第2章 细胞工程（知识清单）期中考点大串讲

学而优·教有方PAGEPAGE1第二章细胞工程第一节植物细胞工程一、植物细胞工程的基本技术（一）细胞工程概念：细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平上的操作，有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性生物工程。①原理方法：细胞生物学、分子生物学和发育生物学；②操作水平：细胞器、细胞或组织水平；③目的：得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品；④分类：植物细胞工程、动物细胞工程。（二）植物细胞的全能性1．概念：细胞经分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。2.在生物生长发育过程中，并不是所有细胞都表现出全能性，比如：芽原基的细胞发育为芽，叶原基的细胞发育为叶。这是因为在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性地表达。3.是否表现出全能性的判断标准：细胞经分裂和分化后是否产生完整生物体。4.细胞具有全能性的原因（物质基础）：一般来说，生物体的细胞中都含有该物种的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所需的全部遗传信息。5.生物体生长发育过程中细胞不表现全能性的原因（不离体的细胞无法表现出全能性的原因）：在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性地表达（从而形成生物体的不同组织和器官）。6.是不是所有的活细胞都具有全能性？不是，例如哺乳动物成熟的红细胞、植物成熟的筛管细胞。7.细胞具有的全能性一定能表现出来吗？不是，例如动物的体细胞。8.比较一般情况下下列细胞全能性的大小(1)受精卵＞生殖细胞＞体细胞(2)分化程度低的细胞＞分化程度高的细胞、(3)分裂能力强的细胞＞分裂能力弱的细胞(4)植物细胞＞动物细胞(5)幼嫩的细胞＞衰老的细胞9.以下例子哪些能够表现出了细胞的全能性：（1）（3）（4）（6）（7）(1)利用菊花茎段培养获得试管苗。(2)芽原基的细胞发育为芽，叶原基的细胞发育为叶。(3)受精卵发育成个体。(4)蜜蜂的孤雌生殖中，卵细胞直接发育成雄蜂。(5)造血干细胞可分化形成多种血细胞。(6)通过花药离体培养，获得单倍体幼苗。(7)胚胎干细胞可分化发育成为各种组织器官的细胞。(8)种子发育成完整植株。（三）植物组织培养技术1．植物组织培养概念：将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。2.离体培养的植物器官、组织或细胞被称为外植体。3.植物组织培养的原理：植物细胞的全能性。植物组织培养的生殖方式：无性生殖。植物组织培养的分裂方式：有丝分裂。4.菊花植物组织培养（1）菊花植物组织培养的原理①植物细胞一般具有全能性；②脱分化：在一定的激素和营养等条件的诱导下，让已经分化的细胞经过诱导后，失去其特有的结构和功能，转变成未分化细胞的过程。结果：形成愈伤组织。③愈伤组织的特点：不定形的薄壁组织团块。一般不需要光照。此过程中涉及的生命活动只有细胞增殖（有丝分裂），没有细胞分化。④再分化：脱分化产生的愈伤组织，在一定的培养条件下，再分化出芽、根等器官，进而形成完整的小植株。需要给予适当时间和强度的光照，诱导叶绿素的合成，使试管苗能够进行光合作用。此过程中涉及的生命活动既有细胞增殖（有丝分裂），又有细胞分化。再分化实质：基因的选择性表达。⑤激素的作用：植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。它们的浓度、比例等都会影响植物细胞的发育方向；生长素用量与细胞分裂素用来的比值结果比值高有利于根的分化，抑制芽的形成比值低有利于芽的分化，抑制根的形成比值适中促进愈伤组织的形成（2）选材：经常选择根尖（分生区）、茎的韧皮部（形成层）等。原因：分裂能力强、分化程度低，容易诱导形成愈伤组织。（3）操作流程：①外植体的消毒：将流水冲洗后的外植体用酒精消毒30s，用无菌水清洗2～3次后，再用次氯酸钠溶液处理30min，用无菌水清洗2～3次。若想缩短次氯酸钠溶液处理时间应适当提高次氯酸钠溶液的浓度。