一种新的犬类副粘病毒的分离与鉴定2

华南农业大学大学生科技创新活动项目一种新的犬类副粘病毒的分离与鉴定兽医学院动物医学专业02级梁淑慧张元福指导老师：贺东生日期：2006年4月5日一种新的犬类副粘病毒的分离与鉴定梁淑慧张元福贺东生（华南农业大学兽医学院广东广州510640）摘要：本文报导了一种犬类新型副粘病毒特性的研究及其流行情况的调查。根据犬副粘病毒的血球吸附特性、鸡胚培养特性、血清学技术（HA试验和HI试验）进行生物学特性等系统鉴定，测得该病毒效价达1：256；并进行了电镜形态学观察，可见较典型的犬副粘病毒形态结构特征；测定出该病毒株的红细胞凝谱。通过血清学调查分析目前犬中该病毒的分布和流行情况。研究成果将揭示我国一种新的犬副粘病毒，填补国内空白，为该病的预防和控制奠定坚实的基础，具有重大的应用前景。关键词：副粘病毒分离鉴定犬犬副粘病毒包括犬副流感病毒2型(Canineparainfluenzavirus2，CPMV)和犬瘟热病毒(Caninedistempervirus,CDV)。CPMV可致犬的隐形感染或者造成上呼吸道感染、气管炎、细支气管炎和肺炎呼吸道疾病；CDV具有高度传染性，急性型可并发严重的呼吸道症状，是犬的最重要的病毒病。在前期创新研究中，我们从犬中分离到一种副粘病毒，它与新城疫血清有强烈反应（1：256），但是与CDV的反应却很弱；经PCR检测，发现其有与新城疫病毒有相同的F片段，经动物试验证明它对鸡有致病作用，这些特性都不是CPMV和CDV所具有的，初步鉴定为犬的一种新型副粘病毒。针对这株病毒，我们前期已做了一系列工作，包括MDCK细胞系培养和攻毒试验。攻毒小白鼠后，小鼠表现出与流感相似症状；攻毒鸡只，解剖后可见咽喉部出血，盲肠和泄殖腔均有出血点；攻毒犬，在第三周开始测得血清中抗体水平持续升高。本文拟利用副粘病毒所具有的血凝和能在鸡胚增值的特性，继续对该病毒的生物学特性进行深入研究，以期全面认识和了解，为犬副粘病毒的研究打下基础。此外还应用电镜形态学观察，直观地了解该病毒的形态结构。现将结果报导如下。材料和方法1.1材料1.1.1类副粘病毒株华南农业大学传染病实验室提供。1.1.2ND抗原由华南农业大学传染病实验室提供。1.1.39－11日龄SPF鸡胚由广东永顺生物制品厂SPF种禽饲养室提供1.1.4血液（牛、兔、狗、猫、鸡）由华南农业大学兽医学院传染病实验室、临床实验室提供。1.1.51%红细胞悬液一次性注射器吸取2ML阿氏液，采健康成年动物的静脉血2ML，混匀，转移到离心观众，用1倍的PBS洗涤红细胞两次，头两次以1500/min离心5分钟，最后一次加20µl双抗2000/min离心10分钟，将1ML离心压积后红细胞加入到100MLPBS或阿氏液中，即配成1％红细胞悬液，置4℃1.1.6氯化钠8.5克，磷酸二氢钾0.68克，氢氧化钠0.15克，上述成分溶于100ML溶液蒸馏水高压灭菌，于4℃1.1.7阿氏液葡萄糖20.5克，氯化钠4.2克，柠檬酸0.55克，柠檬酸钠8.0克，溶于100ML蒸馏水中，调PH值6.8—7.2，分装于115℃方法1.2.1病毒的增值病毒液用绒毛尿囊腔接种的方法接种SPF鸡胚（0.3ml/胚）后置37℃温箱中孵育，每天照胚2次，24h内死亡的鸡胚应立即置于4℃的冰箱。培养48h后将鸡胚放置于4℃冰箱4h或—20℃的冰箱30min，于超净台中无菌操作1.2.2病毒效价的测定采集鸡胚尿囊液进行细菌检查和1%的鸡红细胞作血凝试验（HA）试验，若出现血凝活性，则继续传代并测定血凝价。若血凝价为阴性，则盲传2代，仍为阴性者则弃去，如为阳性，则继续传代并测定血凝价。病毒分离阳性者置于－20℃1.2.3血液样品收集2005年5月一2006年1月，从广州各地区采集不同品种的犬血液样品46份。将所采的血液样品放置30min或置于4℃冰箱过夜，4000转/min离心6min，用高压灭菌的离心管分装后置于－201.2.4按常规血凝试验方法用该毒株病毒液分别对牛、狗、鸡、猫、兔的1%红细胞悬液进行血凝试验。1.2.5把分离到的血清分别用ND和该类副粘毒株作为抗原按常规操作进行HI试验，初步分析目前犬中该病毒的分布和流行情况。1.2.6取第2代培养的组织液0.1ML送华南农业大学电镜中心直接应用电镜技术（electromicroscopy,EM），经磷钨酸负染后电镜观察。结果2.1病毒的效价HA试验测得该病毒的血凝价为1：2562.2血凝谱试验（表1）从表1可以得出该病毒可凝集狗、兔、鸡的红细胞，但是不凝集牛、猫的红细胞。