微生物实验医学知识1医学知识

内容提要

一.内毒素（LPS）的检测

二.肠道致病菌的分离培养

三.细菌在自然界的分布及理化因素对细菌生长的影响（一）内毒素的检测

目的1掌握内毒素实验的原理和操作方法。2熟悉内毒素实验的意义。检测内毒素的方法有家兔发热法和鲎（hòu）实验法，家兔发热法比较烦琐，且灵敏度不高，故现在多用鲎实验法，鲎实验法灵敏度高，可检测小于10ng/ml的内毒素。内毒素生物学活性：致热作用、白细胞反应、感染性休克和DIC等。原理：

鲎是一种海洋节肢动物，其血液中含有一种有核变形细胞，这种细胞的胞浆中含有凝固酶原和凝固蛋白原。内毒素（LPS）

激活凝固蛋白原凝固蛋白（溶解状态）

（凝胶状态）凝固酶原凝固酶材料：鲎试剂内毒素试剂鲎试剂专用溶解水无菌无热源质吸管方法：

（每4个人一组，两支鲎试剂，一支实验一支对照）

1.取两支鲎试剂打开，分别加入0.1ml鲎试剂溶解水，使之溶解2.其中一支加入0.1ml内毒素，标记上实验组，另一支加入0.1ml溶解水，作为对照3.垂直放入37℃温箱，20--30分钟观察结果结果：实验组出现凝固，对照组不出现凝固内毒素检测的应用：（1）检测输液用品或生物制品中是否含有内毒素（2）临床上检测患者是否有革兰氏阴性菌感染引起的内毒素血症（内毒素休克）等二.肠道致病菌的分离培养2学时

一.常见培养基的特性及用途二.致病性肠道杆菌的生物学性状三.分离培养方法肠道细菌的分离培养一、培养基概念:是人工配制的专供微生物生长繁殖的混合营养物制品。成分：充足的营养物质（水分、碳源、氮源、无机盐）；合适的PH，适宜的温度；适宜的气体环境。用途：用于微生物的繁殖及分离接种，传代或保存，鉴别微生的类属，研究微生物的生理及生化特性，制造菌苗、疫苗或其他微生物制剂等。二、分类主要用于增菌用于检测动力及保存菌种用于分离鉴定细菌双糖铁培养基S-S培养基普通琼脂培养基血液琼脂培养基

庖肉培养基培养基的制备程序调配过滤矫正pH（7.0-7.6） 分装过滤灭菌（121.3℃，20-30分钟）鉴定是否有菌放入冰箱冷藏备用因高压之后pH值会下降0.1左右，所以矫正pH时应比所需的pH高鉴定是否有菌可将培养基置于37℃培养24小时，然后观察肉汤培养基制作方法1.将已去筋膜及脂肪并经绞碎的鲜牛肉50克，加蒸馏水100ml，放入冰箱中过夜。2.加热煮沸半小时至一小时后，用数层纱布或滤纸过滤，滤液用蒸馏水补足其量为100ml。3.于滤液中加入氯化钠0.5克，蛋白胨1克，磷酸氢二钾0.1克，加热使之完全溶化。4.测定酸碱度并调至pH7.6，必要时用滤纸过滤。5.按需要分装于试管或烧瓶内，加棉塞，置高压蒸汽灭菌器内，经121.3℃、20-30分钟灭菌。6.灭菌后置37℃温箱孵育24小时，无杂菌生长，即可应用或放冰箱备用。液体培养基加入1-2%的琼脂为固体培养基，加入0.5%琼脂为半固体培养基。固体培养基加入血液即为血平板（营养培养基）。血液琼脂培养基（血平板）在普通琼脂培养基的基础上加入血液制备而成,是最常用的营养培养基,可供营养要求较高的细菌生长.常用于分离培养和溶血现象观察.含有胆酸盐抑制G+,枸橼酸钠和煌绿能抑制大肠杆菌,致病的沙门菌和志贺菌能大量生长.含有中性红指示剂和乳糖,中性红遇酸变粉红.常用于培养肠道致病菌.SS培养基（Salmonella-ShigellaMediun）

