2021-2025年高考生物真题知识点分类汇编之基因工程（二）

第52页（共52页）2021-2025年高考生物真题知识点分类汇编之基因工程（二）一．选择题（共3小题）1．（2024•安徽）下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（）A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质2．（2023•广东）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（）A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色3．（2023•重庆）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（如图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（）A．其中一个引物序列为5'﹣TGCGCAGT﹣3' B．步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D．酶切片段和载体连接时，可使用E.coli连接酶或T4连接酶二．多选题（共1小题）（多选）4．（2024•湖南）最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（）A．上述PCR反应体系中只加入一种引物 B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C．5′﹣CTACCCGTGAT﹣3′为对照个体的一段序列 D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G三．解答题（共16小题）5．（2024•福建）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。回答下列问题：（1）利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是。（2）将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。（3）为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，应选用桑葚胚的原因是。（4）利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是。（5）若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原因是。6．（2024•江苏）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET﹣SOD构建重组质粒pET﹣SOD﹣ELP50，以融合表达SOD﹣ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列﹣（GTTCCTGGTGTTGGC）50﹣限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：（1）步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是。（2）步骤②转化时，科研人员常用处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET﹣SOD﹣ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是。（3）步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与结合，驱动转录，翻译SOD﹣ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是（从图2的“A～D”中选填）。（4）步骤④为探寻高效纯化SOD﹣ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD﹣ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。（ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是。（ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是。（ⅲ）据图分析，融合表达SOD﹣ELP50蛋白的优点有。7．（2024•重庆）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。（1）基因S启动子的基本组成单位是。（2）通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是。（3）为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是。（4）用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ﹣1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ﹣2的种子也变大，但小于YZ﹣1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是。8．（2024•广西）M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠，主要制作流程见图，实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列，同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（M﹣GFP）的表达，恢复小鼠自身被敲除的M基因功能，同时便于示踪。回答下列问题：注：基因型A/+指的是A基因被嵌合在细胞同源染色体中的一条，即可表示为Aa；两端添加上LoxP位点的M基因称为floxM。（1）在PCR扩增片段①和②时，通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列，该序列添加的位置位于引物（选填“3′端”或“5′端”）。在构建载体1时，为了阻断A基因的表达，从转录水平考虑，连接的片段可以是；而从翻译水平考虑，连接的片段可以是。为了鉴定载体2是否构建成功，需要限制酶切割载体后，再进行。（2）培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液，其目的是（至少答2方面）。（3）为了快速高效繁育出含有4对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M﹣GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交后最终获得基因型为实验模型小鼠。