②外植体的分割：用无菌滤纸吸去表面的水分，用解剖刀将外植体切成0.5～1cm长的小段。大小应适宜。③接种：在酒精灯火焰旁，并且实验中使用的培养基和所有的器械及每次使用后的器械都要灭菌，将外植体的1/3～1/2插入诱导愈伤组织的培养基中。用封口膜或瓶盖封盖瓶口，并在培养瓶上做好标记。接种时注意外植体的方向，不要倒插。④培养：将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于18～22℃的培养箱中培养。定期观察和记录愈伤组织的生长情况。诱导愈伤组织期间一般不需要光照，在后续的培养过程中，每日需要给予适当时间和强度的光照。⑤转移培养（再分化过程）：培养15-20d后，将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上。长出芽后，再将其转接到诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试管苗。⑥移栽：试管苗不可以直接移栽入土，需先打开封口膜或瓶盖，让试管苗在培养箱内生长几日，将试管苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩上，壮苗后再移栽入土。（4）若培养物取自植物的幼茎、叶片等含有叶绿体的部位，愈伤组织中是否会含有叶绿体？为什么？愈伤组织中不含有叶绿体；培养物经过诱导后，失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞，因此，愈伤组织中不含有叶绿体。（5）植物组织培养中细胞表现出全能性的条件①离体（最关键）。②严格的无菌条件。③适宜的培养条件。④适宜浓度和比例的激素。⑤一定的营养条件。（6）为什么一定要离体才能表现出全能性？若细胞不离体，细胞中的基因会选择性地表达，从而形成生物体的不同组织和器官，不能表现出全能性。（7）如何控制严格的无菌条件？①用体积分数为70%的酒精对手、超净工作台、外植体进行消毒,对外植体处理还需要质量分数为5%左右的次氯酸钠溶液,清洗外植体需要使用无菌水。②对培养基和器械进行灭菌；③接种操作必须在酒精灯火焰旁进行。（8）适宜的培养条件包括那些？①温度（例如菊花植物组织培养应为18-22℃）。②光照（例如脱分化需避光，再分化需照光）。（9）一定的营养条件如何保证？配制合适的培养基，包括有机营养成分、无机营养成分、特定浓度和比例的激素。（10）培养基组成①无机营养成分（水和无机盐）,②有机营养成分（蔗糖、氨基酸、维生素）,③特定浓度和比例的激素（主要是生长素和细胞分裂素）。注意：蔗糖的作用：提供能量，调节渗透压。培养基灭菌方法为：湿热灭菌法（高压蒸汽灭菌）。（11）为什么整个过程要保证无菌操作？避免杂菌在培养基上迅速生长消耗营养，同时防止有些杂菌危害培养物的生长。（12）整个过程中使用的培养基中是一成不变的吗？不是。分别为诱导愈伤组织的培养基→诱导生芽的培养基→诱导生根的培养基。（13）以上培养基中，生长素/细胞分裂素的比值大小是如何变化的？比值适中→比值低→比值高。（14）接种后，外植体被污染的可能原因：①培养基、接种工具灭菌不彻底。②外植体消毒不彻底。③操作过程不符合无菌操作要求等。（15）若想探究生长素与细胞分裂素的使用比例对植物组织培养的影响，则应如何设计对照实验？空白对照：不加任何激素。实验组1：生长素用量与细胞分裂素用量的比值为1；实验组2：生长素用量与细胞分裂素用量的比值大于1；实验组3：生长素用量与细胞分裂素用量的比值小于1。（四）植物体细胞杂交技术1.用传统的有性杂交方法都能得到杂种后代吗？为什么？不是，因为两种生物之间存在着生殖隔离。2．植物体细胞杂交的概念：将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。3.植物体细胞杂交的主要步骤：植物细胞融合和植物组织培养。（1）在进行体细胞杂交之前，必须先去除细胞壁：用纤维素酶和果胶酶去除植物细胞壁，获得原生质体。去壁原因：细胞壁阻碍着细胞间的杂交（阻碍了原生质体间的融合）。（2）诱导原生质体融合的方法①物理法：电融合法、离心法等。②化学法：聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2＋－高pH融合法等。（3）细胞融合完成的标志：再生出新的细胞壁。

