bb基因诊断与基因治疗

bb基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗

GeneDiagnosisandGeneTherapyLaboratoryofMolecularVirology,InstituteofVirology,WuhanUniversitySchoolofMedicine6/6/20252第一节基因诊断（genediagnosis）一、定义：Definitionofgenediagnosis基因诊断：用分子生物学技术对导致疾病的原因进行病原学和细胞遗传基因的检测分析,从而对相应疾病进行诊断。

Geneticdiagnosisisatestusingmolecularbiologytechnologiestoseekthecausesofdiseasesthroughanalysisofpathogensandgenes.6/6/20253基因诊断的靶分子是基因。

Thetargetsofgenediagnosisaregenes6/6/20254传统的疾病诊断：Conventionaldiagnosticapproaches

细胞形态、数量celluarmorphology&celluarquantity生化反应、酶活性biochemicalreaction,activitiesofenzymes免疫学检验Immunologictests

6/6/20255检测表型或形态学改变detectionofphenotypicormorphologicfeatures

检测对象是基因的产物--蛋白质、多肽。Detectionobjectsareproductsofgenes,suchasprotein,polypeptide

6/6/20256二、基因诊断常用的技术：

Technologiesincommonuse

分子杂交技术(Nucleicacidmolecularhybridization

)PCR技术(Polymerase-Chain-Reaction)3.以上二者的衍生技术（包括DNA芯片）derivativetechnologiesfromabovetwotechnologies,DNA-Chips4.DNA序列测定DNAsequencing

6/6/20257基因诊断独特的优点：Advantagesofgenetherapy

从分子水平上找到特异的致病基因Tofindpathogenicgenes

atthemolecularlevels

具有很高的灵敏度Highsensitivity

6/6/20258获得稳定的结果StableResults

核酸比蛋白质稳定Nucleicacidismorestablethanthatofprotein.快速、早期诊断技术Speedy&early

甚至在未出现症状的情况下早期诊断应用广、适用性强Wideapplicability6/6/20259三、基因诊断策略Strategiesforgenetherapy（一）通过致病基因的检测诊断疾病Diagnosisofdiseasesviapathogenicgenes

6/6/202510基因的结构清楚、突变点明确、致病机制基本清楚。Structure,mutation

andpathogenicmechanismofpathogenicgenesareclearlyunderstood.6/6/2025116/6/2025121)单基因遗传病eg.monogeneticorsingle-genedisease

镰状细胞贫血Sicklecellanemia

→珠蛋白基因globingene

Codon6GAG→GTGA-T突变(mutation)谷氨酸(glutamic)→缬氨酸(valine)

6/6/2025132)、Gene缺失遗传病的诊断1)α地贫的Gene诊断α基因不同程度的缺失引起不同类型的α地贫，α基因缺失1～4个。正常Gene组用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一个αGene时可得到10kb片段。BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobe6/6/202514以αGene为探针，Southernblot方法检测αα/αααα/α-αα/--α-/----/--

正常缺1缺2缺3缺414kb10kb6/6/2025153)DMD/BMD的缺失诊断

（进行性肌营养不良或假肥大型）DMD是一种严重致死性疾病（XR），临床症状表现肌肉进行性萎缩和乏力。BMD临床症状与DMD相似，但症状较轻。Gene定位Xp21，Gene2300kb,79个Exon，cDNA全长13974bp编码3685Aa，分子量427kD。DMD/BMD70%左右为缺失型，基因很大，缺失可能发生在不同的部位。应用多重PCR扩增检测，判断缺失状态。6/6/202516（二）通过连锁遗传标志检测诊断疾病Diagnosisvialinkagegeneticmarker

基因结构、突变情况不清楚，但已知定位在染色体的特定位置上。Chromosomelocationofpathologicgenesisclear,butthestructureandmutationofthegenesareunclear.