（4）为了实现M基因的表达可控，在实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A蛋白的四环素，抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比，目的是。9．（2024•北京）灵敏的嗅觉对多数哺乳动物的生存非常重要，能识别多种气味分子的嗅觉神经元位于哺乳动物的鼻腔上皮。科学家以大鼠为材料，对气味分子的识别机制进行了研究（1）嗅觉神经元的树突末梢作为感受器，在气味分子的刺激下产生，经嗅觉神经元轴突末端与下一个神经元形成的将信息传递到嗅觉中枢，产生嗅觉。（2）初步研究表明，气味受体基因属于一个大的基因家族。大鼠中该家族的各个基因含有一些共同序列（保守序列），也含有一些有差异的序列（非保守序列）。不同气味受体能特异识别相应气味分子的关键在于序列所编码的蛋白区段。（3）为了分离鉴定嗅觉神经元中的气味受体基因，科学家依据上述保守序列设计了若干对引物（图甲），利用PCR技术从大鼠鼻腔上皮组织mRNA的逆转录产物中分别扩增基因片段，再用限制酶HinfⅠ对扩增产物进行充分酶切。图乙显示用某对引物扩增得到的PCR产物（A）及其酶切片段（B）的电泳结果。结果表明酶切片段长度之和大于PCR产物长度，推断PCR产物由组成。（4）在上述实验基础上，科学家们鉴定出多种气味受体，并解析了嗅觉神经元细胞膜上信号转导的部分过程（图丙）。如果钠离子通道由气味分子直接开启，会使嗅觉敏感度大大降低。根据图丙所示机制，解释少量的气味分子即可被动物感知的原因。10．（2024•天津）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。（1）Sa产生抗药性可遗传变异的来源有（至少答出2点）。（2）推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。①根据图1信息，简述质粒2的构建过程（需包含所选引物和限制酶）：，然后回收上、下游片段，再与SacⅡ酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增、电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是（单选）。11．（2024•北京）学习以下材料，回答（1）～（4）题。筛选组织特异表达的基因筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。真核生物的基本启动子位于基因5′端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。（1）在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生的过程称为细胞分化，分化是基因的结果。（2）对文中“增强子”的理解，错误的是（单选）。A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段B．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上C．一个增强子只能作用于一个基本启动子D．很多增强子在不同组织中的活性不同（3）研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测。（4）真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称（略）。12．（2024•湖北）苏云金芽孢杆菌产生的Bt毒蛋白，被棉铃虫吞食后活化，再与肠道细胞表面受体结合，形成复合体插入细胞膜中，直接导致细胞膜穿孔，细胞内含物流出，直至细胞死亡。科学家将编码Bt毒蛋白的基因转入棉花植株，获得的转基因棉花能有效防控棉铃虫的危害。回答下列问题：（1）Bt毒蛋白引起的细胞死亡属于（填“细胞坏死”或“细胞凋亡”）。（2）如果转基因棉花植株中Bt毒蛋白含量偏低，取食后的棉铃虫可通过激活肠干细胞分裂和产生新的肠道细胞，修复损伤的肠道，由此导致杀虫效果下降。请据此提出一项可提高转基因棉花杀虫效果的改进思路：。（3）在Bt毒蛋白的长期选择作用下，种群中具有抗性的棉铃虫存活的可能原因是：肠道细胞表面受体蛋白的或发生变化，导致棉铃虫对Bt毒蛋白产生抗性。（4）将Bt毒蛋白转基因棉花与非转基因棉花混种，可以延缓棉铃虫对转基因棉花产生抗性，原因是。13．（2024•河北）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题：（1）实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为启动子。Nos为终止子，其作用为。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶和对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。（2）利用方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测，通过技术检测是否翻译出r2HN蛋白。（3）获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为。选择纯合体进行后续研究的原因是。（4）制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8+T细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的免疫和免疫。（5）利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是。（答出两点即可）14．（2024•浙江）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题：（1）锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。（2）重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是。（3）酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行培养，活化后接种至液体培养基，采用以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。（4）转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是，依据是。注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。15．（2024•选择性）将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T﹣DNA转移）和不含有Vir基因、含有T﹣DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。注：F1﹣F3，R1﹣R3表示引物；T﹣DNA﹣LB表示左边界；T﹣DNA﹣RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。