结题论文陈建良061111410-

酶制剂对禽蛋加工性能改良的研究陈建良林志坚（华南农业大学食品学院,广州，510640）摘要：本研究从提高禽蛋蛋清热稳定性这个可行性出发，选择利用适当的酶制剂和pH值条件下对其作优化处理，提高其热凝固变性的温度。结果表明，先用1％剂量碱性蛋白酶Ⅰ再用1％剂量β淀粉酶都在碱性范围内（接近蛋清原始pH值）处理后对提高蛋清的热稳定性效果最好，提高其凝固变性温度为1℃，对蛋液巴氏杀菌中尤其是防止沙门氏菌的存活方面有进一步的效果。关键词：禽蛋蛋清热稳定性酶制剂禽蛋不仅是人类重要的食品，而且是生物、化工、轻工等行业的重要原料。禽蛋是我国的主要畜产品，自1985年以来，我国禽蛋产量连续19年保持世界第一，2003年禽蛋产量达2,560.7万吨（鸡蛋占84％），占全球总产量的43％。然而，我国禽蛋加工率仅为0.26%，与发达国家15%40%的禽蛋加工转化率相比，禽蛋加工转化率低成为严重制约禽蛋产业发展的主要因素【1】。由于国内鸡蛋目前还是以鲜蛋的形式消费为主，市场的竞争十分激烈，导致鲜蛋价格持续下跌，禽蛋业面临入不敷出的危机，这不仅严重地挫伤了广大蛋禽养殖户的积极性，也严重制约了养蛋产业的健康发展。蛋液杀菌是蛋制品加工中必须的工艺过程，由于禽蛋蛋白质的热稳定性很差，蛋液只能采用低温巴氏杀菌（58.3℃、2.54min），一方面对设备技术要求很高，另一方面产品的安全问题（禽流感病毒、沙门氏菌的交叉感染）堪忧。本研究通过酶制剂对鸡蛋蛋白质的结构进行改良，改善鸡蛋的热稳定性，使蛋液的杀菌温度、杀菌效果得到有效地提高，保证鸡蛋制品的安全性；能够进一步促进鸡蛋加工业的发展，为提高禽蛋加工转化率打下基础，促进禽蛋产业的健康发展具有十分重要的意义。目前，国内的蛋制品主要是以鸭蛋为原料加工的再制蛋产品，如皮蛋、咸蛋和糟蛋，而鸡蛋主要是以鲜蛋形式消费。以鲜蛋消费一方面存在打蛋的不方便，另一方面蛋壳易携带病原菌成为安全隐患。国外蛋制品主要有蛋粉（包括蛋黄粉、蛋白粉、全蛋粉）、液蛋、冰蛋等制品，而国内这类蛋制品凤毛麟角，蛋粉产品、浓缩蛋液水分含量低、体积小、无需冷藏保存，保质期长，运输存储使用方便、安全，即使在美国这样一个科技先进农业发达，运输极其简便，冷藏链完备的国家，蛋粉仍然保持着稳定的需求量【2】。另外，国外对禽蛋的研究开发还停留在对禽蛋蛋黄成分的理化功能特性的改良上，对蛋清（蛋白质）的深入研究基本上还处于空白。本论文着重利用酶制剂对提高蛋清的热稳定性【3】的研究作出努力的探讨。1材料与方法1.1实验材料材料：原料鲜蛋（市售）真菌α淀粉酶(活力40000SKBU/g,有效温度范围为4065℃,适用pH值范围为4.48.0，最佳为5.2，由广州市裕立宝生物科技提供)β淀粉酶（活力1500DP°/ml，有效温度范围为2565℃,适用pH值范围为5.07.5，最佳为5.3，由广州市裕立宝生物科技提供）碱性蛋白酶Ⅰ（活力>580000DU/g,有效温度范围为2570℃,适用pH值范围为7.010.0，最佳为9.5，由广州市裕立宝生物科技提供）1.2实验方法1.2.1蛋清的分离与除杂用剪刀在蛋壳上刺个小洞,让蛋清能够流出来，并用100ml小烧杯接住流出来的蛋清；在漏斗上放上一层棉花，对蛋清进行过滤，重复几次，直到蛋清变得透明、无杂质。