HPLC流动相的配制与使用

HPLC流动相的配制与使用

流动相是影响液相色谱的关键因素。一个理想的液相色谱流动相溶剂

应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。

高效液相色谱法中的流动相主要用水性溶剂、有机溶剂或它们的混合

液，但是如何配制。选择配制的方法不同，分析结果特别是保留时间，

是会有显著差别的。

高效液相色谱法中的流动相主要用水性溶剂、有机溶剂或它们的混合

液，水性溶剂也常用于缓冲液。常因资料上表示的内容和实际的配制

方法不同，而产生流动相的差异，影响了色谱图和分析结果。一般来

说，溶剂的混合按体积比（V/V）或重量比（W/W）进行。溶液的体积

因温度而变化，所以按重量比混合可调制再现性较好的混合溶剂，但

由于操作较麻烦，通常多用体积比混合。只要没有特别标明，就可按

体积比进行混合，但在特殊情况下，如胺类粘度高的溶液混合时，有

时用重量一体积比（W/V）的方法。

液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的

目的，因此要求流动相具备以下的特点：

a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱

中（或长时间保留在柱中）。流动相溶解度达不到要求时，尽量选用流

动相中含有的比例较大的成分，以减轻进样对流动相的影响造成基线

不稳。

b、流动相与样品不产生化学反应，选用流动相配置对色谱峰影响最

c、流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低柱压降，

延长泵的使用寿命（可运用提高温度的方法降低流动相的黏度）O

d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，

最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。流动相组成溶剂均达不到要求

时，选取的溶剂应保证在设定波长内尢紫外吸收。

e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。

f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微

量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。

下面21项注意让你更懂液相流动相。

1、选择流动相应注意过滤溶剂

溶剂在使用前一定要用0.5um的过滤器过滤，如果使用固体化学试

剂（缓冲盐）配制流动相，过滤特别重要，不能让固体微粒污染泵，

阻塞进样器和柱头过滤片。本实验室有水溶性和脂溶性两种过滤膜供

选择（反光面朝上），过滤水溶性流动相时（如甲醇/水），先用1〜

2mL甲醇润湿过滤膜，有助于快速抽滤。

2、注意保持储液瓶的清洁

用普通溶剂瓶作流动相储液器应不定期废弃瓶子，最后一次应用HPLC

级的水或溶剂清洗，不能在清洗过程中留下污迹。

3、注意保证溶剂的质量

一定要用HPLC级的溶剂，水也应达到HPLC级，同样也要使用高纯度

的缓冲盐。

4、注意流动相脱气不充分

流动相受热，或者流动相不同组分混合时会有气体产生，气泡进入泵

内引起压力波动，增加噪音，色谱图上出现毛刺。可试用下列方法解

决问题：流动相再脱气；采用更有效的脱气方法或两种方法配合使用；

改系统内混合为系统外预混合。HPLC所用流动相必须预先脱气，否

则容易在系统内逸出气泡，影响泉的工作。

系统中气泡的产生：流动相本身存在，梯度淋洗混合后放出气泡；气

泡的影响：存在于管路中，系统压力不稳定，实验结果有偏差；存在

于单向阀中，易造成液体回流，流量不准确，甚至是不吸液存在于检

测器中，出现鬼峰，影响检测准确性。所以做液相对流动相的气泡和

杂质要求比较严格。气泡会影响柱的分离效率，检测器的灵敏度、基

线稳定性，甚至使无法检测。（噪声增大，基线不稳，突然跳动）。此

外，溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基

胺）反应。溶解气体还会引起溶剂pH的变化，对分离或分析结果带

来误差。溶解氧能与某些溶剂（如，甲醇、四氢吠喃）形成有紫外吸

收的络合物，此络合物会提高背景吸收（特别是在260mn以下），并

导致检测灵敏度的轻微降低，但更重要的是，会在梯度淋洗时造成基

线漂移或形成鬼峰（假峰）。在荧光检测中，溶解氧在一定条件下还

会引起淬灭现象，特别是对芳香煌、脂肪醛、酮等。在某些情况下，

荧光响应可降低达95机在电化学检测中（特别是还原电化学法），

