马驽巴贝斯虫病检疫技术规范

2马驽巴贝斯虫病检测PCR法本文件规定了马驽巴贝斯虫PCR法和实时荧光PCR检测方法。本文件适用于马属动物马驽巴贝斯虫病的分子生物学诊断。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样SN/T1193基因分析检测实验室技术要求3术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本文件。3.1术语和定义3.1.1马驽巴贝斯虫病马驽巴贝斯虫病属于马梨形虫病的一种，是寄生于马、驴、骡、斑马等马属动物红细胞内的血液原虫引起。蜱虫是该病最主要的中间宿主，也是马驽巴贝斯虫病的主要传播者。该病临床表现为体温升高、精神沉郁、肌肉振颤、呼吸和脉搏加速等症状，慢性病例耐过后体内会长期带虫，急性病例严重时会发生死亡。3.1.2PCRPolymerasechainreaction，聚合酶链式反应3.1.3Realtime-PCRReal-timepolymerasechainreaction，实时荧光聚合酶链式反应3.1.4DNADeoxyribonuleicacid，脱氧核糖核酸3.1.5BpBasepair，碱基对3.1.6Taq3Hermusaquaticu，水生栖热菌3.1.7DNTPsdATP（deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidinetriphosphate，脱氧胸腺三磷酸）、dCTP（deoxycytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dGTP（deoxyguanosinetriphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）3.1.8Ct值Cyclethreshold，循环阈值3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。3.2.1FAM（6-carboxyfluorescein）6-羧基荧光素3.2.2TAMRA（6-carboxytetramethylrhodamine）6-羧基四甲基罗丹明4试剂和材料4.1丙酮。4.2蛋白酶K溶液用双蒸水溶解为10mg/mL的溶液，分装后于-20℃保存。4.32%CTAB裂解液称取2gCTAB，10mL1M的Tris-HCL（pH=8.0），4mL0.5M的EDTA（pH=8.0），25mL5MNaCl，加双蒸水定容至100mL，高压蒸汽灭菌后，室温下放置待用。4.40.5%SDS称取0.5gSDS溶于100mL双蒸水中加热搅拌至完全溶解，室温下保存待用。4.5酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）称取250mL苯酚平衡液，240mL氯仿，10mL异戊醇，充分混匀后，置于踪色瓶中，-4℃避光保存待用。4.610%醋酸钠称取1g醋酸钠，溶于100mL去离子水中，充分混匀后，室温下保存待用。4.7饱和氯化钠溶液称取400gNaCl加热溶解于1000mL蒸馏水中，等却待用。44.8无水乙醇。4.9TE缓冲液。4.10PCRbuffer。4.11dNTP（2.5mmol/L）。4.12Taq酶(-20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。)4.13DNA分子量文件（DNAMarker）(50bp～500bp)。4.14琼脂糖(电泳纯)。4.15电泳缓冲液Tris54g，硼酸27.5g，0.5mol/LTE缓冲液（pH8.0）20mL，加蒸馏水至1000mL；使用时10倍稀释。4.16EB替代染料。4.17实时荧光PCR预混液。4.18引物及探针:见表1。表1马驽巴贝斯虫病检测引物及探针检测方法引物/探针序列（5’-3’）扩增片段普通PCR法上游引物（F）5’-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3’200bp下游引物（R）5’-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3’实时荧光PCR法上游引物（F）5’-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3’200bp下游引物（R）5’-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3’探针（P）FAM-TGAGGCTAAGTACCAACCGCTG-TAMRA5仪器设备5.1PCR仪。5.2实时荧光PCR检测系统。5.3恒温水浴锅。5.4核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。