植物体细胞杂交完成的标志：培育出杂种植株。（4）再生出细胞壁的相关的细胞器：高尔基体和线粒体。（5）验证再生出新壁的实验：质壁分离和质壁分离复原实验。4.纤维素酶和果胶酶的酶溶液中一般加入一定浓度的无机盐离子和甘露醇，试分析原因？使溶液具有一定的渗透压，防止原生质体吸水过多而涨破，保持原生质体正常。5.①植物体细胞杂交的原理：细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性。②植物体细胞杂交的生殖方式：无性生殖。③植物体细胞杂交的分裂方式：有丝分裂。④植物体细胞杂交的涉及的可遗传变异类型：染色体变异。6.获得的所有细胞一定是需要的杂交细胞吗？不一定；诱导融合后的产物有三类：未融合的细胞、两两融合的细胞、多细胞融合体。7.植物体细胞杂交的意义：打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种等方面展示出独特的优势。8.杂种植株包含两个物种的全部遗传物质，各种基因都包含在内，却未按照人们的要求表现出亲本所有的性状，例如“番茄-马铃薯”并没有地上结番茄，地下长马铃薯，这是为什么？生物体内基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，杂种植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达相互干扰，它们不能像在原植株细胞内实现有序表达，因此不能按照人们的要求表现出亲本所有的性状。二、植物细胞工程的应用植物细胞工程的应用包括植物繁殖的新途径、作物新品种的培育、细胞产物的工厂化生产。（一）植物繁殖的新途径1.植物繁殖的新途径包括快速繁殖（也叫微型繁殖）和作物脱毒。2.快速繁殖(1)快速繁殖概念：用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术。(2)优点：可以高效、快速地实现种苗的大量繁殖；无性繁殖可以保持优良品种的遗传特性；可实现工厂化生产。注意：扦插、压条、嫁接等不属于微型繁殖技术。3．作物脱毒（1）适用范围：无性繁殖的作物(马铃薯、草莓、香蕉）。（2）进行作物脱毒的原因：用无性繁殖的方式进行繁殖的作物，它们感染的病毒很容易传给后代，病毒在作物体内逐年积累，就会导致作物产量降低、品质变差。（3）外植体选材部位：植物顶端分生区附近部位，如茎尖。（4）选分生区的原因：植物顶端分生区附近病毒极少，甚至无病毒。（5）优点：脱毒作物的产量和品质明显优于没有脱毒的作物。（6）作物脱毒具体操作过程：切取一定大小的茎尖进行组织培养，再生的植株就有可能不带病毒，从而获得脱毒苗。（7）脱毒苗是否不会再感染病毒？不是，脱毒苗≠抗毒苗。（8）实例：目前采用茎尖组织培养技术来脱去病毒，在马铃薯、草莓、甘蔗、菠萝、香蕉等主要经济作物上已获得成功。（二）作物新品种的培育1.作物新品种的培育包括单倍体育种和突变体的利用。2.单倍体育种(1)过程：花药（或花粉）离体培养（花药取自二倍体植株）―→单倍体幼苗染色体加倍→纯合子植株。当年就能培育出遗传性状相对稳定的纯合二倍体植株。(2)优点①后代是纯合子，能稳定遗传。②极大地缩短了育种的年限，节约了大量的人力和物力。③大多数单倍体植株可作为进行体细胞诱变育种和研究遗传突变的理想材料。（3）为什么大多数单倍体植株可作为进行体细胞诱变育种和研究遗传突变的理想材料？大多数单倍体植株的细胞中只含一套染色体，染色体加倍后得到的植株的隐性性状容易显现。3．突变体的利用（1）过程：（2）诱变处理对象：一般为愈伤组织。（3）产生原因：在植物的组织培养过程中，易受培养条件和诱变因素(如射线、化学物质等)的影响而产生突变。（4）原理：基因突变和植物细胞的全能性。（5）诱变育种的缺点：突变具有不定向性和低频性，因此需大量处理实验材料。（6）诱变育种的优点：通过人工诱变提高愈伤组织的突变率，从而筛选获得抗病、抗盐、高产、优质的新品种，加快育种进程。(7)利用：筛选出对人们有用的突变体，进而培育成新品种。（三）细胞产物的工厂化生产1.代谢产物的分类a.初生代谢产物：初生代谢是生物生长和生存所必需的代谢活动；产物：糖类、脂质、蛋白质、核酸等b.次生代谢产物：植物代谢会产生一些一般认为不是生物生长所必需的，一般在特定组织或器官中，并在一定的环境和时间条件下才进行。产物：一类小分子有机化合物（如酚类、萜类、含氮化合物等)2.细胞产物的工厂化生产的目标产物：次生代谢产物。3.次生代谢物作用：在植物抗病、抗虫等方面发挥作用，也是很多药物、香料和色素等的重要来源。4.生产技术手段：植物组织培养技术（在离体条件下对单个植物细胞或细胞团进行培养使其增殖的技术）。5.过程：6.细胞产物工厂化生产主要利用的是哪种结构？愈伤组织。7.该过程中是否需要培养得到完整植株？一般不需要。8.优点：不占用耕地，几乎不受季节、天气等的限制，对于社会、经济、环境保护具有重要意义；生产速度快。9．实例：利用紫草细胞的组织培养生产的紫草宁具有抗菌、消炎和抗肿瘤等活性。利用红豆杉细胞的组织培养生产的紫杉醇具有高抗癌活性。第二节动物细胞工程动物细胞工程包括：动物细胞培养、动物细胞融合、动物细胞核移植。一、动物细胞培养1.动物细胞培养概念：指从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。2.动物细胞培养的原理：细胞增殖（有丝分裂）。3.动物细胞培养的地位：动物细胞工程的基础。4.动物细胞培养的关键操作：原代培养和传代培养。（一）动物细胞培养的条件1.动物细胞培养的条件：营养条件、无菌、无毒的环境、适宜的温度、pH和渗透压、适宜的气体环境。2.营养物质主要包括：糖类、氨基酸、无机盐、维生素等。未知营养条件：使用合成培养基时，通常需加入血清等一些天然成分。其作用为：提供尚未全部研究清楚的细胞所需的营养物质。动物细胞利用的营养物质包括蔗糖和淀粉吗？不包括。3.动物细胞培养的培养基的物理性质：培养动物细胞一般使用液体培养基，也称为培养液。4.保证无菌、无毒环境的具体措施（1）对培养液和所有培养用具进行灭菌处理。（2）在无菌环境下进行操作。（3）还需要定期更换培养液。5.培养液的灭菌方法：湿热灭菌法（高压蒸汽灭菌）。培养用具的灭菌方法：湿热灭菌法（+烘干）或干热灭菌法。6.怎样保证无菌操作？对操作空间、操作者衣着和手进行清洁和消毒，保证所有操作均在在超净工作台并在酒精灯火焰旁进行。7.为什么培养液需要定期更换？