（1）从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是。（2）本操作中获取目的基因的方法是和。（3）穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是。（4）根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。（5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是和。（6）本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是（单选）。A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞B.将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达C.将1﹣1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列D.用1﹣1362合成基因序列和1363﹣1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白16．（2024•贵州）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型（含NV基因）、突变体（NV基因突变）和转基因菌株（转入NV基因），检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。检测用菌株蔗糖NV酶葡萄糖（培养液中）野生型+++野生型———突变体+——转基因菌株+++回答下列问题。（1）据表可推测诱导了NV基因表达。NV酶的作用是。检测NV酶活性时，需测定的指标是（答出1点即可）。（2）表中突变体由T﹣DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与（选填“T﹣DNA”或“NV基因”）配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度（选填“＞”“＝”或“＜”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是。（3）为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是。17．（2024•新课标）某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（Ⅰ～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题。（1）限制酶切割的化学键是。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是。（2）CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G﹣C和。（3）用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是。（4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是（答出2点即可）。18．（2024•重庆）有研究者构建了H基因条件敲除小鼠用于相关疾病的研究，原理如图。构建过程如下：在H基因前后均插入LX序列突变成h基因（仍正常表达H蛋白），获得Hh雌性小鼠；将噬菌体的G酶基因插入6号染色体上，获得G+G﹣雄鼠（G+表示插入，G﹣表示未插入G酶基因）。（1）以上述雌雄小鼠为亲本，最快繁殖两代就可以获得H基因条件敲除小鼠（hhG+G﹣和hhG+G+）。在该过程中，用于繁殖F1的基因型是。长期采用近亲交配，会导致小鼠后代生存和生育能力下降，诱发这种情况的遗传学原因是。在繁殖时，研究人员偶然发现一只G+G﹣不表达G酶的小鼠，经检测发现在6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列，该异常结果形成的原因是。（2）部分小鼠的基因型鉴定结果如图，③的基因型为。结合图1的原理，若将图2中所有基因型的小鼠都喂食TM试剂一段时间后，检测H蛋白水平为0的是（填序号）。（3）某种病的患者在一定年龄会表现出智力障碍，该病与H蛋白表达下降有关（小鼠H蛋白与人的功能相同）。现有H基因完全敲除鼠甲和H基因条件敲除鼠乙用于研究缺失H蛋白导致该病发生的机制，更适合的小鼠是（“甲”或“乙”），原因是。19．（2024•浙江）小鼠毛囊中表达F蛋白。为研究F蛋白在毛发生长中的作用，利用基因工程技术获得了F基因敲除的突变型纯合体小鼠，简称f小鼠，突变基因用f表示。F小鼠皮毛比野生型小鼠长50%，表现出毛绒绒的样子，其它表型正常。（注：野生型基因用++表示；f杂合子基因型用+f表示）回答下列问题：（1）F基因敲除方案如图甲。在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生，导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质因为缺失了而丧失活性。要达到此目的，还可以对该基因的特定碱基进行和。（2）从野生型、f杂合子和f小鼠组织中分别提取DNA，用限制酶HindⅢ酶切，进行琼脂糖电泳，用DNA探针检测。探针的结合位置如图甲，检测结果如图乙，则f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第泳道和第泳道。（3）g小鼠是长毛隐性突变体（gg），表型与f小鼠相同。f基因和g基因位于同一条常染色体上。f杂合子小鼠与g小鼠杂交，若杂交结果是，则g和f是非等位基因；若杂交结果是，则g和f是等位基因。（注：不考虑交叉互换；野生型基因用++表示；g杂合子基因型用+g表示）（4）确定g和f为等位基因后，为进一步鉴定g基因，分别提取野生型（++）、g杂合子（+g）和g小鼠（gg）的mRNA，反转录为cDNA后用（2）小题同样的DNA探针和方法检测，结果如图丙。G小鼠泳道没有条带的原因是。组织学检查发现野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，因此推测F蛋白具有的作用。20．（2024•山东）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。（1）用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越（填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′﹣﹣3′和5′﹣﹣3′。（2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是，其中纯合的突变植株是（填序号）。（3）实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T﹣DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。

