如InvitrogenPL表示系统，就是将受trp开启子严谨调控cI基因溶源化到宿主菌染色体上，经过加入酪氨酸诱导抑制trp开启子，抑制cI基因表示，从而解除强大PL开启子抑制。

微生物基因工程培训讲义第18页大肠杆菌表示系统中几个惯用开启子T7开启子是当今大肠杆菌表示系统主流，这个功效强大兼专一性高开启子经过巧妙设计而成为原核表示首选，尤其以Novagen企业pET系统为出色代表。强大T7开启子完全专一受控于T7

RNA聚合酶，而高活性T7RNA聚合酶合成mRNA速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍——当二者同时存在时，宿主本身基因转录竞争不过T7表示系统，几乎全部细胞资源都用于表示目标蛋白；诱导表示后仅几个小时目标蛋白通常能够占到细胞总蛋白50%以上。因为大肠杆菌本身不含T7

RNA聚合酶，需要将外源T7RNA聚合酶引入宿主菌，因而T7RNA

聚合酶调控模式就决定了T7系统调控模式——非诱导条件下，能够使目标基因完全处于缄默状态而不转录，从而防止目标基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性影响；经过控制诱导条件控制T7RNA聚合酶量，就能够控制产物表示量，一些情况下能够提升产物可溶性部分。

微生物基因工程培训讲义第19页惯用几个大肠杆菌表示系统1、GE（原安玛西亚）-pGEX系列，特点：使用该系列载体能够很方便进行下一步重组蛋白纯化。

微生物基因工程培训讲义第20页GE（原安玛西亚）-pGEX系列微生物基因工程培训讲义第21页Invitrogen-Champion™pETExpressionSystem等四个系列比起其它企业原核表示系列来说Invitrogen有个非常突出地方就是它重组克隆技术。像之前Novagen大部分载体都是用传统酶切、链接方式做重组质粒，不过Invitrogen表示系统大量利用了它TOPO技术和Gateway技术。Invitrogen企业总共有四个原核表示系统它们分别是：Champion™pETExpressionSystem、HisPatchThioFusionSystem、pBADInducibleBacterialSystem、pLSystem和T7-basedSystems。这四个系列载体可谓把原核表示发展史中出现过几个开启子都囊括进去了，包含T7、pL、pBAD和trc开启子，同时几个经典调控方式也都出现了，包含有乳糖操纵子、色氨酸操纵子和阿拉伯糖操纵子。Champion™pETExpressionSystem之所以取了个冠军系统称号是因为它结合了经典T7表示系统和Invitrogen王牌定向TOPO技术及Gateway技术，这可谓是强强联手。

微生物基因工程培训讲义第22页微生物基因工程培训讲义第23页微生物基因工程培训讲义第24页InvitrogenpET100/D-TOPO载体图谱微生物基因工程培训讲义第25页Novagen企业-pET表示载体序列Novagen企业（Merck子企业）出品了各种原核表示载体系列，其中pET系列载体是当前应用最为广泛原核表示系统，已经成功地在大肠杆菌中表示了各种各样异源蛋白。pET系列载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表示载体。微生物基因工程培训讲义第26页Novagen企业pET表示载体系列pETVectorswithuniquefeaturesinclude:pET-31b(+)forhighyieldbioproductionofpeptidesandsmallproteinspET-32a-cforproductionofsoluble,activetargetproteinsinE.coli