SS培养基肠道杆菌的生物学性状埃希菌属：大肠埃希菌沙门菌属：伤寒沙门菌甲型、乙型副伤寒沙门菌志贺菌属：痢疾志贺菌肠杆菌科重要菌属及代表菌种1大肠杆菌:

生物学性状:G-镜下为杆状，多数菌株有周鞭毛，菌毛，无芽孢，兼性厌氧

营养要求不高,可在普通琼脂培养基上生长，发酵葡萄糖等,产酸产气最适宜温度为37度,最适宜pH为7.4肠道杆菌的生物学性状菌落特点：

圆形，凸起，灰白色，表面光滑，湿润，直径2-3mm肠产毒型大肠杆菌（轻度腹泻，肠毒素，定植因子）肠侵袭型大肠杆菌（与志贺菌相关，与菌痢相似里急后重，不产生肠毒素）肠致病型大肠杆菌（最早发现的引起腹泻的大肠杆菌，婴幼儿）肠出血型大肠杆菌（出血性结肠炎和溶血性尿毒综合征的病原体，轻度水泻伴剧烈腹痛血便，常见食品污染）肠集聚型大肠杆菌（婴儿和旅行者持续水样腹泻偶有血便，不侵袭细胞，在细胞表面自动聚集，形成砖样排列）分类：（胃肠炎）（2）伤寒杆菌生物学特性:G-镜下为杆状,有菌毛，除个别外都有周鞭毛，一般无荚膜，均无芽孢。兼性厌氧，营养要求不高,不发酵乳糖或者蔗糖，对葡萄糖，麦芽糖，甘露糖发酵，产酸不产气，其他沙门菌产酸产气，可在普通琼脂培养基上生长最适宜温度为37度,最适宜pH为7.4菌落特点:圆形,凸起,无色，细小，半透明,表面光滑,湿润,直径2-3mm.1、相似的形态染色—从形态上无法区别

中等大小的G-杆菌

多有鞭毛、菌毛肠道杆菌的生物学性状2、活泼的生化反应肠道杆菌的生物学性状乳糖发酵试验初步鉴别肠道致病菌和肠道非致病菌肠道致病菌肠道非致病菌多数不发酵乳糖多数发酵乳糖肠道杆菌的生物学性状-/+-+伤寒杆菌--+痢疾杆菌-

⊕

⊕大肠杆菌硫化氢乳糖葡萄糖菌名

将粪便标本以分区划线法接种到SS培养基。(每个实验室8个平板）(接种好后，做好标记，用胶布按班绑好)放入37℃温箱中培养24小时。取出放4℃冰箱中保存备用。分离培养方法三、消毒灭菌（2学时）1.细菌在自然界的分布及理化因素对细菌的影响2.高压蒸汽灭菌法空气中细菌的检查（每个班1个平皿）

原理：根据空气中携带有微生物气溶胶（以固体或液体微小颗粒分散于空气中的分散体系称为气溶胶，其中的气体是分散介质）粒子在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到琼脂培养基上。

方法：在室内选择一处放一个平皿。揭开皿盖，皿盖扣置于皿底下，暴露放置15min，即盖上皿盖，放入37℃培养24小时，观察结果。1.1细菌在自然界的分布1.2.1紫外线对细菌的影响（每个实验室1个培养皿）原理：紫外线主要作用于DNA，使一条DNA链上的两个相邻胸腺嘧啶以共价键结合成二聚体，从而干扰DNA的复制与转录导致细菌变异或死亡。对病毒也有破坏作用。

紫外线杀菌作用强，而穿透能力弱。普通玻璃、纸张、水蒸气、尘埃等均能阻挡。紫外线中波长为240-300nm者具有杀菌能力，其中265-266nm的杀菌作用最强。常用于消毒物体表面，手术室无菌实验室，传染病房的空气消毒及不耐热物品消毒。1.2理化因素对细菌的影响紫外线对细菌的影响