6/6/202517同一染色体上位置十分靠近的基因或其他遗传标志,常常一起遗传,形成连锁（linkage）.Thegenesorothergeneticmarkerslocatednearatthesamechromosomecanbeinheritedtogether,andtoformlinkage.6/6/202518例如：具体基因不明的遗传病Hereditarydiseasecausedby

unidentifiedgenes用内切酶切正常母亲DNA，杂交后出现7.6kb带；同酶同方法检查有遗传病的父亲，发现6.0和7.6kb两种片断，表明6.0kb与基因病有连锁关系。这样当胎儿羊水或胚胎绒毛细胞同样处理后，仅出现7.6kb片段，表明胎儿正常，如果同时有6.0和7.6时，表明胎儿携带有父亲的遗传病基因。

6/6/2025191、Gene异常不明确的遗传病的诊断例：成年型多囊肾病——APKD，AD，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。APKD——Gene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证实APKDGene与α珠蛋白基因3`端附近的一段小卫星DNA序列（3`HVR）紧密连锁，因此，可以通过RFLP连锁分析进行诊断。6/6/202520

以3`HVR为probe与PvuII酶切后的家系有关成员的Gene组DNA杂交——SouthernBlot杂交Gene组DNAprobe（3`HVR）PvuII酶切

DNA片段

杂交结果6/6/202521

英国女王维多利亚。她带有血友病的基因，并将其传给了她的儿女。血友病是一种遗传性凝血障碍疾病，患者可能因很小的伤口而出血不止导致死亡。血友病在女性一般表现为隐性遗传，较少发病，但会传给后代；在男性则表现为显性遗传，显示出病症。维多利亚女王在科堡主持的一次欧洲王室成员集会，与会者有17人是她的后裔，其中有她的孙女亚历山德拉（21），她同俄国沙皇尼古拉二世结婚，导致他们的儿子患有血友病。6/6/202522PCR—RFLP诊断甲型血友病的基因诊断，已知甲型血友病XR，获得家系成员基因组DNA。PCR142bpBcLI

142bp99bp43bp电泳结果分析？p1p2142bp99bp43bpBclIBclI-BclI+6/6/202523问:1/Ⅱ2、Ⅲ1诊断；2/Ⅲ1是男或是女发病？

142bp99bp12123ⅠⅡIII16/6/202524结果分析1）先症者II2具有99bp片段而发病，该片段来自母亲。2）II2有142bp/99bp杂合子。142bp来自父亲，为正常片段，99bp片段是来自母亲而成为携带者。3）Ⅲ1为99bp片段如果是男性为患者（99bp片段来自母亲）；女性为携带者（来自父母双方）6/6/202525连锁分析(geneticlinkageanalysis

)就是在家系成员中寻找患病成员共同具有的比正常成员出现频率更高的染色体片段.Thesearchforcertain

chromosomefragmentsthatarefoundinpeoplewithadisorderaremorefrequentlythanyouwouldexpectinpeoplewithoutthedisorder.6/6/202526在这个区域内具有疾病倾向的基因Thegenewithsusceptibilitytodiseaseislocatedintheregion.6/6/202527遗传标记选择Geneticmarkerselection

：多标记原则Mult-markerprinciple靠近原则Convergenceprinciple6/6/202528不是寻找DNA缺陷(DNAdeficiency),而是通过分析DNA遗传标记多态性来判断被检者是否具有带致病基因的染色体,判断被检者患病的可能性Itisananalysisofpolymorphismofgeneticmarkertodecidewhetherthechromosomeiscarryingthepathogenicgene,butnotasearchforDNAdeficiency.6/6/202529（三）通过基因表达的定量分析诊断疾病Diagnosisofdisordersviaquantitativeanalysisofgeneexpression基因表达水平的变化,可引起相应蛋白质的含量变化。variationin

geneexpressionlevelsisrelatedtovariationin

itsproteinlevels

6/6/202530定量PCR技术可用于基因诊断，也可用于治疗效果监控。Applicationofreal-timepolymerasechainreactiontogenediagnosisandmonitoringoutcomeoftherapy6/6/2025316/6/202532四、基因诊断存在的问题及前景Problemsandprospects

inthegenediagnosis1、理论问题theoryproblems.6/6/202533已找到的致病基因不多，弄清机制的就更少。基因诊断失去了基础。Littleisknownaboutpathogenicgenes,andlessisknownaboutthemechanism.Genediagnosislosesitsfoundation6/6/2025342、技术问题technicalproblems