1.2.2蛋清凝固温度测试经除杂并搅拌均匀后的蛋清分别装进试管、培养皿、烧杯中，然后放进恒温水箱中加热，设定初温为55℃，并控制升温；温度每升高0.5℃后恒温1～2分钟拿出来观察一次并迅速水浴冷却到25～30℃，再用721型分光光度计在波长为595nn下测定蛋清的透光率，作曲线图，从而确定蛋清变性凝固温度的突变范围。1.2.3不同酶制剂处理对蛋清凝固温度的影响取三角瓶编号，每个三角瓶装上15ml蛋清，分别加入1％剂量【4】的β淀粉酶、真菌α淀粉酶、碱性蛋白酶Ⅰ，并作空白、失活酶对照。搅拌，放到恒温水箱中在50℃下恒温加热反应一个小时；然后控制升温，从57℃开始，每升温0.5℃拿出来观察一次，感官评定记录实验现象。作表汇总数据。初步筛选出能够提高蛋清热稳定性的一种或多种酶。1.2.4不同酶制剂在不同pH值处理条件下对蛋清凝固温度的影响取三角瓶编号，每个三角瓶装上15ml蛋清，分别加入1％剂量的β淀粉酶、真菌α淀粉酶、碱性蛋白酶Ⅰ，并把每种酶样品分装三份，用酸度计调节pH值为9.30、8.0、7.0，作对比；搅拌，放到恒温水箱中恒温加热并控制升温，从57℃开始，每升温0.5℃拿出来观察一次，感官评定记录实验现象。作表汇总数据。筛选出能够提高蛋清热稳定性的一种或多种酶，并确定其最佳作用pH条件。1.2.5确定最适作用条件下的一种或两种酶搭配处理对蛋清凝固温度的影响取三角瓶编号，每个三角瓶装上15ml蛋清，先加入1％剂量酶Ⅰ在1.2.4确定的pH条件和温度作用1h，再加入1％剂量的酶Ⅱ在1.2.4确定的pH条件和温度作用1h，并作单一酶和空白处理对照；搅拌，放到恒温水箱中恒温加热并控制升温，从57℃开始，每升温0.5℃拿出来观察一次，感官评定记录实验现象，验证这种酶搭配处理是否明显比单一酶或空白处理的更有效。1.2.6鸡蛋蛋清在酶处理前后的透光度分析鸡蛋蛋清用1.2.5验证过的两种酶处理后再按1.2.2方法测试蛋清透光率曲线是否变化，从而判断其研究是否对提高蛋清凝固温度有所效果。2结果与讨论2.1市售鸡蛋蛋清在不同温度下的透光率分析图1鸡蛋蛋清在不同温度下的透光率采用1.2.2的方法在721型分光光度计在595nm下测定蛋清得到的透光率。从图线上看到蛋清温度越高，整体上透光率越低。从理论上说，当蛋清接近某一变性温度时，透光率曲线会比其他温度段更倾斜。图1显示在59.560℃段透光率的变化最大（斜率最大），故鸡蛋蛋清蛋白质变性临界温度点在59.560℃之间）。2.2不同酶制剂处理对蛋清热稳定性的影响【5，6】表1不同酶制剂处理对鸡蛋蛋清热稳定性的影响温度℃处理的酶制剂种类空白蛋清真菌α淀粉酶(失活)真菌α淀粉酶β淀粉酶(失活)β淀粉酶碱性蛋白酶Ⅰ(失活)碱性蛋白酶Ⅰ流动性颜色流动性颜色流动性颜色流动性颜色流动性颜色流动性颜色流动性颜色57+++A+++A+++A+++A+++B+++A+++A59+++A+++A+++B+++A+++B+++A+++A59.5++B++B++C++B+++C++B++A60+C+C+C+C++C+C+B61+D+D+D+D+C+D+C注1：流动性程度采用（+++代表流动液态状；++代表稍微凝固，呈粘稠状；+代表半凝固，呈胶体状；—代表基本凝固），颜色变化采用（A代表透明澄清；B代表半透明；C代表开始泛白；D代表呈黄白色）注2：表2～7的符号同注1。