pET-33bforproductionoftargetproteinssuitableforsite-specific32P-labelingpET-39band40busingDsbtagsforexportandperiplasmicfoldingoftargetproteinspET-41a-cand42a-cwithpopularGSTfusiontagsforenhancedproductionandsolubilitypET-43.1a-cdesignedforcloningandhigh-levelexpressionofpolypeptidesequencesfusedwiththe495aaNusA(Nus•Tag™)proteinpET-44a-cwithNus•Tag™sequenceplusN-andC-terminalHis•TagsequencespET-45b(+)withamino-terminalHis•Tag™sequenceandminimalextraneoussequencespET-46Ek/LICpreparedvectorforligation-independentcloning,withamino-terminalHis•Tag™sequencepET-47b(+)throughpET-50b(+)withHRV3CProteasecleavagesiteforefficientfusiontagremovalAdditionalvectorsinthistableinclude:pLacIpLysEandpLysS微生物基因工程培训讲义第27页Novagen企业PET32a表示载体图谱微生物基因工程培训讲义第28页Novagen企业pET表示载体选择从开始包括表示时候能够依据是否要用基因本身起始密码子进行选择，Novagen企业仅提供三个载体：pET-21(+)，pET-24(+)和pET-23(+)。假如你打算利用载体起始密码子，那么就有许多项选择择。依据是否要可溶性表示，选择加有不一样标识载体。普通说来在大肠杆菌中不加标识外源蛋白都会以不溶包涵体形式表示。为了让外源蛋白融合表示普通说来有三个策略：1.与一个高度可溶多肽联合一起表示，比如：谷胱甘肽S转移酶（glutathioneStransferase,GST）、硫氧还蛋白（thioredoxin,Trx）和N利用底物A蛋白（NutilizationsubstanceA,NusA）。2.转入一个酶催化二硫键形成，如：硫氧还蛋白，DsbA，DsbC。3.插入一个定位到周质空间信号肽序列。以上载体都是采取抗生素抗性筛选，假如你希望用蓝白斑筛选能够使用pETBlue系列载体。在重组技术上，Novagen除了传统酶切、连接方式外，还有不需要连接克隆方式：Ligation-Independentcloning，简称LIC。采取LIC方法pET载体是线性化，在末端有12-15个突出碱基以在退火时和目标片断互补。在设计PCR扩增引物时加入与LIC载体互补序列，PCR产物用3’→5’内切酶消化出单链与载体互补序列。经过这种方式就能够把目标片断定向、高效地插入LIC载体上。微生物基因工程培训讲义第29页Novagen企业大肠杆菌菌株选择Novagen提供各种表示使用菌株，为了提升表示量做出了各种改造，它们大致分为以下几个种类：1.蛋白酶缺点型全部B菌株衍生株都是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺点型，这包含有B834,BL21,BLR,Origami™B,Rosetta™和Tuner™。所以在纯化时能够保持蛋白稳定不被降解。BL21(DE3)是应用最多表示表示菌株。另外它衍生株BLR(DE3)是recA－，RecA是大肠杆菌中介导同源重组主要蛋白之一。它缺失，能够确保质粒稳定。2.确保全部细胞以一样量进行表示Tuner™株及它衍生株（Origami™B和Rosetta™）是BL21菌株lacY1缺失突变型，在这些菌株中能够使蛋白以一样水平在全部细胞中表示。Lac渗透酶突变使进入每个细胞IPTG量都是一致，这么使蛋白表示浓度能够伴随IPTG浓度而改变。经过对IPTG浓度控制能够使细胞微量表示或者大量表示。普通说来，低浓度表示有利于蛋白可溶性和活性。微生物基因工程培训讲义第30页Novagen企业大肠杆菌菌株选择3.二硫键形成与溶解性增强二硫键形成对一些蛋白可溶性起到主要作用，而Novagen也专门设计了一些菌株是谷胱甘肽还原酶（gor）和/或硫氧还蛋白还原酶（trxB）缺点型，包含AD494，BL21trxB，Origami，OrigamiB和Rosetta-gami™。在这些菌株中表示蛋白，能够更大程度促进二硫键形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出现可能增加。4.稀有密码子补给不一样物种有不一样密码子偏爱性，假如外源蛋白中含大量大肠杆菌稀有密码子，尤其当这些稀有密码子呈连续分布时候，就会造成蛋白表示量极低，或者翻译提前终止。Rosetta™是为了表示真核蛋白而尤其设计，它含有大肠杆菌稀有密码子tRNA，包含AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA。它们以氯霉素抗性质粒形式存在。Rosetta系列是来自BL21lacY1，所以它含有BL21lacY1全部特征。5.硒蛋氨酸标识B834是起源于BL21蛋氨酸（met）营养缺点型菌株。它在高度特异活性35S-met标识和晶体成像蛋氨酸标识中非常有用。微生物基因工程培训讲义第31页原核表示需要考虑问题在原核蛋白表示过程中，选择构建一个适当原核表示体系需要综合考虑3大原因：表示载体、宿主菌株、表示诱导条件,以取得最满意表示效果。微生物基因工程培训讲义第32页大肠杆菌表示系统高效表示策略1、采取高强度开启子-如T7开启子；2、将目标基因全部密码子都换成大肠杆菌偏好密码子（需要重新合成基因），或采取含有大肠杆菌稀有密码子tRNA