对设备及条件要求高、所需试剂价格昂贵。highrequirementsforequipmentsandconditions&highexpenseforessentialregents

6/6/202535技术复杂、精细，对操作人员的要求高。Thevarietyandcomplexityoftechnologyhasalsogrownandweneedaprofessionthatdealswiththissituation6/6/202536技术灵敏度高，很容易受到污染而出现假阳性。Falsepositiveresultsmaybeobtainedbycontaminationduetothehighsensitivityoftechniques

.6/6/2025373、伦理问题ethicalconcerns可能引起基因歧视（Itmaycauseageneticdiscriminationbygenediagnosis）

6/6/2025386/6/202539基因诊断的发展前景Futureprospectsforgenediagnosis

呈现十分广阔的应用前景，发展潜力巨大。

genediagnosishasawideapplicationandagreatpotentialinfuture.6/6/202540五、已进行基因诊断的遗传病Inheriteddisordersdetectedbygenediagnosis（一）血红蛋白病（hypochromia）镰状细胞贫血（sicklecellanemia）→珠蛋白基因globingeneCodon6GAG→GTGA-T突变谷氨酸(Ghe)→缬氨酸（vol）

6/6/202541α（β）地中海贫血α（β）MediterraneanSeaanemia

α（β）珠蛋白基因缺失，珠蛋白mRNA含量减少，珠蛋白α（β）链合成不平衡。Defectinα（β）globin,andreductionofglobinmRNAproduction,whichleadstoanimbalanceinα:βchainratio.6/6/202542诊断Diagnosis：PCR-ASO（allelespecificoligonucleotide,ASO)6/6/202543定性分析(qualitativeanalysis)：PCR定量分析(quantitativeanalysis)

：实时定量RT-PCRReal-timequantitativePCRassay

6/6/202544杜氏肌营养不良（Duchennemusculardystrophy,DMD)---性连锁隐性遗传病（Sex-LinkedRecessiveInheritance），抗肌萎缩蛋白（dystrophin）基因突变所致DuchenneMuscularDystrophyiscausedbythegenemutationofdystrophin.6/6/202545苯丙酮尿症（phenylketonuria，ＰＫＵ）－－常染色体隐性遗传氨基酸代谢病autosomalrecessivegeneticdisorders

ofaromaticaminoacidmetabolism

苯丙氨酸羟化酶基因突变phenylalaninehydroxylasegenemutation丙氨酸羟化酶缺乏phenylalaninehydroxylasedeficiency6/6/202546脆性Ｘ综合症fragileXsyndromeFMR-1基因的微卫星序列（CGG）n改变，导致功能变异。ThemutationinCGGrepeatofFMR1geneleadstoalteredfunction.6/6/202547可通过检测串联重复序列的长度来进行。Wecanexaminethediseasebydetectingthelengthoftandemrepeatsequences.6/6/202548

基因诊断技术检测肿瘤Therolesofgenediagnosistechnologyindetectionofcancer１）肿瘤的早期诊断和预警诊断Earlydiagnosis&earlywarningoftumours6/6/202549２）高危（易感）人群筛查及危险性评估Screenforhighriskorsusceptiblegroup&RiskAssessment

6/6/202550３）肿瘤鉴别诊断、分期、预后判断Distinctivelydiagnosis,stagingandprognosis４）微小转移灶识别Detectionofmicrometastases

6/6/202551５）治疗效果监测及评价Assessment&surveillanceof

therapyeffects6/6/202552对不同肿瘤、不同目的，采取不同的基因诊断策略

Differentstrategiesfor

differenttumorcells,

differentpurposes6/6/202553肿瘤基因诊断主要策略有Mainstrategiesforidentifyinggenesinvolvedintumours检查肿瘤染色体易位及融合基因Detectionofchromosometranslocation&fusiongenes

6/6/202554检查癌基因与抗癌基因Detectionofoncogenes&tumorsuppressorgenes6/6/202555检测肿瘤相关基因Detectionoftumor-relatedgene