由于不同动物的红细胞特性各不相同，造成红细胞沉降速率不一，因此观察记录这些动物血凝滴度的时间各不相同。表1不同动物红细胞的凝集结果鸡狗牛兔猫血凝滴度读取时间（min）204030120302.3血清HI试验46份血清分别用该病毒株、ND作为抗原进行HI试验，在采血中选不同品种的犬，其中测到血清有抗体的情况如表2，初步分析目前犬中该病毒的分布和流行情况。表2血清HI试验结果样品年龄症状158（孔）ND（孔）编号C001成年健康－4C002成年健康45C006成年健康23C007成年健康45C008成年健康33C009成年健康22C010成年健康—4C013成年健康22C018成年后肢嫁接手术34C019成年健康42C020成年健康22C023成年健康22C024成年健康2—C025成年皮肤病45C026成年健康23C028成年健康54C031成年健康44C032成年健康45C046成年患过肺炎46C004幼龄健康43C005幼龄健康23C014幼龄健康32C037幼龄1月前患过感冒77其余样品中均没测到抗体小结和讨论3.1从血凝谱中可以看出，该病毒株可凝集狗、兔、鸡的红细胞，但是不能凝集牛、猫的红细胞；鸡红细胞的凝集滴度最高，狗红细胞次之，兔红细胞最低。副粘病毒科中大多数病毒都具有红细胞吸附和凝集活性、神经氨酸酶活性、溶血活性和细胞融合活性。例如NDV可凝集所有两栖动物、爬行类、禽类、小鼠、豚鼠的红细胞，但凝集牛、绵羊、猪、马及人O型血红细胞的能力，随血清型或毒力的不同而不同。比较这两种抗原的血凝谱，显示了这两种病毒有一定的相似之处。3.246份血清用该病毒株和ND分别作为抗原所做的HI中，可以发现抗体的分布具有一定规律，两种抗体同时存在，而且抗体的效价相差无几。这显示了两种病毒存在很大的联系，和前阶段的创新研究相吻合。总结前期创新工作和现阶段研究，我们认为该病毒株很有可能是新城疫病毒的变种。在进行现阶段工作的同时，我们还继续进行病毒的分离，有针对性地从犬中采集样品，现已再分离到三株可疑毒株，初步鉴定其特性发现与本文所提的类副粘病毒毒株极其相似，为该病毒的研究进一步提供了材料和证据。血清中普遍存在该病毒抗体表明了犬只可能曾经耐过感染该病毒，并且有可能曾在较大范围内流行。从所采样的血清看，有21份是有抗体存在，根据以往的经验抗体效价在达到1：128以上其才有保护作用，而上面的血清中达到这个效价的只有1份；ND病毒抗体存在22份血清，达到有效保护效价的也只有1份。在犬的常规免疫程序中（七联苗或五联苗）包含有犬副流感病毒疫苗，该疫苗刺激机体所产生的抗体对该副粘病毒毒株所产生的抗体的表达是否有影响尚未清楚，有待深入研究。去年美国数州都出现了犬流感病例，该病毒也是变异而来，患病犬大都是与人类关系密切的宠物犬，而他们的主人也因为这种迅速传播的犬类疾病而陷入恐慌。其主要症状包括低烧、流涕、咳嗽，致死率约为5%，而且抗生素治疗无效。美国研究人员通过对病毒进行基因检测发现，这种狗流感病毒是由之前在马群中流行的H3N8流感病毒变异而来。从马到狗，流感病毒变异速度如此快，超出了之前流感病毒变异的速度。本文所提副粘病毒毒株与新城疫病毒有相同的F片段，而且试验证明它对鸡有致病作用，血清学的结果也显示和NDV相类似。在犬的攻毒试验中犬只也表现出与流感相似的症状。随着近年来我国宠物市场的快速发展，这种病毒要是像美国爆发犬流感一样肆虐，那么对宠物行业将会是毁灭性的打击，因此该病的预防和控制就显得尤为重要，对该病毒进行深入的研究，也就具有重大的应用前景。但由于对该病毒的致病性没有一个推荐的判断标准，本研究只对分离毒株的部分生物学特性进行了测定和研究，其毒力和致病性尚需要进一步研究。3.3本试验采用血清学、形态学、生物特性等方法首先证实了我省该病毒的存在，为该病毒的下一步研究打下了坚实的基础；同时也提示宠物犬群已受到该病毒的威胁，由于其对公关卫生具有重大影响，应引起有关方面的高度重视。致谢:

在本论文的撰写过程中，贺东生老师一直给予我们重要的指导和帮助，为我们解开了无数的困惑，提供了很多关键性的建议。此外感谢傅道华、卢东城师兄在前期的创新课题中所做的工作；实验员曾丽娟帮助器械的消毒和准备，为实验顺利开展提供了很大的帮助。在论文即将完成之际，我的心情无法平静，从开始进入课题到论文的顺利完成，有多少可敬的师长、同学、朋友给了我们无言的帮助，在这里请接受我们诚挚的谢意！

参考文献：[1]officeInternationaldesEpizootes.Newcastledisease[s]InternationalHealthcode,9thed.2000.(http://w.oi