氧的影响更大。除去流动相中的溶解氧将大大提高UV检测器的性能,

也将改善在一些荧光检测应用中的灵敏度。

常用的脱气方法有：加热煮沸、抽真空、超声、吹氨等。对混合溶剂，

若采用抽气或煮沸法，则需要考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变化。

(1)氨气脱气：氮气脱气是很有效的脱气方法。氮气缓缓的通过流

动相赶去溶入的空气，如果使用得当，在lOmin内可除去8096〜90%

的溶入气体。由于氨气在流动相中的溶解度极低，所以用氮气脱气保

护的流动相可以认为是一个无气体溶解体系。其缺点是氨气价格比较

昂贵，会增加检验成本。一般说来有机溶剂中的气体易脱除，而水溶

液中的气体较顽固。在溶液中吹氮是相当有效的脱气方法，这种连续

脱气法在电化学检测时经常使用。但氮气昂贵，难于普及。

(2)真空脱气：也是比较常用的脱气方法。现在多数企业都最常用

这种办法，贮液器被抽成部分真空，溶入的气体蒸发形成气泡溢出，

其效果仅次于氯气脱气。象Agilengl200液相色谱使用的是在线脱气

机。在线脱气只适合脱完气之后的流动相，在使用过程中的微量脱气。

(3)超声波脱气:将配制好的流动相连容器放入超声水槽中脱气10〜

20mino这种方法比较简便，又基本上能满足日常分析操作的要求，

所以，目前仍广泛采用。这种方法只能除去30%的溶解气体，有时还

会引起气体溶解度的增加。对氧敏感的检测器不宜用此法。超声脱气

比较好，10~20分钟的超声处理对许多有机溶剂或有机溶剂/水混合

液的脱气是足够了(一般500ml溶液需超声20、30min方可)，关于超

声时间问题众说纷纭，各实验室内5〜30分钟不等，一般来说流动相

组成为无机(缓冲盐溶液)时，5〜15分钟即可，流动相为是水和有

机容积混合时，超声时间要相对长一些，这个方法只能除去30%的溶

解气体，时间的延长不和效果成正比，且其中气泡对色谱峰基线稳定

性与信噪比有一定影响，一般来说影响不大，15min超声即可足够。

此法不影响溶剂组成。超声时应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接

触，以免玻璃瓶破裂，容器内液面不要高出水面太多。

（4）加热回流脱气：该方法虽然效果很好，但是适用范围较窄。对

十有机溶剂或混合流动相不适合用此法，因为挥发性组分会损失掉，

改变流动相的组成。

综合来说，用真空抽滤后，再用超声脱气还是最常用的办法，用氢气

的方法是效果最好的办法，而在线脱气本身也是真空脱气，但它可以

放到仪器上使用，是一种保证性的办法。

A.离线（系统外）脱气法不能维持溶剂的脱气状态，在你停止脱气后，

气体立即开始回到溶剂中。在「4小时内，溶剂又将被环境气体所饱

和。

B.在线（系统内）脱气法无此缺点。最常用的在线脱气法为鼓泡，即

在色谱操作前和进行时，将惰性气体喷入溶剂中。严格来说，此方法

不能将溶剂脱气，它只是用一种低溶解度的惰性气体（通常是氮）将

空气替换出来。此外还有在线脱气机。

5、注意流动相供给不畅

流动相用完，管道中吸入气体引起泵压力不稳、。应经常观察储液器中

流动相的量，加足流动相保证所有的样品分析完毕。输液管道上装沉

子沉至瓶底，储液器盖上留一小孔正好夹住进液管，使其不能上下移

动。

过滤器阻塞引起管道和泵腔空化，压力不稳。过滤器被微粒所阻塞或

长霉，去掉过滤器后如果系统运转正常’，说明已找出问题，换上新的

过滤器则可。有时候换上新的过滤器仍然不畅，那就需要查查流动相

的制备过程，或者换大孔径的过滤器。不管如何，流动相都需要重新

过滤。流速过高、阻力大，造成空化现象，这是由于过滤器孔径、管

道内径、流速和溶剂黏度等引起的。如果流速大于10mL/min,常会

出现这种现象。使用下列方法解决：

(1)使用低流速；

(2)换大孔径的过滤器；

(3)增加进液管道内径；

(4)抬高或加压储液器；

(5)不用过滤器，但流动相一定要先过滤；

(6)储液器盖子太紧，在储液器内形成真空，打出的流动相不连续。

应松开盖子或留有1mm的缝隙；

(7)进液管道阻塞或弯曲使泵抽不到液，注意调整进液管道或更换

新的。其它问题包括渗漏或接头松动、泵部件损坏等，都能引起供液

不正常。

6、注意防止流动相和储液器被污染

由于污染，噪音越来越大，检测器基线上升。污染物可能被泵以稳定

的浓度打入系统，而再以稳定的浓度流出来，所以在色谱图中不出多

余的峰。用梯度洗脱时弱流动相可以使污染物聚在柱顶，流动相强度

增加后污染物可能被洗脱出来一个大的伪峰。有时基线噪音突然增大

或突然提高，都是因为反复加进新的流动相或系统用得太久(通宵)

