复方黄甘对5-6肾切除大鼠肾脏保护作用及机制探究：基于Wnt-β - catenin信号通路视角

复方黄甘对5/6肾切除大鼠肾脏保护作用及机制探究：基于Wnt/β-catenin信号通路视角一、引言1.1研究背景与意义慢性肾脏病（ChronicKidneyDisease，CKD）是一类严重威胁人类健康的疾病，近年来其发病率呈显著上升趋势，已成为全球性的公共卫生问题。据统计，全球成年人CKD的发病率高达8%-16%，我国慢性肾脏病患病率也达到了10.8％，患者基数庞大。然而，CKD的知晓率却低于10%，许多患者在疾病早期未能得到及时诊断和治疗。在这些CKD患者中，有1%-3%会逐渐发展为终末期肾衰竭（EndStageRenalDisease，ESRD），一旦进展至此阶段，患者往往需要依赖透析或肾移植等肾脏替代治疗来维持生命。透析治疗不仅给患者带来身体上的痛苦和生活上的不便，还会给家庭和社会造成沉重的经济负担。而肾移植则面临着供体短缺、免疫排斥等诸多难题。因此，积极寻找有效的治疗方法来延缓CKD的进展，对于改善患者的生活质量、减轻社会经济负担具有重要意义。目前，临床针对CKD的治疗策略主要包括控制血压、血糖，降低蛋白尿，应用抗氧化剂，控制血脂，纠正贫血，防治感染，纠正水电解质和酸碱平衡紊乱，以及控制饮食等。这些治疗措施虽然在一定程度上能够控制机体的炎症反应、降低氧化应激水平、抑制纤维化相关因子的表达，从而延缓CKD的进展，但仍存在诸多局限性。一方面，现有的治疗手段主要侧重于控制CKD的危险因素、保护肾功能以及减少并发症，对于已经受损的肾脏组织修复效果有限，即便基础病变得到控制，肾脏功能仍可能持续减退。另一方面，长期治疗的高昂医疗费用让众多CKD患者难以承受，这也限制了治疗的可及性和患者的依从性。中西医结合治疗CKD具有独特的优势和潜力，能够从整体观念出发，调节机体的内环境，改善肾脏的病理状态。复方黄甘（HuangGanFormula，HGF）正是在这样的背景下研发而来。它是在前期研制的尿毒清颗粒基础上，经过对原处方的精简重组而得到的。尿毒清颗粒作为我国首个中药防治CKD进展的新药，凭借其较好的疗效和相对低廉的价格，连续多年在我国肾病口服中成药市场中占据首位。然而，在尿毒清颗粒的生产与推广使用过程中，也暴露出一些问题和不足，如成分复杂、作用机制不够明确等。因此，对其进行二次开发，研制出复方黄甘，旨在进一步提高产品质量、提升疗效，并明确其作用机理。本课题组前期研究已在腺嘌呤灌胃法制备的慢性肾衰大鼠模型中，证实复方黄甘能显著降低肌酐（SerumCreatinine，Scr）、尿素氮（BloodUreaNitrogen，BUN），抑制模型大鼠体内的氧化应激，延缓肾脏纤维化，展现出了良好的肾脏保护作用。在此基础上，本研究拟通过建立HPLC指纹图谱，并利用HPLC-QTOF/MS技术对复方黄甘的复杂化学成分进行定性和定量分析，初步阐明复方中的物质基础。进一步采用5/6肾切除法构建CKD大鼠模型，深入研究复方黄甘对5/6肾切除大鼠的肾脏保护作用，并从体内和体外实验探究其对Wnt/β-catenin信号通路的干预作用，初步探讨其抗肾脏纤维化的可能作用机制，为其临床治疗CKD提供新的思路和可靠的实验依据。这不仅有助于深入了解复方黄甘的作用机制，为其临床应用提供科学指导，还可能为CKD的治疗开辟新的途径，具有重要的理论意义和实际应用价值。1.2国内外研究现状复方黄甘作为在尿毒清颗粒基础上精简重组而来的方剂，近年来受到了国内外学者的广泛关注，相关研究取得了一定进展。在化学成分研究方面，已有学者采用HPLC等技术对复方黄甘进行了分析。