2021-2025年高考生物真题知识点分类汇编之基因工程（二）参考答案与试题解析一．选择题（共3小题）题号123答案DDB二．多选题（共1小题）题号4答案AC一．选择题（共3小题）1．（2024•安徽）下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（）A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。【解答】解：A、研磨液加入了NaCl溶液，有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；B、DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，因此，利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA，B正确；C、DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确；D、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。故选：D。【点评】本题考查DNA的粗提取与鉴定的相关知识，意在考查考生理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系的能力。2．（2023•广东）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（）A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：1、DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同（DNA在0.14mol/L的氯化钠中溶解度最低）；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。3、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。【解答】解：A、细胞吸水涨破，释放DNA等物质，A正确；B、DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，DNA在2mol/L的氯化钠中溶解度最高，依此原理可分离出其他杂质，B正确；C、DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，反复多次可提纯DNA，C正确；D、加入二苯胺后，还需沸水浴处理才能出现蓝色，D错误。故选：D。【点评】本题主要考查DNA的粗提取与鉴定，要求学生有一定的理解分析能力，能够结合题干信息和所学知识进行分析应用。3．（2023•重庆）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（如图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（）A．其中一个引物序列为5'﹣TGCGCAGT﹣3' B．步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D．酶切片段和载体连接时，可使用E.coli连接酶或T4连接酶【分析】E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端；T4DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。【解答】解：A、由于引物只能引导子链从5'到3'，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5'﹣TGCGCAGT﹣3'，A正确；B、根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheI切割形成的，右边的黏性末端是用CfoI切割形成的，B错误；C、用步骤①的酶对载体进行酶切，使用了NheI和CfoI进行切割，根据它们的识别位点以及原本DNA的序列，切割之后至少获得了2个片段，C正确；D、图中形成的是黏性末端，而E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端；T4DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端，D正确。故选：B。【点评】本题主要考查的是DNA片段的扩增与电泳鉴定的相关知识，意在考查学生对基础知识的理解掌握，难度适中。二．多选题（共1小题）（多选）4．（2024•湖南）最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（）A．上述PCR反应体系中只加入一种引物 B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C．5′﹣CTACCCGTGAT﹣3′为对照个体的一段序列 D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G【分析】1、PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。（2）原理：DNA复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）。（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。2、双脱氧测序法的原理：在DNA聚合酶、引物、四种单脱氧核苷酸（dNTP）存在的情况下，如果在四管反应系统中再分别加入四种双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），DNA链合成反应过程中ddNTP与dNTP处于一种竞争状态，即新合成DNA链既可能掺入正常dNTP，也可能掺入ddNTP并使新合成链终止延伸。这样在每个反应系统中形成的产物是一系列长度不等的多核苷酸片段，这些片段具有相同的起点，即引物的5'端，但有不同的ddNTP终端。在结束反应后，用四个泳道进行电泳，分别分离各组反应体系中不同长度的DNA片段，检测DNA片段终止末端位置的碱基种类，从自显影图谱中直接读取到与模板相匹配的新的链序。【解答】解：A、利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确；B、电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢，B错误；C、依据分析中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA片段）的3'终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带（DNA片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'﹣CTACCCGTGAT﹣3'，患者的测序结果为5'﹣CTACCTGTGAT﹣3'，C正确；D、对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D错误。