检测肿瘤标志物或mＲＮＡ等DetectionofmarkersandmRNAoftumor6/6/202556基因诊断技术检测感染性疾病Genetherapytechnologies

inthediagnosisofinfectiousdiseases

细菌、病毒、寄生虫感染(infectionofbacteria,virusandparasite）6/6/2025576/6/202558第二节基因治疗（genetherapy）是现代分子生物学技术与医学学科交叉渗透而形成的一个全新治疗领域。Genetherapyisanewcross-discipline,whichcoverstechnologiesinmodernmolecularbiologyandmedicalscience.6/6/2025596/6/202560基因治疗早期是将目的基因导入靶细胞内，成为宿主细胞遗传物质的一部分，Earlypurposeofgenetherapyistomaketargetgenesbecomeapermanentpartofthehostcell'sgeneticmaterialbyinsertingtheirgeneticmaterialintothechromosomesofhostcells.

6/6/202561目的基因的表达产物对疾病起治疗作用。

Therapeuticeffectofexpressionproductsofgenesofinterestondiseases.6/6/202562现在:将正常基因导入病变细胞中，替代或与缺陷基因共存，产生正常表达产物补充缺陷蛋白质Delivernormalcopyofageneintopathologicalcellstosupplementtheproteinthatarenotexpressingenough.6/6/202563抑制细胞内过度表达的基因；Delivernucleicacidthatwillinactivateanover-expresseddeleteriousprotein.6/6/202564将特定基因导入非病变细胞，在体内表达特定产物；andtransfergivengeneintonormalcellstoletitexpressgivengeneproducts.6/6/202565向功能异常细胞中导入该细胞中本来不存在的基因，利用表达产物达到治疗疾病的目的。addafunctionalcopyofthetherapeuticgenetocellswithdysfunctionthatoriginallydonotexpressit.

利用基因产生治疗效应。andmakeuseofgenestoproducethetreatmenteffect6/6/202566第一节基因治疗策略

Strategiesforgenetherapy基因置换（genereplacement）或基因矫正（genecorrection）－－将特定目的基因导入特定细胞置换原有的缺陷基因。Anormalcopyofagenemaybeintroducedintocellstoreplaceadefectivecopy.6/6/202567必要条件是：Essentialconditions对导入的基因及其产物有详尽的了解.Fullunderstandingaboutthetransferredgeneanditsgeneproductisessential.能有效的导入靶细胞Theabilityofbeing

transferredefficientlyintotargetcells

在靶细胞中长期稳定存在Long-termandstablegeneexpressionintargetcellsisdesired.6/6/202568导入基因有适度水平的表达Keepingtransferredgeneexpressingatamoderatelevel.导入方法及载体对细胞无害Themethodsofgenetransferandvectorsmustbeharmlesstothetargetcells.6/6/202569一般采用同源重组技术（homologousrecombination）又称基因打靶（genetargeting）Generallyadoptthistechniqueofhomologousrecombination,genetargeting.6/6/2025706/6/2025716/6/202572２.基因替代(genereplacement)、基因添加(geneaddition)、基因补充(genesupplement)、

.6/6/2025731)针对特定的缺陷基因,导入相应的正常基因(缺陷基因并未除去)Transferafunctionalcopyofthegeneintotargetcellsbyaimingataparticulardefectgene

(andthedefectedgenecanbekept).2)导入靶细胞本来不表达的基因(将细胞因子导入肿瘤细胞)Transfertheinterestgeneintotargetcellsthatareoriginallynotexpressingthegeneproduct(bygettingcytokineintotumorcells)6/6/2025743.基因干预(geneinterference)采用某些方式抑制某个基因的表达或通过破坏某个基因的结构使之不能表达,达到治疗目的.Toattainthetreatmentpurpose,geneinterferenceiseithertoextinguishexpressionfromthemutationalleleorbreakthestructureofacertaingene.6/6/202575三种策略是以恢复细胞正常功能或干预细胞功能为目的.Thepurposeofabovethreestrategiesistoresumethenormalfunctionorintervenethefunctionofcells.6/6/2025764.细胞自杀效应Suicidegenetherapy