以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。8.如何防止培养过程中的微生物污染？

在细胞培养液中添加一定量的抗生素。9.哺乳动物细胞培养的温度多以36.5±0.5℃为宜。10.多数动物细胞生存的适宜pH为7.2-7.4。11.维持适宜渗透压的目的维持细胞正常的形态和功能。12.动物细胞培养所需气体主要有O2和CO2。其作用分别为：O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用维持培养液的pH。13.培养容器：通常采用培养皿或松盖培养瓶。培养仪器：含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱。因此动物细胞培养的气体环境为95%空气和5%CO2。（二）动物细胞培养的过程取动物组织→制成细胞悬液→转入培养液原代培养→分瓶→传代培养1.动物细胞培养取材：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。取材原因：细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养。2.制成细胞悬液的步骤（1）将组织分散成单个细胞。（2）用培养液将细胞制成细胞悬液。3.将组织分散成单个细胞的原因（1）从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖；（2）能使细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换。4.将组织分散成单个细胞的方法(1)机械法;(2)用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间。5.（1）用胰蛋白酶分散细胞，可以说明什么问题？动物细胞间的物质主要是蛋白质。（2）可以用胃蛋白酶分散细胞吗？不可以。为什么？胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性，多数动物细胞培养的适宜pH为7.2-7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以用胃蛋白酶不行。6.酶解法较温和，一定不会对动物细胞造成损伤吗？不是，使用胰蛋白酶时，要控制好作用时间，因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，长时间作用还会分解细胞膜蛋白等，对细胞造成损伤。7.体外培养的动物细胞的两大类：（1）能够悬浮在培养液中生长增殖。（2）大多数需要贴附于某些基质表面才能生长增殖（细胞贴壁）。8.两类细胞的生长特点（1）悬浮生长类：会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。（2）贴壁生长类：除会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻外，还会发生接触抑制。9.“细胞增殖到互相接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续繁殖，出现接触抑制的现象”试结合上述解释，举例说明哪种细胞最可能无接触抑制现象，并阐述原因：癌细胞，癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少。10．原代培养（1）原代培养：通常将分瓶之前的细胞培养，即指动物组织经处理后的初次培养。（2）原代培养的具体做法：将初次制备好的细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养。11．传代培养（1）传代培养：将分瓶后的细胞培养。（2）分瓶传代培养的具体做法:①收集细胞a.悬浮生长类：直接用离心法收集。b.贴壁生长类：重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。②将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。12.为什么动物细胞培养中需分瓶进行传代培养？细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻，贴壁细胞还会发生接触抑制现象。13.离心的作用：在沉淀中得到细胞，同时去掉上清液中的胰蛋白酶。14.动物细胞培养技术有没有体现动物细胞的全能性？