故选：AC。【点评】本题考查学生从题中获取DNA片段的电泳检测结果的信息，并结合所学PCR的知识做出正确判断，属于理解层次的内容，难度适中。三．解答题（共16小题）5．（2024•福建）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。回答下列问题：（1）利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合。（2）将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是EcoRⅠ和NotⅠ。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用AgeⅠ和HindⅢ限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。（3）为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其超数排卵。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，应选用桑葚胚的原因是桑葚胚易于在小鼠子宫着床。（4）利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是排除PCR体系中外源DNA的污染。（5）若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原因是该小鼠能被麻疹病毒感染，且干扰素无法作用于IFNAR以应对感染。【分析】PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。（2）原理：DNA复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）。（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。【解答】解：（1）PCR技术包括：高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；中温延伸：合成子链，即复性温度下发生的扩增过程是两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合。（2）结合图示可知，质粒中以及目的基因的两端含有限制酶EcoRⅠ和NotⅠ的识别序列，且这两个序列位于启动子和终止子之间，因此，将CD46接入质粒应选用的限制酶组合是EcoRⅠ和NotⅠ（SacⅠ会破坏目的基因，不能选）。由于AgeⅠ和HindⅢ这两种限制酶可以将重组质粒分为含目的基因的片段和含有标记基因的片段，因此为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用AgeⅠ和HindⅢ限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。（3）为获取大量胚胎用于移植，用促性腺激素处理小鼠a使其超数排卵，这样可以得到更多的卵子用于受精和胚胎发育。将胚胎移植到小鼠c的子宫中时，由于桑葚胚易于在小鼠子宫着床，因此应选用桑葚胚。（4）利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是排除PCR体系中外源DNA的污染，从而保证检测结果的准确性。（5）若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该转基因小鼠能接受抗原刺激，进而机体会分泌干扰素，但干扰素无法与相应的受体结合，因为转基因小鼠的受体IFNAR无法表达，因而干扰素无法起作用，因此，该小鼠对麻疹病毒具有高易感性。故答案为：（1）两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合（2）EcoRⅠ和NotⅠ；AgeⅠ和HindⅢ（3）超数排卵；桑葚胚易于在小鼠子宫着床（4）排除PCR体系中外源DNA的污染（5）该小鼠能被麻疹病毒感染，且干扰素无法作用于IFNAR以应对感染【点评】本题主要考查PCR技术、基因工程的相关知识，意在考查考生理解所学知识要点、把握知识间内在联系的能力，能够运用所学知识，对生物学问题作出准确的判断，难度适中。6．（2024•江苏）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET﹣SOD构建重组质粒pET﹣SOD﹣ELP50，以融合表达SOD﹣ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列﹣（GTTCCTGGTGTTGGC）50﹣限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：（1）步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是EcoRⅠ、HindⅢ。（2）步骤②转化时，科研人员常用CaCl2处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET﹣SOD﹣ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是S﹣F、E﹣R。（3）步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与启动子结合，驱动转录，翻译SOD﹣ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是C（从图2的“A～D”中选填）。（4）步骤④为探寻高效纯化SOD﹣ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD﹣ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。（ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是SOD﹣ELP50组纯化蛋白数量更多。（ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是高温使蛋白变性。（ⅲ）据图分析，融合表达SOD﹣ELP50蛋白的优点有低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。【分析】基因表达载体包括目的基因、标记基因、启动子和终止子等；启动子是一段由特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出蛋白质；终止子位于基因的下游，作用是终止转录，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。【解答】解：（1）由图示可知，限制酶a和限制酶b切割ELP50的片段需要与SOD片段相连接，所以二者需要形成相同的黏性末端，根据二者连接后的位置关系，应选择EcoRⅠ（限制酶a）；限制酶b需要同时能将SOD的左侧和ELP50的右侧切开，应选择HindⅢ，所以步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是EcoRⅠ、HindⅢ。