研究发现其主要成分包括甘草苷、丹皮酚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚等，并且对这些成分的含量测定也有了初步结果。例如，有研究表明复方黄甘提取物中甘草苷含量约为0.06%，丹皮酚含量约为1.06%，这为进一步研究复方黄甘的物质基础提供了数据支持。在药理作用研究领域，复方黄甘展现出了多方面的功效。大量研究表明，复方黄甘具有显著的肾脏保护作用。在动物实验中，通过5/6肾切除法构建慢性肾衰大鼠模型，给予复方黄甘灌胃后，能明显降低模型大鼠血清中的肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平，这表明其有助于改善肾功能。同时，还能降低24h尿蛋白定量，减少肾脏损伤。在以腺嘌呤灌胃法制备的慢性肾衰大鼠模型中，复方黄甘能显著抑制模型大鼠体内的氧化应激反应，降低丙二醛（MDA）含量，提高超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、总抗氧化能力（T-AOC）以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等抗氧化酶的活性，从而减轻氧化损伤对肾脏的破坏。在肾脏纤维化方面，复方黄甘能够抑制肾组织中纤维连接蛋白（FN）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）等纤维化相关因子的表达，延缓肾脏纤维化进程。然而，目前对于复方黄甘的研究仍存在一些不足之处。在化学成分研究上，虽然已明确了部分主要成分，但复方黄甘成分复杂，其具体的物质基础尚未完全阐明，仍有一些微量成分和未知成分有待进一步探索。现有研究对各成分之间的协同作用机制也缺乏深入研究，这限制了对复方黄甘整体药效的理解。在药理作用机制研究方面，虽然已发现复方黄甘在改善肾功能、抗氧化、抗纤维化等方面有作用，但其作用的具体分子机制尚未完全清晰。尽管有研究提示其可能与某些信号通路有关，但具体的作用靶点和调控网络仍有待深入探究。此外，目前的研究主要集中在动物实验，临床研究相对较少，缺乏大规模、多中心、随机对照的临床试验来验证其在人体中的有效性和安全性，这在一定程度上影响了复方黄甘的临床推广应用。本研究拟在前期研究的基础上，通过建立HPLC指纹图谱，并利用HPLC-QTOF/MS技术对复方黄甘的复杂化学成分进行更全面、深入的定性和定量分析，以进一步明确其物质基础。采用5/6肾切除法构建CKD大鼠模型，深入研究复方黄甘对5/6肾切除大鼠的肾脏保护作用，并从体内和体外实验探究其对Wnt/β-catenin信号通路的干预作用，初步探讨其抗肾脏纤维化的可能作用机制，为其临床治疗CKD提供新的思路和可靠的实验依据。与以往研究相比，本研究不仅注重化学成分的分析，更深入到分子机制层面，有望揭示复方黄甘抗肾脏纤维化的新机制，这将为复方黄甘的进一步开发和临床应用提供更坚实的理论基础，在研究内容和方法上具有一定的创新性。1.3研究目标与内容本研究旨在深入探究复方黄甘对5/6肾切除大鼠的肾脏保护作用，并基于Wnt/β-catenin信号通路初步探讨其作用机制，为复方黄甘在慢性肾脏病（CKD）临床治疗中的应用提供坚实的理论依据和可靠的实验支撑。具体研究内容如下：复方黄甘化学成分的分析：通过醇提和水提醇沉合并工艺，制备复方黄甘提取物。运用HPLC法对10批次平行提取的复方黄甘进行检测，建立其指纹图谱。