5.5高速台式冷冻离心机（最高转速12000rpm以上）。5.6冰箱（2℃~8℃和-20℃)。55.7微量加样器：1μL～10μL，100μL，200μL，1000μL。5.8pH计。5.9天平。6样品采集使用添加抗凝剂的试管无菌采集血样。7检测方法7.1PCR法7.1.1样品的总DNA提取采用CTAB提取法(见附录A)或相关商品化试剂盒提取。7.1.2PCR扩增反应体系体积为50μL，体系组成见表2。表2普通PCR扩增反应体系组成-5522-2-PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火延伸1min，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。7.1.3PCR扩增产物电泳检测用TBE电泳缓冲液配制成1.5%琼脂凝胶。将琼脂凝胶放入电泳槽中，加入1×TBE电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5μL～8μLPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合点样。9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。利用凝胶成像系统观察电泳结果并记录。7.1.4结果判定与表述7.1.4.1结果判定6对照结果阳性对照:出现200bp的PCR扩增产物。阴性对照:不出现200bp的PCR扩增产物。空白对照:不出现200bp的PCR扩增产物，否则试验无效。样品成分在同时进行的阳性、阴性和空白对照实验结果正常的情况下，检测实际样品,被检样品出现200bpPCR扩增产物为阳性；被检样品不出现200bpPCR扩增产物为阴性。7.1.4.2结果表达PCR产物为阳性者，表述为马驽巴贝斯虫病PCR检测核酸阳性。PCR产物为阴性者，表述为马驽巴贝斯虫病PCR核酸检测阴性。7.2实时荧光PCR法7.2.1样品的总DNA提取同7.1.1操作。7.2.2实时荧光定量PCR反应体系体积为25μL，体系组成见表3。表3实时荧光PCR扩增反应体系组成-111-2-反应条件：95℃预变性10min；95℃变性15s，58℃退火延伸1min，45个循环。在每次循环退火时收集荧光信号。检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。7.2.3结果判定与表述7.2.3.1结果判定对照结果阳性对照:检测结果Ct≦35.0，且有典型扩增曲线。阴性对照:检测结果Ct≧40.0，无典型扩增曲线。7空白对照:检测结果Ct≧40.0，无典型扩增曲线。否则,任一种对照如果出现非上述正常结果，试验无效。7.2.3.2结果判断和表述样品检测结果Ct≧40.0，同时各实验对照结果正常，可以判断样品检测结果为阴性，表述为马驽巴贝斯虫病实时荧光PCR检测核酸阴性。样品检测结果Ct≦35.0，同时各实验对照结果正常，可以判断样品检测结果为阳性，表述为马驽巴贝斯虫病实时荧光PCR检测核酸阳性。样品检测结果35.0<Ct<40.0并出现典型扩增曲线，同时各实验对照结果正常，此时应适当增加DNA模板量后重做实时荧光PCR检测。再次检测结果仍然Ct<40.0并出现典型扩增曲线，同时各实验对照结果正常，可以判断样品核酸检测阳性，表述为马驽巴贝斯虫病实时荧光PCR检测核酸阳性；再次检测结果Ct≧40.0，同时各实验对照结果正常，可以判断样品核酸检测阴性，表述为马驽巴贝斯虫病实时荧光PCR检测核酸阴性。8检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193执行。9废弃物处理检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。8DNA提取步骤在样品中加入20μL蛋白酶K、800μL2%CTAB裂解液、50μL0.5%SDS，充分振荡混匀后置于55℃水浴锅中2h，每半小时取出摇匀一次。12000rpm离心5min后，小必吸取上清移至一新的离心管中，加入等体酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），充分振荡混匀，10000rpm离心10min，吸取上清移至一新的离心管中。再加入等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），直至管中下层有机相与上层水相之间无白色沉淀。吸取上清移至一新的离心管中，加入0.1倍体积10%的醋酸钠溶液，充分振荡混匀后，再加入1.5倍体积预冷无水乙醇，混匀后置于-20℃冰箱中2h。10000rpm离心10min，弃上清，加入适量的70%乙醇洗沉淀，10000rpm离心3min，弃上清，室温静置晾干残留的乙醇。加30条件下保存待用。9（规范性）DNA扩增片