本实验对蛋清热稳定性的研究基于与蛋白中的碳水化合物的关系密切。蛋白中的碳水化合物以两种状态存在，一种是与蛋白质呈结合状态(糖链形式)存在，占蛋白的0.5％；另一种是呈游离状态存在，占蛋白的0.4％。α淀粉酶对直链淀粉有水解作用，β淀粉酶对支链淀粉有水解作用，碱性蛋白酶Ⅰ对蛋白质肽链起水解作用。由表1表明，市售鸡蛋蛋清在没有人为改变pH值时由3种酶制剂处理过程中，发现β淀粉酶在59.560℃对蛋清的流动性影响效果要比空白处理和真菌α淀粉酶、碱性蛋白酶Ⅰ处理的好；同时碱性蛋白酶Ⅰ在59.561℃对蛋清的颜色变化影响效果要比空白处理和β淀粉酶、真菌α淀粉酶处理的好，其处理样品甚至在6165℃之间仍无明显变白现象。故初步试验现象说明在不改变pH值条件下，蛋清在β淀粉酶、碱性蛋白酶Ⅰ的处理下，凝固变性的感观评定效果相对要好。2.3不同酶制剂处理后在不同pH值条件下对蛋清稳定性的影响表2不同酶制剂处理后在57℃不同pH值条件下的影响pH空白蛋清真菌α淀粉酶β淀粉酶碱性蛋白酶Ⅰ流动性颜色流动性颜色流动性颜色流动性颜色9.30+++A+++A+++A+++A8.0+++A+++A+++A+++A7.0++A++B+++B++A表3不同酶制剂处理后在59℃不同pH值条件下的影响pH空白蛋清真菌α淀粉酶β淀粉酶碱性蛋白酶Ⅰ流动性颜色流动性颜色流动性颜色流动性颜色9.30+++A+++B+++B+++A8.0++B++B+++B++A7.0+B+C++C+B表4不同酶制剂处理后在59.5℃不同pH值条件下的影响pH空白蛋清真菌α淀粉酶β淀粉酶碱性蛋白酶Ⅰ流动性颜色流动性颜色流动性颜色流动性颜色9.30++B++C+++B++A8.0+C+C++C++B7.0+C+C+C+B表5不同酶制剂处理后在60℃不同pH值条件下的影响pH空白蛋清真菌α淀粉酶β淀粉酶碱性蛋白酶Ⅰ流动性颜色流动性颜色流动性颜色流动性颜色9.30+C+C++C+B8.0+C+D++C+B7.0—D—D+D—C表6不同酶制剂处理后在61℃不同pH值条件下的影响pH空白蛋清真菌α淀粉酶β淀粉酶碱性蛋白酶Ⅰ流动性颜色流动性颜色流动性颜色流动性颜色9.30+D+D+C+C8.0—D—D+D—C7.0—D—D—D—D市场上购回的原料蛋蛋清经酸度计测定为pH9.09.5之间(对比鲜蛋的6.07.7由于放置时间过长，蛋内二氧化碳逃逸而升高了，以9.30为空白对照标准)，鸡蛋卵白蛋白的等电点为4.5，这时加热最容易凝固变性，蛋清的pH值距离等电点越远时，加热时不易凝固变性【7】，故应把试验的pH控制在碱性范围内，并使酶制剂在碱性范围内作用蛋清。由表2—表6可知，空白蛋清及不同酶制剂处理过的蛋清样品经不同pH条件处理的过程中发现蛋清的pH值越高，流动性相对越好，颜色变化越小，凝固变性越慢，故选择作用蛋清的pH值为9.30。另外，在3中酶制剂处理后，发现β淀粉酶对蛋清的流动性影响效果较好，碱性蛋白酶Ⅰ对蛋清变性时的颜色变化影响较小，两者都能对有效提高蛋清的热稳定性有一定的作用效果。2.4碱性蛋白酶Ⅰ、β淀粉酶共同作用蛋清对其热稳定性的影响经过分析β淀粉酶与碱性蛋白酶Ⅰ的作用机理，先将蛋清蛋白质用碱性蛋白酶Ⅰ水解成多肽，再用β淀粉酶把蛋白质和多肽上的糖链进行水解，从而选择先由碱性蛋白酶Ⅰ对蛋清样品作处理，再由β淀粉酶作后续处理。