通过导入自杀基因,诱发细胞自杀效应也是重要的治疗策略.Inductionofsuicideeffectviadeliveryof“suicide”genesintotargetcells,suchastumorcellsisalsoanimportanttreatmentstrategy

6/6/202577自杀基因是病毒、细菌等原核生物中具有特殊功能的酶类基因，此类基因转入哺乳动物细胞后产生的酶能将无毒或毒性极低的药物前体转化成细胞毒性代谢产物，导致肿瘤细胞自杀，因此又称为病毒导向酶解药物前体疗法(VDEPT).6/6/2025786/6/2025795、基因修饰(genemodification)也属于基因添加，但目的不是修复、改善细胞功能，而是改变细胞功能。6/6/2025801）基因修饰肿瘤细胞的“疫苗”疗法：将IL-2、TNF-导入肿瘤细胞，诱发抗肿瘤细胞毒性淋巴细胞反应；另分泌的细胞因子增强CTL和效应细胞反应。6/6/2025812）基因修饰TIL的过继疗法：将细胞因子导入肿瘤侵润淋巴细胞中，使TIL具有更强的抗肿瘤作用6/6/2025823）免疫增强基因疗法：将MHC-I类基因导入肿瘤细胞，增加其免疫原性。6/6/202583

第二节基因转移技术Genetransfertechnologies

基因治疗方式有两种：Mannersofgenetherapy1）体内法（invivo）2）回体法（exvivo）6/6/202584CellsremovedfrombodyTransgenedeliveredCellsculturedCellsreturnedtothebodyExVivoInVivoTransgenedelivereddirectlyintohostStrategiesforTransgeneDelivery6/6/202585invivo即将外源性功能基因以逆转录病毒、质粒载体或脂质体类包囊，或以裸露DNA的形式直接注入体内，让基因在体内表达。Amethodoflettingaforeignfunctionalgeneexpressinvivobytransferofretrovirusvector,plasmidvector,liposomeorthedirectinjectionof'nude'DNA.

6/6/202586exviro即将受体细胞（例如淋巴细胞、骨髓干细胞、皮肤或纤维细胞等）在体外培养导入外源性功能基因，然后把这种经遗传修饰的受体细胞输回或移植入患者体内，让外源基因表达。Amethodoflettingaforeignfunctionalgeneexpressbytransferringthegeneintotargetcells(eg.Lymphocytes,hematopoieticstemcells,skinorfibercells,etc.)culturedexviro,andthentransfusingortransplantingthegeneticmodifiedcellsintothepatientbody.

6/6/2025876/6/2025886/6/202589基因治疗必须通过适当的基因转移(genetransfer)技术,将外源基因转移至特定细胞内.Genetherapyreliesintheconceptthat“foreign”genesmaybetransfertotargetcellsusingappropriategenetransfertechnologies6/6/202590基因转移技术有两大类Methodsofgenedelivery:生物学方法Biologicalmethods(病毒介导的基因转移系统Viralmethods)非生物学方法Non-Biologicalmethods

(物理或化学方法PhysicalorChemicalmethods)6/6/202591逆转录病毒载体(retrovirusvector)是基因治疗中最常用的载体,转移效率较高.Themostcommonvirusvectorsthatareusedingenetherapyareretrovirusvectors一、基因转移生物学方法Biologicmethodsofgenetransfer6/6/2025926/6/202593基因组是二倍体ss+RNAThegenomeisdiploid.类似真核mRNA，similarinstructuretoeucaryoticmRNA5`端帽状结构，5`cappingstructure3`端多聚A尾,3`poly-Atail6/6/202594前病毒基因组结构特点：Charactersofprovirusgenome1)两端各有一长末端重复序列LTR（由U3、R、和U5组成），LTR中含有启动子、增强子、加尾信号。Alongterminalrepeat(LTR)ofendogenousretrovirusislocatedateitherendofgenome(composeofU3,RandU5).LTRcontainstheelementsincludingpromoter,enhancerandtailingsignal.6/6/202595

是病毒整合进细胞基因组的过程的关键结构。Itisthekeystructurefortheintegrationofviralgenomeintothechromosomeofhostcells,formingtheprovirus.

