基因工程的基本操作程序（第三步：将目的基因导入受体细胞第四步：目的基因的检测与鉴定）高二下学期生物人教版选择性必修3

3.2基因工程的基本操作程序（第三、四步）2第三步：将目的基因导入受体细胞受体细胞基因表达载体导入动物植物微生物将目的基因与载体结合，构建好基因表达载体后，下面该进行什么操作？农杆菌转化法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法31将目的基因导入植物细胞：植物细胞方法一：子房注射法用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中含目的基因的DNA溶液1.花粉管通道法（我国科学家独创）41将目的基因导入植物细胞：2.适用生物：1.受体细胞：受精卵方法二：

柱头处理法在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。3.特点：简便经济，但要求花朵较大开花植物1.花粉管通道法（我国科学家独创）51将目的基因导入植物细胞：

农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞、并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。

农杆菌是生活在土壤中的微生物，自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。当双子叶植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞。（1）

农杆菌：2.农杆菌转化法【问题1】农杆菌具有怎样的结构基础，利于目的基因进入植物细胞？（p81）6【问题2】为使目的基因在受体细胞中稳定存在，在构建基因表达载体时，应将目的基因插入哪里？将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞（2）转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。（3）实质：基因重组（控制不同性状的基因的重新组合）2.农杆菌转化法7（4）过程：目的基因Ti质粒表达载体农杆菌植物细胞植物细胞染色体DNA新性状植株构建转入导入插入表达【思考】农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞中，但基因工程最终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？

得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养2.农杆菌转化法需要农杆菌产生的vir蛋白切割T-DNA82.农杆菌转化法【思考】农杆菌转化法共有几次DNA分子的拼接，几次导入细胞？两次拼接第一次拼接：目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上。第二次拼接：被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。两次导入第一次导入：将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌。第二次导入：含含目的基因的T-DNA导入受体细胞。92.农杆菌转化法根据受体植物的不同，所用的具体转化方法有所区别。方法一：可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；方法二：将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。②受体细胞为受精卵①受体细胞为体细胞（植物细胞的全能性）10第三步：将目的基因导入受体细胞2将目的基因导入动物细胞：构建基因表达载体并提纯利用显微注射法将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植（移植到同期发情的母畜子宫内）获得具有新性状的动物常用显微注射法将目的基因注入受精卵11第三步：将目的基因导入受体细胞3将目的基因导入微生物：（1）常用方法：Ca2+处理常用原核细胞（大肠杆菌应用最广泛）（2）受体细胞：Ca2+感受态细胞吸收大肠杆菌Ca2+表达载体

Ca2+处理法示意图繁殖快单细胞遗传物质少易培养目的：增加细胞膜的通透性，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）12实例：利用转基因大肠杆菌生产药物转录翻译剪切、连接加工真核基因：编码区（外显子+内含子）前体mRNA成熟mRNA多肽链蛋白质（四级结构）原因：①真核生物的基因有内含子，原核生物细胞里没有相应的机制来剪切、拼接前体RNA；②原核生物没有真核生物的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等）So，一般不能产生原来的蛋白质如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？13实例：利用转基因大肠杆菌生产药物【思考】如何让人的胰岛素基因在原核细胞中表达？胰腺提取筛选胰岛素mRNA胰岛素

cDNA逆转录重组质粒质粒导入大肠杆菌mRNA胰岛素原胰岛素加工没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工。原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。利用成熟的胰岛素mRNA得到胰岛素cDNA（无内含子）14细胞种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法

受体细胞

转化过程花粉管通道法农杆菌转化法显微注射法Ca2＋处理法体细胞或受精卵受精卵通常选原核细胞将目的基因插入Ti质粒的T­DNA上↓转入农杆菌中↓导入植物细胞↓整合到受体细胞DNA上提纯含目的基因的表达载体↓显微注射↓早期胚胎培养、胚胎移植↓获得具有新性状的个体Ca2＋处理细胞↓感受态细胞↓基因表达载体与感受态细胞混合↓感受态细胞吸收DNA分子目的基因导入受体细胞方法比较15小试牛刀1、下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是（