表7碱性蛋白酶Ⅰ、β淀粉酶共同作用蛋清对其热稳定性的影响温度样品4样品3样品2样品1流动性颜色流动性颜色流动性颜色流动性颜色57+++A+++A+++B+++A59++A++A+++B+++A59.5+B++B++C++B60+C+B++C++B61+D+C+C++C注：样品1：蛋清在1％剂量碱性蛋白酶Ⅰ55℃、pH9.30下作用1h，再由1％剂量β淀粉酶55℃、pH9.30下作用1h后；样品2：蛋清在1％剂量碱性蛋白酶Ⅰ55℃、pH9.30下作用1h，再在55℃下保温1h；样品3：蛋清在55℃、pH9.30下保温1h，再由1％剂量β淀粉酶55℃、pH9.30下作用1h；样品4：蛋清在55℃，pH9.30下保温2h。由表7试验结果发现对样品1的热稳定性改善效果最好。在61℃时流动性仍然较好，呈粘稠状，凝固现象不明显，而颜色上则开始微泛白，比样品4的空白处理效果有了进一步的提高。2.5鸡蛋蛋清在酶处理前后的透光度分析图2鸡蛋蛋清酶处理后在不同温度下的透光率鸡蛋蛋清经过2.4所述先由1%剂量碱性蛋白酶Ⅰ处理再有1%剂量β淀粉酶处理后，用分光光度计测其随温度变化的透光率曲线，发现在6061℃内透光率变化最快，比较原始蛋清的透光率变化最快的59.560℃的曲线向右移了1℃左右，认为经酶处理后蛋清凝固变性温度提高了大约1℃，并能保持12分钟（图2）。蛋液巴氏杀菌温度要求温度在60℃【8】，本试验将蛋清凝固变性温度提高到6061℃对蛋液中的沙门氏菌和禽流感的致死控制有进一步的效果。3结论研究表明鸡蛋蛋清的热变性温度在59～61℃之间，先在1％剂量碱性蛋白酶Ⅰ55℃，pH9.30条件下作用1h，再由1％剂量β淀粉酶55℃，pH9.30下作用1h后蛋清热稳定性改善效果最好。本研究以鲜鸡蛋清为试验材料，从改善其热稳定性出发，通过酶制剂对鸡蛋蛋清蛋白质的结构的改良，确定先用碱性蛋白酶Ⅰ，再用β淀粉酶作优化处理后的蛋清，使其热凝固变性温度提高了1℃，从而使蛋液的杀菌温度及杀菌效果得到有效地提高，保证鸡蛋制品的安全性。可以借鉴鸡蛋的研究成果来研究其他禽蛋品种，从而提高整个禽蛋类生产工艺上的杀菌水平，促进蛋制品的深加工，提高国内在蛋制品领域内的食品安全性。参考文献[1]郑华，林捷，李远志，段杉.酶制剂在鸡蛋制品加工中的应用前景.中国禽蛋网.2005[2]周永昌.蛋与蛋制品工艺学.北京：中国农业出版社，1995[3]赵立超.蛋白质的热稳定性.国外医学.药学分册，1992[4]姜锡瑞.酶制剂应用手册.北京：中国轻工业出版社，1999[5]刘剑秋,迟玉杰.通过酶改性技术提高鸡蛋的热凝固温度.食品与发酵工业，2003，29（10）：99～100[6]田波,迟玉杰,吴非.蛋清蛋白质酶改性条件的研究.食品与发酵工业,2003,29(2):30～34[7]马美湖.禽蛋制品生产技术.北京：中国轻工业出版社，2003[8]吕顺,迟玉杰.鸡蛋中微生物的污染与其巴氏杀菌的研究状况.食品研究与开发，2004，25(4)：142～144StudyonimprovingthetemperaturecapabilityofeggwhitewithenzymeChenjianlianglinzhijian(College