6/6/2025962）有三个结构基因:gag、plo和envItcontains3structuregenes,gag,ploandenv

分别编码核心蛋白、逆转录酶和外壳（包膜）糖蛋白,encodingcoreprotein,reversetranscriptaseandenvelopeglycoprotein,respectively.6/6/202597

6/6/2025983）5‘端LTR下游有病毒包装所必需的序列、引物结合位点等。Thereareasequencerequiredforefficientpackagingofvirusandaregionofprimerbindingsiteatthedownstreamof5’LTR.6/6/202599retrovirusvector6/6/2025100用于基因治疗的逆转录病毒载体系统由两部分组成：Retroviralvectorsystemthatcanbeusedforgenetherapyisconstitutedbytwoparts.将前病毒DNA中编码蛋白的基因切除，Cutoffthegenegenesencodingviralproteins,保留顺式元件、包装信号,andkeepcis-actingelementsandpackagingsignals插入质粒toinsertaplasmid----逆转录病毒载体formingaretroviralvector.6/6/2025101包装细胞（packagingcell）是将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转录病毒（辅助病毒）导入哺乳动物细胞而制备成的特殊细胞。Packagingcellsareakindofspecialcelllinesthatcanenabledefectiveretrovirus(helpervirus)thatlackpackagingsignalsandcorrelationsequencetotransferintomammalcells.6/6/2025102将上两部分结合使用即可产生携带治疗基因，而只有一次感染能力的病毒颗粒------假病毒颗粒（pseudoviralparticles）Combineabovetwoparttoformpseudoviralparticlesthatcarrytherapygeneandcaninfect(ortransduce)targetcellsonlyonce.6/6/2025103假病毒感染效率非常高Highefficiencyoftransfection.用于体内基因治疗时，只能感染增殖期细胞，有一定局限性。Thelimitedabilityofonlyinfectingdividingcellswhenusedingenetherapy.6/6/2025104逆转录病毒载体(retrovirusvectors)腺病毒载体（adenovirus,Advectors）腺相关病毒（adenoassociatedvirus，AAvvectors）载体单纯疱疹病毒（herpessimpexvirusvectors）载体TypesOfViruses6/6/2025105NakedDNATargetCellTherapeuticProteinAAVRetrovirus/LentivirusAdenovirusNucleusGeneTherapyPrinciples6/6/20251066/6/20251076/6/2025108二、基因转移非生物学方法脂质体（liposome）介导基因转移利用阳离子脂质单体与DNA混合，可自动形成包埋外源DNA的脂质体，再通过细胞的内吞作用（endocytosis）将外源DNA转移至细胞内。Liposome,positivelychargedlipiddroplets,caninteractwithnegativelychargedforeignDNAtowrapitupanddelivertocellsviaendocytosis.

6/6/20251092.细胞表面受体介导的基因转移Genetransferviacellsurfacereceptors

受体介导的细胞内吞作用是转移特异性外源物质进入细胞的一种方式。Receptor-mediatedendocytosis

isoneofmannersoftransferringforeignmatterintocells.6/6/2025110细胞膜上存在一些专一性受体，与相应的配体结合后，通过细胞的内吞作用，实现配体向细胞内转移。Thespecificreceptorsofcellmembranecancombinewithcorrespondingligands,andtransfertheligandsintocellsviaendocytosis.6/6/20251116/6/2025112将外源DNA与已证明有细胞或组织亲和性的配体偶联，可使DNA具有靶向性。Thetarget-specificactionofgenedeliverycanbeincreasedbycouplingligandswithhighcellortissueaffinity

withforeignDNA..6/6/2025113偶联通常用多聚阳离子(condensedcation)，如多聚赖氨酸(polylysine)来实现。Couplingcanberealizedbycondensedcation,suchaspolylysine6/6/2025114如：仅在肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白（ASGP）受体，它的天然配体是ASGP。带有这种配体的DNA复和物可被定向送入肝细胞。Asialoglycoproteinreceptor(ASGP—R)isonlyexpressonthesurfaceofhepatocytes,anditsnaturalligandisasialoglycoprotein.DNAcomplexcarryingtheligandcanbetransferreddirectionallyintohepatocytes.6/6/20251153.直接注射进行基因转移(DNAinjection)–直接将裸DNA注入动物或器官组织内。‘Nude’DNAisdirectlyinjectedintoanimalsor

tissues.