）

A．②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体DNA上C．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了定向的可遗传变异D．若④的染色体上含抗虫基因，⑤就表现出抗虫性状C16第四步：目的基因的检测与鉴定检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。类型检测内容方法分子水平的检测个体生物学水平的鉴定受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因目的基因是否转录出了mRNAPCR等技术目的基因是否翻译成蛋白质抗原-抗体杂交技术个体是否具有相应性状抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等第四步：目的基因的检测与鉴定1分子水平的检测①检测目的基因是否导入通过PCR等技术检测提取待测DNA转基因生物PCR提取待测mRNA转基因生物PCR逆转录②检测目的基因是否转录17方法1：第四步：目的基因的检测与鉴定目的基因在整个DNA片段的中央位置复制3次后18只含目的基因片段目的基因在整个DNA片段的中央位置复制3次后192020只含目的基因片段目的基因在整个DNA片段的中央位置复制3次后这两个DNA分子量相同吗？种类1种类2种类3种类4种类5怎么知道里面有该DNA片段？电泳：在电场的作用下，DNA、RNA、蛋白质等这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。正极负极电场力22正极负极电场力23【原理】DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。电泳常用缓冲液pH8.0～8.3，DNA分子在此pH条件下带____电荷正极负极电场力若此时电场里没有任何障碍物，所有DNA片段会以同样的速度向正极移动，怎么让它们移动速度不相同呢？负24电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。正极负极电场力琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶。琼脂糖的熔点在62~65℃之间，融化后在37℃下可维持液态数小时，30℃时凝固成胶。2526电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。正极负极电场力琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶。琼脂糖的熔点在62~65℃之间，融化后在37℃下可维持液态数小时，30℃时凝固成胶。27电泳：正极负极电场力琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶。琼脂糖的熔点在62〜65°C之间，融化后在37°C下可维持液态数小时，30°C时凝固成胶。加样孔（加入待测DNA样本）28电泳：正极负极电场力琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶。琼脂糖的熔点在62〜65°C之间，融化后在37°C下可维持液态数小时，30°C时凝固成胶。片段短，迁移速率快片段长，迁移速率慢在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关①凝胶的浓度越大，迁移速率越慢②DNA分子越大，迁移速率越慢③DNA分子构像有环状、链状等【思考】1.DNA片段位置怎么显示出来？2.怎么知道这些DNA片段大小？29第四步：目的基因的检测与鉴定1分子水平的检测①检测目的基因是否导入方法1：通过PCR等技术检测提取待测DNA转基因生物PCR通过电泳检测是否扩增出目的基因提取待测mRNA转基因生物PCR逆转录②检测目的基因是否转录3031方法2：DNA分子杂交技术提取DNA样本基因组DNA酶切DNA片段电泳目标片段（事先不知道）转膜硝酸纤维素膜第四步：目的基因的检测与鉴定1分子水平的检测①检测目的基因是否导入32基因探针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩瀚的基因组中把目的基因显示出来。硝酸纤维素膜含目的基因的DNA片段基因探针33基因探针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩瀚的基因组中把目的基因显示出来。硝酸纤维素膜含目的基因的DNA片段洗去未结合的探针34基因探针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩瀚的基因组中把目的基因显示出来。硝酸纤维素膜含目的基因的DNA片段洗去未结合的探针显影装置出现杂交带35第四步：目的基因的检测与鉴定1分子水平的检测③检测目的基因是否翻译苏云金芽孢杆菌提取Bt毒蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交——通过抗原-抗体杂交检测36第四步：目的基因的检测与鉴定1分子水平的检测

基因探针：一般是指一小段单链DNA或RNA，能与____________________碱基互补配对，并带有________________标记或荧光标记。

例如，胰岛素基因探针，既能与胰岛素基因的一条链形成杂交分子，也可与胰岛素基因转录形成的________形成杂交分子。用胰岛素基因探针既可以检测受体细胞中是否含有_____________，也可以检测胰岛素基因是否______。

人体的细胞中，胰岛B细胞的______________（DNA/RNA/DNA和RNA）能与胰岛素基因探针形成杂交分子，而其他细胞中只有______（DNA/RNA）能与之形成杂交分子。目的基因的一条链放射性同位素mRNA胰岛素基因转录DNA和RNADNA拓展——探针法：37基因探针：是一小段单链的DNA或RNA，带有放射性同位素标记，并能与目的基因的的一条链发生碱基互补配对。DNA1DNA2检测目的基因是否插入和转录，还可以用探针拓展——探针法：3839第四步：目的基因的检测与鉴定2个体水平的检测接种棉铃虫观察性状