（2）步骤②转化时，常用CaCl2处理大肠杆菌，使细胞处于感受态（容易吸收周围环境DNA分子的状态）；基因表达载体上有卡那霉素的抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。由图示可知，S﹣F为SOD的左侧引物、S﹣R为SOD的右侧引物、E﹣F为ELP50的左侧引物、S﹣R为ELP50的右侧引物。用PCR技术扩增融合基因，需要在融合基因的两侧选择引物，应选用的一对引物是S﹣F、E﹣R。（3）启动子是RNA聚合酶的识别和结合位点，步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与启动子结合，驱动转录，翻译SOD﹣ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，SOD为462bp、ELP50为750bp，则形成的SOD﹣ELP50蛋白质大约含有（462+750）÷3＝404个氨基酸，则SOD﹣ELP50蛋白相对分子质量为0.11×404＝44.44，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是C。（4）（ⅰ）由图示可知，20℃时，与不加NaCl相同，加入NaCl后实验结果是SOD﹣ELP50组纯化蛋白数量更多。（ⅱ）100℃时，由于高温使蛋白变性，导致各组中所有蛋白都沉淀。（ⅲ）据图分析，融合表达SOD﹣ELP50蛋白的优点为低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。故答案为：（1）EcoRⅠ、HindⅢ（2）CaCl2卡那霉素S﹣F、E﹣R（3）启动子C（4）（ⅰ）SOD﹣ELP50组纯化蛋白数量更多（ⅱ）高温使蛋白变性（ⅲ）低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持【点评】本题考查了基因工程的相关知识，意在考查考生理解所学知识要点、把握知识间内在联系的能力；能运用所学知识，对生物学问题作出准确的判断。7．（2024•重庆）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。（1）基因S启动子的基本组成单位是脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸）。（2）通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是EcoRⅠ；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接（反向链接）。（3）为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段，启动子D+基因S片段。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是PCR。（4）用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ﹣1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ﹣2的种子也变大，但小于YZ﹣1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大。【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的筛选和获取从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选，是基因工程的核心步骤。（3）将目的基因导入受体细胞将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原﹣抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。【解答】解：（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，从而驱动基因开始转录，其位于DNA分子上，是一段DNA序列，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。（2）①据图分析可知，启动子D+基因S的序列中存在限制酶EcoRⅠ的识别序列，如果使用其进行切割，会破坏目的基因序列。②根据图中限制酶的识别序列分析可知，利用限制酶SpeⅠ和XbaⅠ进行切割，会产生相同的黏性末端；在构建基因表达载体时，如果用这两种限制酶进行切割，所形成的DNA片段容易出现自我环化，还无法保证目的基因片段与载体片段正向连接，从而影响目的基因在受体细胞中的表达。（3）①琼脂糖凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组表达载体经过限制酶切割后的产物不仅有启动子D+基因S片段，还有空载体片段（不含目的基因），因此，电泳时对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和启动子D+基因S片段。②在分子水平上检测目的基因是否转入成过可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。（4）根据题干信息可知，再生植株YZ﹣1导入的目的基因是取自品种DN的启动子D+基因S序列，再生植株YZ﹣2导入的目的基因为取自品种TL的启动子T+基因S序列，由于“两品种中基因S序列无差异”，可以推知品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。故答案为：（1）脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸）（2）EcoRⅠ；酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接（反向链接）（3）酶切后的空载体片段，启动子D+基因S片段PCR（4）品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大【点评】本题考查基因工程的相关知识，要求考生理解识记有关技术的原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能将教材中的知识结合题中信息进行迁移应用。8．（2024•广西）M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠，主要制作流程见图，实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列，同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（M﹣GFP）的表达，恢复小鼠自身被敲除的M基因功能，同时便于示踪。