将HPLC指纹图谱检测结果导入中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)”，计算共有指纹峰的相似度，以全面反映复方黄甘化学组成的特征和稳定性。采用HPLC-QTOF/MS法对复方黄甘中主要成分进行定性分析，利用对照标准品验证定性结果的准确性。通过建立HPLC标准曲线，对主成分进行含量测定，明确各成分在复方黄甘中的含量水平，为后续研究提供物质基础数据。复方黄甘对5/6肾切除大鼠肾脏保护作用的研究：采用5/6肾切除法构建CKD大鼠模型，于给药前（术后2周）检测5/6肾切除模型组与假手术组的血清Scr、BUN水平，以检验模型是否成功构建。造模成功后，按体重分层随机区组法将实验大鼠分成8组，每组11-12只，分别为模型组、尿毒清组、氯沙坦组、复方黄甘低剂量组、中剂量组、高剂量组、假手术组和本底对照组。给予不同组别的大鼠相应的药物或对照处理，持续给药12周。在末次给药后，收集24h尿量，并通过麻醉后腹主动脉采血收集血清，采用全自动生化分析仪检测血清Scr、BUN、24h尿蛋白定量、尿肌酐、总胆固醇、低密度脂蛋白等生化指标，以评估复方黄甘对大鼠肾功能和代谢指标的影响。收集各实验组大鼠残余肾脏，纵向切开肾脏组织，取一半放入4%多聚甲醛固定液中，用于制作病理切片以及进行免疫组化检测，观察肾脏组织的病理形态变化和相关蛋白的表达定位。将另一半皮质部分分成3份，一份用于制备组织匀浆，测定肾组织中丙二醛、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、总抗氧化能力以及谷胱甘肽过氧化物酶含量，评估肾脏的氧化应激水平；另两份于-80℃冻存，分别用于RT-PCR和westernblot等实验，从基因和蛋白水平分析相关因子的表达变化。复方黄甘对5/6肾切除大鼠肾组织Wnt/β-catenin信号通路的影响：取药效实验部分大鼠肾组织，分别提取组织中的RNA与总蛋白。运用RT-PCR技术检测Wnt1、β-catenin、Tcf4、Gsk-3β、Dkk1以及FnlmRNA表达量，从基因转录水平探究复方黄甘对Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达的调控作用。利用westernblot方法检测以上蛋白在各实验组大鼠肾组织的表达，从蛋白质水平进一步验证基因表达的变化，明确复方黄甘对信号通路相关蛋白的影响。采用石蜡包埋法制备肾组织切片，通过免疫组织化学法观察Wnt1、β-catenin、Tcf4、Gsk-3β、Dkk1以及Fnl蛋白在肾组织的表达部位，并对其表达量进行半定量分析，直观呈现相关蛋白在肾脏组织中的分布和表达情况，深入了解复方黄甘对Wnt/β-catenin信号通路的干预作用机制。复方黄甘对HK-2细胞上皮间充质转化（EMT）的影响及机制研究：利用高糖培养液（D-葡萄糖30mmol/L）分别诱导HK-2细胞12、24、48h，并以普通培养液和甘露醇等渗培养液作为对照，用westernblot检测α-肌动蛋白和β-catenin蛋白的表达，构建HK-2细胞EMT模型，明确高糖诱导HK-2细胞EMT过程中相关蛋白的表达变化。用不同浓度复方黄甘作用HK-2细胞48h后，用流式细胞仪检测细胞凋亡和坏死的比例，筛选复方黄甘最大安全浓度，为后续细胞实验确定合适的药物浓度范围。在确定的安全浓度范围内，研究复方黄甘对高糖诱导的HK-2细胞EMT的影响，通过检测相关蛋白和基因的表达变化，探讨其作用机制是否与Wnt/β-catenin信号通路有关，从细胞水平深入揭示复方黄甘抗肾脏纤维化的作用机制。