未体现，动物细胞培养只是细胞增殖的过程。15.正常细胞不能一直传代培养下去；细胞的传代培养一般传至10代后就不易传下去，这时细胞能保持细胞正常的二倍体核型；传至10-50代左右时，增殖会逐渐缓慢，以至于完全停止，这时部分细胞的细胞核型可能会发生变化，这一阶段的细胞称为细胞株;

继续传代培养时，少部分细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正在朝着等同于癌细胞的方向发展，这一阶段的细胞称为细胞系，细胞系的遗传物质一定改变了。（三）干细胞的培养及其应用1．干细胞功能：在一定条件下，可以分化成其他类型的细胞。2．干细胞的分布：早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。3．干细胞的种类：包括胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞等。4.胚胎干细胞（简称ES细胞）（1）分布：存在于早期胚胎中。（2）特点：具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。5.成体干细胞（1）分布：存在于成体组织或器官内中。（2）常见类别：包括骨髓中的造血干细胞、神经系统中的神经干细胞、睾丸中的精原干细胞等；（3）特点：一般认为，成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。（4）发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例：造血干细胞，主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血中。6.诱导多能干细胞概念：通过体外诱导成纤维细胞，获得类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称iPS细胞。7.诱导多能干细胞优点：（1）诱导过程无需破坏胚胎。（2）iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。8.干细胞的应用：有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。（1）造血干细胞可以治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病。（2）神经干细胞可以治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）。（3）诱导多能干细胞（iPS细胞）可治疗小鼠的镰状细胞贫血症，在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展。9.干细胞可以治疗某些顽症的原理是什么？干细胞可以被诱导分化形成新的组织细胞，经移植可使坏死或退化部位得以修复并恢复正常功能。10.胚胎干细胞的局限性：必须从胚胎中获取

，涉及伦理问题。11.普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞。12.iPS细胞用于治疗人类疾病过程取成纤维细胞→转入相关因子→细胞转化为iPS细胞→诱导iPS细胞定向分化为多种组织细胞→移植回病人体内。13.制备iPS细胞的其他方法（1）借助载体将特定基因导入细胞中诱导形成iPS细胞。（2）直接将特定蛋白导入受体细胞中诱导形成iPS细胞。（3）用小分子化合物来诱导形成iPS细胞诱导形成iPS细胞。14.iPS细胞的来源：成纤维细胞以及已分化的T细胞、B细胞。15.如果想将iPS细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施？建立iPS细胞库（HLA多态性丰富的iPS细胞库），可以为需要的人找到HLA匹配度较高的iPS细胞。16.如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？可以用来治疗不孕症，可以用来进行濒危物种的克隆，可以对获得的生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。二、动物细胞融合技术与单克隆抗体（一）动物细胞融合技术1．动物细胞融合技术概念：使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。2.诱导的结果：形成的杂交细胞，具有原来两个或多个细胞的遗传信息。3.诱导的原理：细胞膜具有一定的流动性。4．诱导方法：PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。其中，灭活病毒诱导法是动物细胞融合特有的诱导融合方法。5．意义：突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。6.“灭活病毒”中灭活的具体含义是什么？用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。7.灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。8.融合实质及完成的标志：细胞核的融合。9．动物细胞融合技术的应用(1)细胞融合技术成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。(2)利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制备单克隆抗体开辟了新途径。（二）单克隆抗体及其应用1.早期获得抗体的方法：向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。2.上述抗体的缺点：产量低、纯度低、特异性差。3.B细胞的特点（优点和局限性）：能产生单一的特异性抗体，但不能无限增殖。4.癌细胞的特点：能在体外大量增殖，但不能产生抗体。5.杂交瘤细胞特点：B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞，既能无限增殖又能产生大量特定抗体。6.米尔斯坦和科勒由于发明了单克隆抗体的制备技术，于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。7．制备过程：8.实验最初应如何处理小鼠？