回答下列问题：注：基因型A/+指的是A基因被嵌合在细胞同源染色体中的一条，即可表示为Aa；两端添加上LoxP位点的M基因称为floxM。（1）在PCR扩增片段①和②时，通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列，该序列添加的位置位于引物5′端（选填“3′端”或“5′端”）。在构建载体1时，为了阻断A基因的表达，从转录水平考虑，连接的片段可以是两端包含loxP序列的终止子；而从翻译水平考虑，连接的片段可以是两端包含loxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列。为了鉴定载体2是否构建成功，需要限制酶切割载体后，再进行电泳。（2）培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液，其目的是清除代谢产物、提供营养物质、调节pH、维持渗透压（至少答2方面）。（3）为了快速高效繁育出含有4对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M﹣GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交后最终获得基因型为cre/+A/+M﹣GFP/+floxM/floxM实验模型小鼠。（4）为了实现M基因的表达可控，在实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A蛋白的四环素，抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比，目的是添加四环素会竞争性结合A蛋白，无法激活T启动子，导致M﹣GFP基因不能表达，从而不能恢复被敲除的M基因的功能；不添加四环素，A蛋白基因表达激活T启动子，启动M﹣GFP基因表达，从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性。【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因—DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原—抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。【解答】解：（1）PCR扩增DNA时，子链的合成方向是5'→3'，故应在引物的5'端添加被限制酶识别的序列。终止子：使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。转录是以DNA为模板合成RNA的过程。从转录水平考虑为了阻断A基因的表达，连接的片段可以是两端包含LoxP序列的终止子。终止密码子：蛋白质翻译过程中终止肽链合成的mRNA上的三联体碱基序列。从翻译水平考虑为了阻断A基因的表达，连接的片段可以是两端包含LoxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列。为鉴定载体2是否构建成功，需利用限制酶切割载体后进行电泳，观察是否出现预期大小的目标条带。（2）细胞培养液需要定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。此外，定期更换培养液还能维持细胞生存适宜的pH和渗透压、确保细胞获得充足的营养，保证细胞的健康生长和繁殖。（3）实验的目的是制备M基因表达可控的实验模型小鼠，对M基因的控制是通过蛋白A激活诱导型T启动子来调控的。为了便于追踪，构建了带绿色荧光蛋白基因的M基因，方便观察M基因的表达情况，而自身所带的M基因则需要被敲除，已知两端添加LoxP位点的M基因可被Cre重组酶敲除，所以需要构建两端添加了LoxP位点的M基因纯合小鼠，相关基因型为foxM/1oxM。该小鼠体内需要有Cre重组酶来切除自身的M基因，同时还要有表达蛋白A的基因以及融合了绿色荧光蛋白基因的M基因来替换被敲除的M基因。综上分析，需进行如下杂交：最终获得基因型为cre/+A/+M﹣GFP/+floxM/floxM的实验模型小鼠。（4）添加四环素与未添加相比，添加四环素会竞争性结合A蛋白，无法激活T启动子，导致M﹣GFP基因不能表达，从而不能恢复被敲除的M基因的功能；不添加四环素，A蛋白基因表达激活T启动子，启动M﹣GFP基因表达，从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性。故答案为：（1）5′端两端包含loxP序列的终止子两端包含loxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列电泳（2）清除代谢产物、提供营养物质、调节pH、维持渗透压（3）cre/+A/+M﹣GFP/+floxM/floxM（4）添加四环素会竞争性结合A蛋白，无法激活T启动子，导致M﹣GFP基因不能表达，从而不能恢复被敲除的M基因的功能；不添加四环素，A蛋白基因表达激活T启动子，启动M﹣GFP基因表达，从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性【点评】本题主要考查基因工程的内容，要求考生识记相关知识，并结合所学知识准确答题。9．（2024•北京）灵敏的嗅觉对多数哺乳动物的生存非常重要，能识别多种气味分子的嗅觉神经元位于哺乳动物的鼻腔上皮。科学家以大鼠为材料，对气味分子的识别机制进行了研究（1）嗅觉神经元的树突末梢作为感受器，在气味分子的刺激下产生兴奋，经嗅觉神经元轴突末端与下一个神经元形成的突触将信息传递到嗅觉中枢，产生嗅觉。（2）初步研究表明，气味受体基因属于一个大的基因家族。大鼠中该家族的各个基因含有一些共同序列（保守序列），也含有一些有差异的序列（非保守序列）。不同气味受体能特异识别相应气味分子的关键在于非保守序列所编码的蛋白区段。（3）为了分离鉴定嗅觉神经元中的气味受体基因，科学家依据上述保守序列设计了若干对引物（图甲），利用PCR技术从大鼠鼻腔上皮组织mRNA的逆转录产物中分别扩增基因片段，再用限制酶HinfⅠ对扩增产物进行充分酶切。图乙显示用某对引物扩增得到的PCR产物（A）及其酶切片段（B）的电泳结果。结果表明酶切片段长度之和大于PCR产物长度，推断PCR产物由长度相同但非保守序列不同的DNA片段组成。（4）在上述实验基础上，科学家们鉴定出多种气味受体，并解析了嗅觉神经元细胞膜上信号转导的部分过程（图丙）。如果钠离子通道由气味分子直接开启，会使嗅觉敏感度大大降低。根据图丙所示机制，解释少量的气味分子即可被动物感知的原因。少量的气体分子通过活化的G蛋白、活化的C酶，在C酶的催化下合成大量的cAMP使Na+通道打开，Na+内流，神经元细胞膜上产生动作电位，气味分子被动物感知【分析】1、静息时，神经细胞膜对钾离子的通透性大，钾离子大量外流，形成内负外正的静息电位；受到刺激后，神经细胞膜的通透性发生改变，对钠离子的通透性增大，钠离子内流，形成内正外负的动作电位。2、兴奋以电流的形式传导到轴突末梢时，突触小泡释放递质（化学信号），递质作用于突触后膜，引起突触后膜产生膜电位（电信号），从而将信号传递到下一个神经元。【解答】解：（1）感受器是接受刺激并产生兴奋的结构，气味分子刺激感受器使之产生兴奋。嗅觉神经元轴突末端与下一个神经元之间形成突触。