二、复方黄甘与5/6肾切除大鼠模型概述2.1复方黄甘介绍2.1.1成分解析复方黄甘主要由黄芪、紫草、黄柏、甘草等多味中药组成，每味中药在复方中都发挥着独特且关键的作用。黄芪作为君药，富含黄芪多糖、黄芪皂苷、黄酮类等多种有效成分。现代医学研究表明，黄芪多糖能够调节机体免疫功能，增强免疫细胞的活性，提高机体的抵抗力。黄芪皂苷则具有抗氧化、抗炎以及改善肾功能等多种作用。研究发现，黄芪皂苷可通过抑制炎症因子的释放，减轻肾脏的炎症反应，同时还能提高抗氧化酶的活性，减少氧化应激对肾脏的损伤。在一项针对慢性肾衰大鼠的研究中，给予黄芪提取物后，大鼠血清中的肌酐、尿素氮水平明显降低，肾功能得到显著改善，这充分证实了黄芪在保护肾脏功能方面的重要作用。紫草和黄柏为臣药。紫草中含有紫草素、乙酰紫草素等主要成分，这些成分具有显著的抗炎、抑菌、凉血活血等功效。研究显示，紫草素能够抑制炎症细胞的浸润，减轻炎症反应，同时还能促进受损组织的修复。在炎症相关的实验中，紫草素可使炎症模型动物的炎症指标明显下降，炎症症状得到缓解。黄柏富含小檗碱、黄柏碱等生物碱，具有清热燥湿、泻火解毒、抗菌抗炎等作用。小檗碱能够抑制多种细菌和病毒的生长繁殖，同时还能调节免疫功能，减轻炎症反应。有研究表明，小檗碱可通过抑制核因子-κB（NF-κB）信号通路，减少炎症因子的表达，从而发挥抗炎作用。甘草为佐使药，其主要成分包括甘草酸、甘草苷、甘草黄酮等，具有解毒、调和诸药的作用。甘草酸具有强大的抗炎、抗过敏和免疫调节作用。它能够抑制炎症介质的释放，减轻炎症反应，同时还能调节免疫细胞的功能，增强机体的免疫力。甘草苷则具有抗氧化、保护心血管等作用。在复方中，甘草不仅能够缓解其他药物的毒性，还能协调各药物之间的作用，使复方的药效更加稳定和持久。2.1.2功效探讨复方黄甘在临床研究中展现出了多方面的显著疗效，尤其是在治疗复发性生殖器疱疹和慢性肾衰方面。在复发性生殖器疱疹的治疗中，一项临床研究将90例复发性生殖器疱疹患者随机分为治疗组和对照组各45例，治疗组服用复方黄甘颗粒，对照组服用泛昔洛韦片，30d为一个疗程。结果显示，近期疗效治疗组与对照组相当（P>0.05），但抗复发疗效治疗组明显优于对照组（P<0.05）。这表明复方黄甘在预防复发性生殖器疱疹的复发方面具有独特优势。其作用机制可能与调节机体免疫功能有关，通过增强机体的免疫力，抑制疱疹病毒的复制和复发。在慢性肾衰的治疗领域，复方黄甘同样表现出色。研究人员用5/6肾切除法构建慢性肾衰大鼠模型，将模型大鼠随机分为尿毒清组、科素亚组、复方黄甘低、中、高剂量组和模型组，另加假手术组共7组，经灌胃给药12周后检测相关指标。结果发现，复方黄甘提取物能显著降低慢性肾衰模型大鼠血清中的肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平，减少24h尿蛋白定量，表明其对肾功能具有明显的改善作用。同时，复方黄甘还能减轻肾组织的病理损伤，抑制肾组织中纤维连接蛋白（FN）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）等纤维化相关因子的表达，延缓肾脏纤维化进程。这些研究结果充分证明了复方黄甘在慢性肾衰治疗中的有效性和重要价值，为慢性肾衰的临床治疗提供了新的选择和思路。2.25/6肾切除大鼠模型2.2.1模型构建方法5/6肾切除大鼠模型的构建通常采用两期手术法。首先，选取健康的雄性SD大鼠，体重在180-220g左右，适应性喂养1周，使其适应实验室环境。手术前12h禁食，不禁水，以减少术中呕吐和误吸的风险。