注射特定的抗原，用特定的抗原对小鼠进行免疫。目的是为了获得抗体吗？不是。其目的：用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞（获得能产生特定抗体的B淋巴细胞）。9.诱导融合（1）诱导融合的方法：PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法（动物细胞特有）。（2）诱导融合后，能得到几种细胞？（融合只考虑两两融合）①未融合的亲本细胞（B淋巴细胞、骨髓瘤细胞）。②融合的具有同种核的细胞（B-B细胞、瘤-瘤细胞）。③融合的杂交瘤细胞。10.筛选（1）第一次筛选①如何筛选（筛选方法）：用特定的选择培养基进行筛选。②筛选原理：在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。③获得的杂交瘤细胞的特点：既能迅速大量繁殖，又能产生抗体。此时，抗体不是所需的特定抗体。④得到的该杂交瘤细胞一定是所需的吗？杂交瘤细胞并不纯，因为从脾脏获得的B淋巴细胞不纯（既有未免疫的B淋巴细胞，又有能产其他抗体的B淋巴细胞，以及能产所需抗体的B淋巴细胞），因此要进行第二次筛选。（2）第二次筛选①如何筛选（筛选方法）：用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（一般进行多次筛选）。②获得的杂交瘤细胞的特点：既能迅速大量繁殖，又能分泌所需抗体。③选择抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞，即分泌的抗体能与特定的抗原结合。④抗体检测原理：抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的检测）。（3）第一次筛选的目的：筛选获得杂交瘤细胞。第二次筛选的目的：获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。11.如何对所需杂交瘤细胞大规模培养在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖。12.如何获取单克隆抗体（1）体外培养：从细胞培养液中获取。（2）小鼠腹腔内培养：从小鼠腹水中获取。13.单克隆抗体制备的过程中涉及的原理：细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖。14.单克隆抗体制备的过程中应用到的技术：动物细胞融合、动物细胞培养。15．单克隆抗体的优点：能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。16．单克隆抗体的应用(1)作为诊断试剂，具有准确、高效、简易、快速的优点。(2)用于治疗疾病和运载药物。17.用作诊断试剂的原理：单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合。18.用作诊断试剂的实例：多种疾病的诊断和病原体鉴定。19.运载药物（1）实例——ADC：与药物结合，制成抗体-药物偶联物（ADC），杀伤肿瘤细胞；ADC通常由抗体、接头和药物三部分组成。（2）原理：通过将药物与能特异性识别肿瘤细胞抗原的单克隆抗体结合，实现对肿瘤细胞的选择性杀伤。发挥杀伤作用的为放射性同位素、化学药物或细胞毒素；单克隆抗体作用为靶向运输作用；（3）优点：靶点清楚、毒副作用小（不会对健康细胞造成伤害）。三、动物体细胞核移植技术和克隆动物1.动物细胞核移植技术概念：将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。2.克隆动物：用核移植的方法得到的动物。3.动物细胞核移植技术原理：动物细胞核的全能性、细胞膜具有一定的流动性。培育多利羊的原理：动物体细胞核的全能性、细胞膜具有一定的流动性。4.动物细胞核移植技术生殖方式：无性生殖。5．哺乳动物核移植分类：胚胎细胞核移植和体细胞核移植。两者中难度较高的是体细胞核移植。6.动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植；为什么？

动物胚胎细胞分化程度低，表现全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难。7.非人灵长类动物体细胞核移植的困难原因（1）供体细胞的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其分化前的功能状态，这导致了胚胎发育率低；（2）对非人灵长类动物胚胎进行操作的技术尚不完善。（一）体细胞核移植的过程1.采集的卵母细胞应培养至MⅡ期（减数分裂Ⅱ中期）2.选择MⅡ期卵母细胞的原因（1）含有促进细胞核表现全能性的物质和营养条件。（2）细胞体积大，易于操作。3.卵母细胞去核（1）卵母细胞去核的方法：显微操作（去核）法。

除此之外，还有梯度离心、紫外线短时间照射和化学物质处理等方法。这些方法是在没有穿透卵母细胞透明带的情况下去核或使其中的DNA变性。（2）“去核”去的是什么？去除的为纺锤体-染色体复合物。注意：去核时，由于MⅡ期卵母细胞核的位置靠近第一极体，一般用微型吸管一并吸出细胞核和第一极体。（3）去核的原因：使核移植得到的胚胎或动物核内遗传物质全部来自有重要利用价值的动物。（4）与直接注入核相比，将供体细胞注入卵母细胞的优点：对卵母细胞损伤较小。注入位置：将供体细胞注入去核卵母细胞的透明带内（卵细胞膜和透明带之间）。7.重组细胞（1）诱导供体细胞和去核卵母细胞融合的方法：电融合法。（2）融合的结果：供体核进入卵母细胞，形成重构胚。8.重构胚（1）重构胚概念：人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力。（2）激活重构胚的方法①物理方法：电刺激。②化学方法：Ca2+载体、乙醇和蛋白酶合成抑制。（3）激活重构胚的目的：激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程。9.实验结论：证明了动物已分化的体细胞的细胞核具有全能性。10.实验结果：生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛11.新生犊牛的细胞核遗传物质来自供体奶牛。