（2）蛋白质分子的功能由其结构决定，不同气味受体能特异性识别相应气味分子，其关键在于受体蛋白质中结构不同的部分，由非保守序列编码。（3）图乙显示用某对引物扩增得到的PCR产物（A）及其酶切片段（B）的电泳结果，分析可知，PCR产物包含保守序列和非保守序列。若非保守序列不同，酶切位点会有区别，使得酶切产物的长度可能不同，从而导致酶切片段长度之和大于PCR产物长度，因此PCR产物由长度相同但非保守序列不同的DNA片段组成。（4）根据图丙分析可知，少量气体分子通过活化G蛋白使得C酶活化，在C酶的催化下，ATP转化为cAMP，cAMP促使Na+通道打开，Na+内流，引起神经元产生动作电位，气味分子被动物感知。故答案为：（1）兴奋突触（2）非保守（3）长度相同但非保守序列不同的DNA片段（4）少量的气体分子通过活化的G蛋白、活化的C酶，在C酶的催化下合成大量的cAMP使Na+通道打开，Na+内流，神经元细胞膜上产生动作电位，气味分子被动物感知【点评】本题主要考查神经调节有关的知识内容，还涉及PCR技术等知识，学习时通过分析、归纳总结等方式对神经调节的结构基础、调节过程进行理解是关键，还要能够准确分析题中信息作答。10．（2024•天津）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。（1）Sa产生抗药性可遗传变异的来源有基因突变、基因重组、表观遗传等（至少答出2点）。（2）推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。①根据图1信息，简述质粒2的构建过程（需包含所选引物和限制酶）：采用引物1和4进行PCR扩增（或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacⅡ酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含氯霉素（或氯霉素+头孢霉素）的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含脱水四环素的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含头孢霉素的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增、电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是D（单选）。【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR检测等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR检测等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。【解答】解：（1）金黄色葡萄球菌（Sa）为原核生物，不具有成形的细胞核与染色体，其产生抗药性可遗传变异的来源有基因突变、基因重组和表观遗传等。（2）①观察图1可知，R基因的上游片段和下游片段依次含有SacⅡ和EcoRⅠ、EcoRⅠ和SacⅡ共4个酶切位点，质粒1上的两个酶切位点均为限制酶SacⅡ的酶切位点，结合质粒2上三个酶切位点SacⅡ、EcoRⅠ、SacⅡ的分布情况分析，若要构建质粒2，一方面，应使用引物1和引物4进行PCR以扩增得到R基因以及上下游片段，也可以采用引物1和3（或引物2和4）进行PCR扩增，获取含有上游片段和R基因（或含有R基因和下游片段）；再利用限制酶SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacⅡ切割后的质粒1所得片段连接，从而获得质粒2。②据图可知，质粒2上含有氯霉素抗性基因，用质粒2转化具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，可以菌株涂布在含氯霉素（或氯霉素+头孢霉素）的平板上，能够生长繁殖的菌株就是含质粒2的Sa。③据图中信息，Y是可被脱水四环素诱导表达的Sa致死基因，质粒2上含有R基因和Y，将②中获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含脱水四环素的平板上，可诱导含有R基因和Y的菌株死亡，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，由图1可知，R基因两侧分别为引物2和3，所以扩增后含有引物2，或者引物3，或者2和3这三种情况的可能含有R基因，电泳结果表明R基因已被敲除的是D组。故答案为：（1）基因突变、基因重组、表观遗传等（2）采用引物1和4进行PCR扩增（或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切氯霉素（或氯霉素+头孢霉素）脱水四环素头孢霉素D【点评】本题考查基因工程的相关知识，还涉及微生物的培养与筛选，要求考生理解识记有关技术的原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能将教材中的知识结合题中信息进行迁移应用。11．（2024•北京）学习以下材料，回答（1）～（4）题。筛选组织特异表达的基因筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。真核生物的基本启动子位于基因5′端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。（1）在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生稳定性差异的过程称为细胞分化，分化是基因选择性表达的结果。（2）对文中“增强子”的理解，错误的是C（单选）。A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段B．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上C．一个增强子只能作用于一个基本启动子D．很多增强子在不同组织中的活性不同（3）研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测各组织器官中G和H的mRNA。（4）真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称（略）。【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR检测等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR检测等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。【解答】解：（1）细胞分化是指在个体发育中由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程，其实质是基因的选择性表达。（2）AB、根据题干信息“增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组