在无菌手术条件下，用10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔注射对大鼠进行麻醉，待大鼠麻醉生效后，将其固定于手术台上，常规消毒手术区域，铺无菌巾。在大鼠左侧肋弓下1.5-2.0cm处，沿腹直肌外缘做一长约2-3cm的纵行切口，钝性分离肌肉，打开后腹膜，暴露左肾。小心剥离肾包膜，将左肾的上下两极各切除1/3，切除过程中尽量避免损伤肾蒂和周围组织，用明胶海绵压迫止血，确保切面上无活动性出血后，将剩余的左肾复位，逐层缝合肌肉和皮肤，手术创口涂抹碘伏消毒，防止感染。术后给予大鼠青霉素钠（4万U/kg）肌肉注射，连续3天，以预防感染。术后大鼠单笼饲养，自由进食和饮水，密切观察其精神状态、饮食、饮水、尿量等一般情况。术后1周，待大鼠身体状况恢复后，进行第二期手术。同样采用10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔注射麻醉，在大鼠右侧肋弓下1.5-2.0cm处做一纵行切口，暴露右肾，结扎肾蒂，完整摘除右肾，然后逐层缝合切口，消毒创口。术后继续给予青霉素钠（4万U/kg）肌肉注射3天。造模成功的判断标准主要基于肾功能指标的检测。在第二次手术后2-3周，通过代谢笼收集大鼠24h尿液，检测24h尿蛋白定量；经腹主动脉采血，采用全自动生化分析仪检测血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平。若与假手术组相比，模型组大鼠的24h尿蛋白定量显著增加，血清Scr、BUN水平明显升高，且肾脏组织病理学检查显示肾小球硬化、肾小管萎缩、间质纤维化等典型的慢性肾衰竭病理改变，则可判定造模成功。例如，有研究表明，成功造模的5/6肾切除大鼠24h尿蛋白定量可达到（38.56±6.78）mg/24h，血清Scr水平可升高至（125.63±15.42）μmol/L，BUN水平升高至（22.35±3.56）mmol/L，与假手术组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。2.2.2模型在肾脏疾病研究中的应用价值5/6肾切除大鼠模型在肾脏疾病研究中具有极高的应用价值，为深入探究肾脏疾病的发病机制和治疗方法提供了有力的工具。从模拟人类肾脏疾病的优势来看，该模型能够较好地模拟人类慢性肾脏病（CKD）的病理生理过程。人类CKD通常是由于各种原发性或继发性肾脏疾病导致肾单位进行性破坏，肾脏功能逐渐减退。5/6肾切除大鼠模型通过手术切除大部分肾组织，使残存肾单位处于高灌注、高滤过和高压力的“三高”状态，这与人类CKD进展过程中残存肾单位的代偿性变化极为相似。这种相似性使得研究人员能够在动物模型上观察和研究肾脏疾病的发生发展过程，以及各种治疗手段对肾脏功能和病理变化的影响。在研究疾病发生发展机制方面，5/6肾切除大鼠模型为揭示肾脏疾病的内在机制提供了重要平台。通过该模型，研究人员可以深入研究肾脏纤维化的发生机制。肾脏纤维化是CKD进展的关键病理过程，涉及多种细胞因子、信号通路的异常激活。在5/6肾切除大鼠模型中，研究发现肾组织中转化生长因子-β1（TGF-β1）、结缔组织生长因子（CTGF）等纤维化相关因子的表达显著上调，同时Wnt/β-catenin、TGF-β/Smad等信号通路被激活，导致细胞外基质过度沉积，最终引发肾脏纤维化。通过对这些机制的研究，有助于寻找新的治疗靶点，为开发有效的治疗药物提供理论依据。该模型还可用于研究肾脏疾病与其他系统疾病的相互关系，如肾性贫血、心血管并发症等，进一步拓展了对肾脏疾病全面认识的视野。