免疫学应用技术 第四章 免疫标记技术学习资料

第四章免疫标记技术免疫标记技术是指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学（或生物）发光剂等作为示踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应，并籍助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定，可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。原位杂交共聚焦显微镜原位杂交照片第一节免疫荧光技术一、经典的免疫荧光技术二、现代免疫荧光分析技术一、经典的免疫荧光技术基本原理：免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。以荧光素作为标记物，与已知的抗体（或抗原，较少用）结合，但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。免疫荧光标记技术（一）荧光抗体的制备1、抗体2、荧光及荧光素3、荧光素标记抗体的方法4、标记抗体的纯化与质量鉴定5、标记抗体的保存1、抗体用于制备荧光素结合的抗体要求特异性强，纯度高，效价满意，琼脂双向扩散效价不低于1：32（稀释抗体）或环状沉淀试验效价高于1：4000（稀释抗原）。2、荧光及荧光素适用于抗体标记的荧光素须具备以下条件：（1）应具有能与蛋白质分子形成稳定共价键结合的化学基团，或易于转变成此类基团而不破坏其荧光结构（2）荧光效率高，与蛋白质结合的需要能量很少。（3）与抗体或抗原结合后，应不影响其免疫学特异性。（4）结合物产生的荧光颜色与背景组织的自发荧光对比鲜明，能清晰地判断。（5）荧光素与蛋白质结合的方法简便、快速、游离的荧光素及其降解产物容易去除。此外，结合物在一般贮存条件下性能稳定，可保存使用较长时间。目前用于标记抗体的荧光素主要有——异硫氰酸荧光黄（FITC）——四乙基罗丹明（RB200）——四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）。3、荧光素标记抗体的方法FITC标记法：分为直接标记法和半透膜渗透标记法。直接标记法A．取适量提纯的IgG，用生理盐水和0.5mol/L、pH9.5碳酸盐缓冲液（9：1）稀释为20mg/mL。将容器放置冰浴内；B．按每mg抗体蛋白内加入0.01~0.02mgFITC（即二者比例为1：50~1：100）。用分析天平称取所需量的FITC，先溶解于少量碳酸盐缓冲液（同上），再逐滴缓慢加入蛋白液内。边加边搅拌混匀，避免产生气泡，约在5~10分钟内加完；C．将容器（瓶口加塞密闭）及电磁搅拌器移置4~6℃冰箱内，继续缓慢搅拌结合12~18小时（亦可在20~25℃室温下搅拌结合2~4小时）。去除游离荧光素：先将结合物经离心沉淀（3000r/min，20分钟）除去少量沉淀物，取上清置透析袋内，用0.01mol/L、pH7.2磷酸缓冲液（PBS）于4℃透析3~5天（PBS液量应为结合物的100倍，并需多次更换透析液）。或将结合物通过SephadexG-50凝胶柱层析，收集第1洗脱峰，合并，即为荧光抗体。4、标记抗体的纯化与质量鉴定标记抗体的纯化——游离荧光素的去除——未标记及过度标记蛋白的去除——非期望抗体或交叉反应抗体的去除4、标记抗体的纯化与质量鉴定标记抗体的鉴定——抗体效价——荧光素（F）与蛋白质（P）结合比率（F/P值）4、标记抗体的纯化与质量鉴定特异性染色滴度测定——直接法——间接法标记抗体的特异性鉴定——吸收试验——抑制试验5、标记抗体的保存经鉴定合格的荧光抗体，可加入0.01%硫柳汞或0.1%叠氮钠防腐，小量分装(0.5mL/安瓿)，置0~4℃可保存1年左右；-20℃可保存2~3年，但取出后应快速融化，并避免反复冻融。冰冻干燥后可保存较长时间。（二）荧光抗体染色方法用途：测定细胞表面抗原和受体各种病原微生物的快速检查和鉴定组织内抗原的定性和定位研究各种自身抗体的检测（二）荧光抗体染色方法标本来源穿刺液体液、胸腹水、尿液培养细胞活体组织取材（二）荧光抗体染色方法标本保存选择适当的固定剂活体组织选择适当的切片方法（二）荧光抗体染色方法直接法间接法二、现代免疫荧光分析技术（一）荧光偏振免疫分析法（二） 均相荧光免疫测定（三） 荧光激活细胞分类仪（四） 时间分辨荧光免疫测定荧光与发光免疫分析第二节放射免疫技术一、放射免疫测定（RIA）二、免疫放射测定（IRMA）三、放射受体分析主要材料和试剂标记抗原标准抗原或待测物标准品特异性抗体分离剂γ-计数仪低温离心机标记抗原制备——氯胺T法标记抗原制备——乳过氧化物酶法标记抗原制备——氯甘脲法测定方法——胰岛素含量的测定二、免疫放射测定测定方法直接IRMA法双抗体夹心IRMA法间接IRMA法BAS-IRMA法测定方法——双抗体夹心IRMA法第三节免疫酶技术

免疫酶组织化学技术免疫酶技术{均相酶免疫测定酶免疫测定{非均相酶免疫测定

非均相酶免疫测定{固相酶免疫测定（ELISA）液相酶免疫测定HRP追踪技术免疫组织化学染色一、酶标抗体的制备用于标记抗体（或抗原）的酶应符合下列要求——纯度及比活性高，且价廉易得——性质稳定，可溶性好；而且容易和抗体（或抗原）连接，二者的活性均不受影响——受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或抑制物；——检测方法简易、敏感、精确——酶的底物对人体健康无危害常用的标记酶辣根过氧化物酶碱性磷酸酶葡萄糖氧化酶β-D半乳糖苷酶二、非均相酶免疫测定（一）固相酶免疫测定（二）液相酶免疫测定酶联免疫吸附试验（一）固相酶免疫测定——间接法（一）固相酶免疫测定——双抗体夹心法