新生犊牛的细胞质遗传物质来自去核卵母细胞。新生牛的性别与供体奶牛一致。12.通过动物细胞核移植获得奶牛的过程中涉及的技术：（1）动物细胞核移植。（2）动物细胞培养。（3）动物细胞融合。（4）早期胚胎培养。（5）胚胎移植。注意：操作为“将供体细胞注入去核卵母细胞”时，才涉及该技术。13.用上述技术培育的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？不是。14.为什么克隆动物不是对体细胞供体动物进行了100%的复制？（1）克隆动物绝大部分DNA来自供体动物的细胞核，但线粒体中的DNA（细胞质中的DNA）同时来自供体细胞和受体卵母细胞。（2）性状是基因与环境共同作用的结果，克隆动物所处的环境与核供体细胞生活的环境不会完全相同。（3）克隆动物在个体发育过程中有可能发生基因突变、染色体变异等可遗传变异。（二）体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题1．应用前景(1)畜牧生产方面：加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育。(2)医药卫生领域①转基因克隆动物作为生物反应器，生产珍贵的医用蛋白。②转基因克隆动物的细胞、组织和器官可作为异种移植的供体。③以患者作为供体培育的人核移植胚胎干细胞，经过诱导分化能形成相应的细胞、组织或器官，将它们移植给患者时可以避免免疫排斥反应。(3)保护濒危物种方面：保护濒危物种，增加濒危动物的存活数量。(4)科研①研究克隆动物可使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程。②克隆一批遗传背景相同的动物，可以通过它们之间的对比来分析致病基因。③克隆特定疾病模型的动物，还能为研究该疾病机制和开发相应的药物提供帮助。2．存在问题(1)体细胞核移植技术的成功率非常低。(2)各个技术环节有待进一步改进。(3)克隆动物存在健康问题，表现出遗传和生理缺陷等第三节胚胎工程一、胚胎工程的理论基础1.胚胎工程概念：对生殖细胞、受精卵或早期胚胎细胞进行多种显微操作和处理，然后将获得的胚胎移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。2．胚胎工程技术(1)操作对象：动物生殖细胞、受精卵、早期胚胎细胞；(2)技术种类：体外受精、胚胎移植、胚胎分割；(3)特点：获得的胚胎需移植到雌性动物体内生产后代；(4)理论基础：哺乳动物受精和早期胚胎发育的规律。（一）受精1．受精概念：精子与卵子结合形成合子(即受精卵)的过程。2．受精场所：在自然条件下，哺乳动物的受精在输卵管内完成。3．受精过程：包括受精前的准备阶段和受精阶段；前者又包括精子获能和卵子的准备。4.精子获能(1)概念：刚刚排出的精子不能立即与卵子受精，必须在相应的生理变化发生雌性动物的生殖道后，才能获得受精能力，这一生理现象称为“精子获能”。注意：获能的能指的是“受精能力”而不是“能量”。(2)使精子获能的两种方法:①直接利用雌性动物生殖道使精子获能②将精子培养在人工配制的获能液中使其获能。获能液的成分因动物种类不同而有所差异。获能液常见有效成分有肝素、Ca2+载体等。(3)研究精子获能机制的意义:实现了各种哺乳动物在体外条件下的获能，为体外受精技术的建立奠定了基础。5.卵子的准备(1)卵子一般在排出2-3h后才能被精子穿入。(2)动物排出的卵子成熟程度不同。有的可能是初级卵母细胞，如马、犬等；有的可能是次级卵母细胞，如猪、羊等。(3)卵子成熟的场所:排出的卵子都要在输卵管内进一步成熟。(4)卵子具备与精子受精能力的时期