所造成的。

新加进的流动相有污染物或者流动相长霉，繁殖了细菌。脏的储液器

会污染清洁的流动相。每种流动相备有专用的储液器，或者定期报废

储液器。

流动相污染来自这儿个方面：试剂质量不高，玻璃器皿不合格；微生

物的影响；配制流动相时操作不当等，因此要求高纯度化学试剂和

HPLC级溶剂。要注意玻璃器皿按规定清洗干净；为防止微生物生长，

每天要用甲醇清洗系统；怀疑系统内生长了微生物，可用稀硝酸冲洗

即可（注意不要损坏柱和管道系统）；真空脱气时防止泵油带入流动

相；用清洁的惰性塞子、搅棒、过滤器和玻璃器皿配制流动相；已经

污染的流动相一定要废弃掉。

7、注意选择流动相应不改变填料的任何性质

低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶

胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱

系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。

8、选择流动相应注意纯度

色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上

积累时。

9、选择流动相应注意必须与检测器匹配

使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很

小。当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶

剂作流动相，以提高灵敏度。

10、选择流动相应注意粘度要低（应＜2cp）：

高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，

使分离时间延长，最好选择沸点在100C以下的流动相。

11、选择流动相应注意对样品的溶解度要适宜

如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使

柱子恶化。

12、选择流动相应注意样品易于回收

应选用挥发性溶剂

13、选择流动相应注意由强到弱

一般先用9096的乙脂（或甲醇）/水（或缓冲溶液）进行试验，这样可以

很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂（乙月青或甲醇）

的比例。

14、选择流动相应注意三倍规则

每减少10%的有机溶剂（甲醇或乙月青）的量，保留因子约增加3倍，此

为三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中，注意观

察各个峰的分离情况。

15、选择流动相应注意粗调转微调

当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%,并据此

规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。

16、流动相的配制注意有机溶剂和水性溶剂的混合方法

有机溶剂和水性溶剂的混合液作为流动相是经常的，但由于混合方法

不同，有时分析结果相差很大。如20mM磷酸钠缓冲液（pH2.5）90%

与乙睛10%的混合液，混合比为9：1时，20mM磷酸钠缓冲液（PH2.5）

90%与乙腊10%的体积比为9：1,也就是可以解释为各自按体积比例

的相当量称取后进行混合。另外，按10%乙月青解释，用20mM磷酸钠

缓冲液（P1I2.5）,将乙睛稀释调制也可以成立。在后者情况下，产生

混合体积减少部分，余下的添加20mM磷酸钠缓冲液。两者虽然没有

太大的差别，但由于混合方式不同，分析结果，特别是保留时间，也

会有显著的差别，这点必须注意。

17、50%或（V/V=l/1）乙晴水溶液的配制方法

对于用V/V=l/1的表示配制乙月青水溶液，多按这种方法进行：用量

筒测定乙脐500mL,用另一量筒测定水500mL,两种液体在瓶内充分

摇晃混合。不过50%乙懵水溶液的表示时，同样也多是按上述方法配

制，但查化学辞典时，实际上是按这种方法进行配制：首先将500mL

乙月青，注入1L的量瓶中，量瓶边搅拌边加水，等待液温达到室温，

用全量水，使溶液到ILo这样一来，用％表示和“V/V”体积比表示，

最终得出的流动相组成不同。也就是说，混合溶剂的密度，与由原溶

剂密度计算的单纯平均值不相同，所以用上述两种方法调制的流动相

组成差异。如在室温（25℃）附近水50mL和乙脂50mL混合时体积不

是100mL,而有所减少，约为96mL。在一般情况下，多用操作简便的

第一种方法。

18、流动相的配制注意溶剂体积的温度影响

溶液的密度受周围温度的影响。刚从溶剂冷臧箱拿出来的溶液温度与

实验室的室温相比，要低不少，乙月青和水混合液因发热反应，溶液温

度升高。因此，为能调制再现