6/6/2025116外源基因在肌肉中的表达量与注入的DNA含量成正比；TheamountofforeigngeneexpressionsinmuscleisindirectratiotothatofDNAdeliveredbyintramuscularinjection.重复注射比一次注射效果好。Theeffectofrepeatedinjectionismoreeffectivethanthatofsingleinjection.6/6/20251176/6/2025118优点：Advantages制备简单easytohandle排除病毒致癌的潜在危险withoutcarcinogenic

riskofvirus6/6/2025119不需整合即可表达expressionwithoutneedingintegration可反复使用andcanbeadministeredagainandagain.6/6/2025120三、基因转移的靶细胞

Targetcellsusedingenetransfer目前条件下，基因治疗仅限于体细胞（严禁进行生殖细胞的基因治疗操作）Allcurrenthumangenetherapyapproachesaretargetedtosomaticcellsnotgerm-linecells.6/6/20251216/6/2025122

Somaticgenetherapy

6/6/2025123

选择转移基因的靶细胞，要考虑几点：Howtoselecttargetcellsforgenetransfer?1）最好是组织特异性细胞Tissuespecificcellsarebetter.2）细胞较易获得，Itiseasytoobtain.3)生命周期较长Lifecycleislong.

6/6/20251244）易受外源物质转化Itiseasytobetransformbyforeignfactors5）转染后细胞仍易成活Itiseasytosurviveaftertransfection.

6/6/2025125目前已开展的研究的靶细胞有：Targetcellsinpresentstudies造血干细胞(hematopoieticstemcells)、淋巴细胞(lymphocytes)、皮肤成纤维细胞(skinfibroblasts)、肝细胞(hepatocytes)、血管内皮细胞(vascularendothelialcells,)、肌细胞(muscularcells,)、神经元和神经胶质细胞(neurons&glialcells)、肿瘤细胞(tumourcells)等andsoon.6/6/2025126exvivoretroviralvectors(oncoretroviralorlentiviral)invivoadenoviralvectorsAAVvectorslentiviralvectors6/6/2025127第三节基因治疗的应用

applicationsofgenetherapy1990年基因治疗的第一个病例是先天性腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症Thefirstdiseaseapprovedfortreatmentwithgenetherapywasadenosinedeaminase(ADA)deficiencyin1990.

6/6/2025128

美国医学家W·F·安德森等人对腺甘脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例。

1990年9月14日，安德森对一例患ADA缺乏症的4岁女孩谢德尔进行基因治疗。这个4岁女孩由于遗传基因有缺陷，自身不能生产ADA，先天性免疫功能不全，只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中，这种白血球都已经过改造，有缺陷的基因已经被健康的基因所替代。在以后的10个月内她又接受了7次这样的治疗，同时也接受酶治疗。经治疗后，免疫功能日趋健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活。

谢德尔，19996/6/2025129一、对遗传病进行基因治疗Genetherapyofhumangeneticdisease

研究范围十分有限，须符合以下条件：Therangeofresearchisverylimited,whichmustmatchthefollowingconditions.1）在DNA水平上明确发病原因及机制Todefinethecausesandmechanisms

ofdiseasesattheDNAlevel.6/6/20251302）必须是单基因遗传病Itmustbeamonogeneticorsingle－genedisease.6/6/20251313）表达不需要精确调控Accurateregulationofgeneexpression

isnotessential.4）该遗传病不经治疗有严重的后果Severeresultsmaybegotwithouttreatment.6/6/2025132二、对恶性肿瘤的基因治疗CancerGeneTherapy较少涉及伦理问题，Lessethicsproblems临床迫切需要，Itisneededurgentlyintheclinic.肿瘤的基因治疗已走在前列。Thegenetreatmentoftumorshasalreadywalkedinadvance.6/6/2025133基因疗法成为不少癌症病人挽救生命的唯一选择。Theonlychoiceistosavecancerpatients.6/6/2025134治疗策略StrategiesofTherapy：导入抑癌基因以抑制癌的发展、转移Transferoftumorsuppressorgenestoinhibittumorgrowthandmetastasis.6/6/2025135干扰癌基因的转录和翻译，抑制癌基因活性Interferewithtranscriptionortranslationofoncogeneinordertoinhibitoncogeneactivity6/6/2025136对瘤组织进行细胞因子修饰，增强肿瘤细胞的免疫原性Modifycytokinegeneexpressionintumortissuebytransferring