Rosetta系列菌株。3、采取丰富培养基（如TB）代替普通LB培养基；4、优化大肠杆菌生长条件和目标基因诱导表达条件。微生物基因工程培训讲义第33页使用pET表示系统常见问题分析

几个常见问题以下表：微生物基因工程培训讲义第34页原核表示常见几个问题及回答（1）1、目标蛋白总是以不可溶形式出现。处理方法：采取以下八种策略提升目标蛋白可溶性。微生物基因工程培训讲义第35页提升大肠杆菌表示系统重组蛋白可溶性策略大致有八种策略：（1）在细胞中表示分子伴侣（天然或异源），辅助新生肽链折叠，防止肽链相互聚合；（2）共表示折叠酶，催化共价键形成；（3）经过降低培养温度和摇床速度来降低蛋白合成速度，以降低有聚合倾向中间体浓度；（4）选择中等强度或低强度开启子代替强开启子，降低重组蛋白合成速度；（5）选择适合宿主菌株；（6）表示含可溶性多肽或信号肽重组蛋白，提升可溶性；（7）蛋白质可溶性往往与本身氨基酸序列相关，所以可利用诱突技术改变其氨基酸序列，提升目标蛋白可溶性；（8）诱导过程中加入化学物质，以增加渗透压或改变培养基pH值。微生物基因工程培训讲义第36页原核表示常见几个问题及回答（2）2、必须去除融合多肽或蛋白质标签才能使目标蛋白取得活性吗？回答：大多数情况下目标蛋白带有His-Tag,S-Tag,11个氨基酸T7-Tag或HSV-Tag等小肽时仍能表现出完全活性。这些肽段都较为亲水，理论上都不会干扰蛋白三维结构。我们提议首先测试蛋白活性，再看是否一定要去除前导序列才能适合特定应用要求。微生物基因工程培训讲义第37页原核表示常见几个问题及回答（3）3、假如目标蛋白包含信号序列，它会不会被运至细胞周质并以可溶、活性形式存在？还是目标蛋白甚至能够被分泌到生长培养基中？回答：假如目标蛋白包含ompT或pelB这么前导序列，理论上它应该被运至细胞周质并以可溶、活性形式存在。假如在生长培养基中发觉目标蛋白话，多半是因为细胞壁受到破坏，而并不代表蛋白是被分泌到培养基中。除了信号肽对蛋白质运输有影响，现在发觉蛋白质成熟区对蛋白质运转也有影响。所以在细胞质、细胞周质及其它区域发觉目标蛋白都很正常。一些情况下降低诱导时培养温度至25-30℃，可能提升蛋白运输百分比。微生物基因工程培训讲义第38页原核表示常见几个问题及回答（4）4、IPTG诱导后细胞停顿了生长，是不是表示细胞死了？回答：T7RNA聚合酶非常活跃，T7转录和翻译信号极强，所以，一旦诱导，细胞主要生理活动都向着目标蛋白表示方面转化。在通常情况下，细胞将停顿生长，形成克隆能力大大降低，但并未死亡。菌落形成试验能够用来检测表示系统性能。但也有一些例外情况，比如尤其目标基因以及一些极为严紧载体/宿主菌组合(比如含有plysE宿主菌)等，这时在诱导后菌落还是会继续生长。微生物基因工程培训讲义第39页原核表示常见几个问题及回答（5）5、除了毒性和降解，还有些什么原因会影响目标蛋白表示水平？回答：（1）mRNA转录子中二级结构会干扰AUG翻译起始密码子和/或核糖体结合位点。全部pET载体转录产物都是以下两种之一：RbsNdeI/NcoI5’…AAGAAGGAGAUAUACAUAUG…3’5’…AAGAAGGAGAUAUACCAUGG…3’假如发觉表示很差，