MⅡ期。6.受精阶段过程:（1）精子释放多种酶溶解卵细胞膜外的一些结构，精子穿越透明带。（2）透明带反应：阻止多精入卵的第一道屏障。（3）透明带反应具体表现：精子触及卵细胞膜的瞬间，透明带会迅速发生生理反应，阻止后来的精子进入透明带。（4）透明带反应发生时间：精子触及卵细胞膜的瞬间。（5）精子入卵：（卵细胞膜反应：阻止多精入卵的第二道屏障。）（6）卵细胞膜反应具体表现：精子入卵后，卵细胞膜会立即发生生理反应，拒绝其他精子再进入卵内。（7）卵细胞膜反应发生时间：精子入卵后。（8）雄原核的形成：精子入卵后，尾部脱离，原有的核膜破裂并形成一个新的核膜，最后形成一个比原来精子的核还大的核，叫做雄原核。（9）雌原核的形成：精子入卵后,被激活的卵子完成减数分裂Ⅱ，排出第二极体后，形成雌原核。（10）受精的标志：①观察到两个极体（透明带和卵细胞膜之间）。②观察到雌、雄原核。注意：多数哺乳动物的第一极体不进行减数分裂Ⅱ，因而不会形成两个第二极体，观察到的两个极体为一个第一极体一个第二极体。（11）受精完成的标志：雌、雄原核核膜消失，形成合子。（12）受精过程结束后，受精卵的发育也就开始了。（13）受精卵中细胞核遗传物质来源一半来源于精子，一半来源于卵子。细胞质遗传物质来源几乎全部来自于卵子。（二）胚胎早期发育1.受精卵是胚胎发育过程中全能性最高的阶段。2.哺乳动物胚胎早期发育场所：输卵管和子宫。3.胚胎早期发育阶段：受精卵→桑葚胚→囊胚→原肠胚。4.卵裂（1）场所：透明带内。

（2）分裂方式：有丝分裂。（3）特点：①细胞数量不断增加。

②胚胎总体积并不增加。（4）其他表现：每个细胞体积不断减小；DNA总数目不断增加；每个细胞的核DNA数目不变；有机物总量减少；有机物种类增加。5.桑葚胚（1）概念：当卵裂产生的子细胞逐渐形成致密的细胞团，形似桑葚时，这时的胚胎称为桑葚胚。（2）特点：这一阶段及之前的每一个细胞都具有发育成完整胚胎的潜能，属于全能细胞。6.囊胚（1）概念：胚胎进一步发育，细胞开始出现分化，形成内细胞团、滋养层；随着胚胎进一步发育，胚胎内部出现了含有液体的囊腔—囊胚腔，这个时期的胚胎叫做囊胚。（2）特点：细胞逐渐分化。（3）结构组成：内细胞团、滋养层、囊胚腔。①内细胞团：位置：聚集在胚胎一端。

作用：将来发育成胎儿的各种组织。②滋养层：位置：沿透明带内壁扩展和排列。作用：将来发育成胎膜和胎盘。③囊胚腔：胚胎内部含有液体的腔。④孵化：囊胚进一步扩大，会导致透明带破裂，胚胎从透明带中伸展出来，这一过程叫做孵化。7.囊胚期的内细胞团细胞具有全能性。8.原肠胚：囊胚孵化后，将发育形成原肠胚；原肠胚表面的细胞层为外胚层，向内迁移的细胞形成内胚层；随着发育的进行，一部分细胞还会在内外两个胚层之间形成中胚层；这三个胚层将逐渐分化形成各种组织、器官等。9.牛在自然情况下，胚胎最早可在8-16细胞阶段进入子宫，但在实践中通常对发育到囊胚阶段的胚胎进行移植的原因：提高移植后胚胎的发育率和妊娠率。注意：不同种动物精子的形态相似，大小略有不同，与动物的体型大小无关。二、胚胎工程技术及其应用（一）体外受精1．试管动物：通过人工操作使卵子在体外受精，经培养发育为早期胚胎后，再进行移植产生的个体。2．体外受精技术的主要过程：卵母细胞的采集、精子的获取和受精。（1）采集到的卵母细胞和精子，要分别在体外进行成熟培养（即培养至MⅡ期）和获能处理（可对精子进行离心处理），然后才能用于体外受精。（2）一般情况下，可以将获能的精子和培养成熟的卵子置于适当的培养液中共同培养一段时间，来促进它们完成受精。3.体外受精的意义：是提高动物繁殖能力的有效措施，可以为胚胎移植提供可用胚胎。（二）胚胎移植1．概念：是指将通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。2.胚胎来源：体外受精及其他方式得到的胚胎。其他方式包括：体内受精、转基因技术、动物细胞核移植技术等。3．胚胎移植的基本程序：（1）供体、受体的选择和处理。①提供胚胎的个体称为供体。②供体选择标准：遗传性状优良、生产能力强。③供体职能：产生具有优良遗传特性的胚胎。④接受胚胎的个体叫受体。⑤受体选择标准：有健康体质和正常繁殖能力。⑥受体职能：承担繁重而漫长的妊娠和育仔任务。⑦对受体进行的处理：同期发情处理。⑧该处理的目的：为胚胎移植前后提供相同的生理环境。⑨只对供体进行的操作：超数排卵处理。⑩该处理需要用的激素：外源促性腺激素。该处理的