genesto

enhanceimmuneresponse.导入自杀基因，杀伤癌细胞Transferofsuicidegenestocausedeathofcancercells.6/6/2025137三、病毒病的基因治疗GeneTherapyofvirusdisease抗病毒基因治疗十分引人注目。包括调节机体免疫功能和针对病毒本身两个方面。Theanti-virusgenetherapyisveryarrestive.Regulationofimmunologicalfunctionanddirecttreatmentofvirusaretwowaysofanti-virusgenetherapy.6/6/2025138前者主要是将细胞因子（干扰素、白介素）的基因导入免疫细胞，诱导机体对病毒的细胞和体液免疫应答。

Transductionof

cytokinegeneseg.interferonandinterleukin

toinduceshumoralandcellularimmuneresponsesagainstvirus.6/6/2025139后者Thelatter：1）诱导对病毒RNA的降解inducedegradationofviralRNA2）抑制病毒与宿主细胞结合inhibitvirustocontactwithhostcells

3）干扰病毒基因组的转录起始interferethetranscriptioninitiationofviralgenome.6/6/2025140抑制病毒复制和蛋白合成inhibitviralreplicationandprotein

synthesisRNA干扰(RNAinterference,RNAi)6/6/2025141.干扰RNA，RNAi哺乳动物中的研究1999年才开始被认为是最有前途的核酸药物《Science》杂志将这一新发现评为2002年度世界十大科学成就之首.6/6/2025142In1990,RNAsilencingwasfirstobservedinplants.Thisphenomenawascalled“cosuppression”or“PTGS”(posttranscriptionalgenesilencing).PlantCell,vanderKroletal.1990,2(4):291-299ThehistoryofsiRNA6/6/2025143a起始阶段：由于RNA病毒感染、转座子转录和外源导入基因表达等原因,生物体细胞内出现双链RNA(dsRNA),dsRNA在一种具有RNaseⅢ样活性的dsRNA特异性核酸内切酶(dsRNAspecificendonuclease,Dicer)作用下,被裂解成由正义和反义链组成的21～23nt的干扰性小RNA(smallinterferingRNA,或shortinterferingRNAs,siRNA).6/6/2025144b效应阶段：目前认为该阶段存在两种假说模式,一种假说模式是认为siRNA作为向导序列,与RNA诱导的沉默复合物(RNAinducedsilencingcomplex,RISC)的无活性前体结合,在ATP参与下siRNA双链结构解旋诱导形成有活性的RISC,活性RISC随即与同源性靶向mRNA结合,在与siRNA反义链配对区域的中部切断同源性靶向mRNA,使其降解,从而干扰基因表达,这称为内源性核苷酸裂解(endonucleolyticcleavage)6/6/2025145另一种假说模式为随机降解性多聚酶链反应(randomdegradativePCR),即siRNA作为针对靶向mRNA特殊引物,在RNA依赖性RNA多聚酶(RNAdependentRNApolymerase,RdRP)的作用下以靶向mRNA为模板合成靶向mRNA的互补链,使单链mRNA成为dsRNA,然后在Dicer酶的作用下被降解形成新的siRNA,新的siRNA又进入上述过程,反复循环，从而形成信号扩增系统.6/6/2025146MechanismofShortinterferingRNAs—post-transcriptionalgenesilencing.6/6/2025147四、其他疾病的基因治疗Genetherapyofotherdisorders人神经退化疾病humanneurodegenerativediseases

（如帕金森氏病Parkinson'sdisease)6/6/2025148Morethan1.5millionAmericanssufferfromParkinson'sdisease.Thereisnocure.Butnowthereisanewtreatmentthatmayimprovepatients'qualityoflif