取一个平皿，用密涂法将细菌涂布于培养皿中，然后按图所示揭开平皿盖，置于紫外线下照射30分钟，然后盖好盖子，置37℃培养24h后取出观察结果。

1促进菌体蛋白质变性或凝固。2干扰细菌酶系统和代谢。3损伤细菌的细胞膜，影响细菌的化学组成，物理结构和生理活动，从而发挥防腐、消毒至灭菌作用。

1.2.2化学消毒剂对细菌的影响

有些化学药品浓度高时能杀灭病原微生物，称为化学消毒剂；浓度低时能抑制细菌生长，称为防腐剂；

（只能外用，对细菌的敏感性不同）化学消毒剂对细菌的影响化学消毒剂分类1高效消毒剂：杀灭细菌芽孢在内的所有微生物，适用于不耐热力灭菌但要进入人体内部的物品，如内窥镜等。次氯酸钠、过氧化氢、甲醛、环氧乙烷等2中效消毒剂：不能杀灭芽孢，但能杀灭繁殖体（包括结核杆菌），真菌和大多病毒，如喉镜，麻醉器材碘酊、乙醇等3低效消毒剂：能杀灭大多细菌繁殖体，但不能杀灭芽孢，结核杆菌及某些抵抗力强的真菌和病毒。新洁尔灭、洗必泰、高锰酸钾等影响消毒灭菌的因素1微生物的种类2微生物的污染程度3环境中的有机物4消毒剂的性质、浓度与作用时间5温度、湿度、酸碱度6化学拮抗物化学消毒剂对细菌的影响方法：取一普通平皿培养基，一部分写上“前”，另一部分写上“后”，然后将手指在写有“前”的部分沾一下，再将手指用酒精进行消毒，在写有“后”的部分沾一下。放入37℃温箱培养24小时后观察。

（每个实验室2个平皿）方法：用“打咳法”进行检查。取一个血琼脂平皿培养基（咽喉部多为葡萄球菌），打开平皿盖，对着平皿咳嗽几次（口腔前约10厘米），然后放入37℃温箱培养24小时后观察菌落数量及特征。

咽喉部细菌的检查2高压蒸气灭菌法原理：蒸汽被限制在密闭容器内，随着热力的作用压力不断升高，蒸汽的温度也相应升高，在103.4kPa蒸汽压力下时，温度可达121.3℃。维持15~20分钟后可杀死细菌包括芽孢在内的所有微生物。高压蒸气灭菌器1)构造高压蒸气灭菌器是一个双层的金属圆筒，两层之间盛水，外层坚厚，其上或前方有金属厚盖。盖旁附有螺旋，借以紧闭盖门，使蒸气不能外溢。高压蒸气灭菌器上装有排气阀、安全阀，以调节器内压力，装有的温度计及压力表以示内部温度和压力。器内装有带孔的金属搁板，用以放置欲灭菌对象。高压蒸汽灭菌法压力：1.05kg/㎡

或103.425KPa温度:

121.3℃时间：15-20min完全杀灭细菌的繁殖体和芽孢用途：适用于耐高温、高压，不怕潮湿的物品，如敷料、手术器械、药品、细菌培养基等全自动高压蒸汽灭菌锅SystecD-2002D双门高压灭菌器电热卧式圆形压力蒸汽灭菌器(型号YXQ-WY21-600)台式蒸汽灭菌器BA-30全自动喷淋式高温高压调理杀菌锅

电脑全自动水浴式串联杀菌锅2)使用方法①加水至锅内达规定的水平面，放人欲灭菌物品，把锅盖按对称的螺旋先后对称用力（切勿单个依次）扭紧，使锅盖确实均匀密闭。②用电炉加热，同时打开排气阀门，使器内冷空气逸出，保证器内温度和压力表所示一致。待空气全部排出后，关闭排气阀。③继续加热注视压力表，器内压力又逐渐升高，直到压力表指在所需数字（