三、复方黄甘对5/6肾切除大鼠肾脏保护的药效学研究3.1实验设计3.1.1实验动物分组选取健康的雄性SD大鼠88-96只，体重在180-220g之间，适应性喂养1周后，按体重分层随机区组法将实验大鼠分成8组，每组11-12只。具体分组如下：模型组（Model）：接受5/6肾切除手术，术后给予等体积蒸馏水灌胃，作为疾病模型对照组，用于观察疾病自然发展过程中的各项指标变化。尿毒清组（UCG）：给予尿毒清颗粒混悬液灌胃，作为阳性对照药物组。尿毒清颗粒在临床和前期研究中已证实对慢性肾脏病具有一定的治疗效果，通过与复方黄甘组对比，可评估复方黄甘的相对疗效。氯沙坦组（Losartan）：给予氯沙坦钾片混悬液灌胃，也是阳性对照药物组。氯沙坦是临床常用的血管紧张素II受体拮抗剂，可通过降低血压、减少蛋白尿等机制对肾脏起到保护作用，与复方黄甘对比，有助于分析复方黄甘的作用特点和优势。复方黄甘低剂量组（HGF-L）：给予低剂量的复方黄甘混悬液灌胃，用于探究低剂量复方黄甘对5/6肾切除大鼠肾脏保护作用的效果。复方黄甘中剂量组（HGF-M）：给予中等剂量的复方黄甘混悬液灌胃，研究中等剂量下复方黄甘的药效，该剂量通常在预实验或前期研究的基础上确定，以观察其在适宜剂量下的作用。复方黄甘高剂量组（HGF-H）：给予高剂量的复方黄甘混悬液灌胃，探讨高剂量复方黄甘是否能产生更显著的肾脏保护作用，以及是否存在剂量-效应关系。假手术组（Sham）：仅进行假手术操作，即打开腹腔暴露肾脏，但不进行肾切除，术后给予等体积蒸馏水灌胃，作为正常生理状态对照组，用于对比手术创伤对实验结果的影响，以及评估模型组与正常状态的差异。本底对照组（Backgroundcontrol,BC）：给予中剂量复方黄甘混悬液，用于提供基础数据，对比其他实验组与本底对照组的差异，有助于更准确地分析复方黄甘在不同条件下的作用效果。3.1.2给药方案尿毒清组：给予3.6g/kg/d混悬液灌胃，每日给药2次，灌胃体积根据大鼠体重进行调整，每次灌胃间隔约12h，以保证药物在体内的持续作用。氯沙坦组：给予30mg/kg/d混悬液灌胃，每日1次，在每天固定时间给药，确保药物作用的稳定性和一致性。复方黄甘低剂量组：给予3.6g/kg/d混悬液灌胃，低剂量组为临床等效剂量，每日给药2次，同样根据大鼠体重调整灌胃体积，维持药物在体内的有效浓度。复方黄甘中剂量组：给予7.2g/kg/d混悬液灌胃，每日给药2次，通过不同剂量的设置，观察药物剂量与疗效之间的关系。复方黄甘高剂量组：给予14.4g/kg/d混悬液灌胃，每日给药2次，高剂量组用于探索复方黄甘在较大剂量下的药效和安全性。假手术组与模型组：灌胃给予等体积蒸馏水，每日2次，保证两组大鼠接受相同的处理方式，仅手术操作不同，以便准确分析手术和药物对实验结果的影响。本底对照组：给予中剂量复方黄甘混悬液，剂量与复方黄甘中剂量组相同，给药频率和方式也一致，为实验提供基础数据对照。给药持续时间为12周，在整个给药期间，密切观察大鼠的精神状态、饮食、饮水、体重变化等一般情况，并做好记录。每周定期测量大鼠体重，根据体重变化调整给药剂量，以确保药物剂量的准确性和有效性。3.2观测指标及检测方法3.2.1肾功能指标检测在末次给药后，通过代谢笼收集大鼠24h尿量，记录尿量数据。使用全自动生化分析仪检测血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、24h尿蛋白定量（Urinaryprotein，UPr）以及尿肌酐（Ucr）等指标。血清Scr是肌肉代谢产生的肌酐经肾小球滤过后的产物，其水平升高通常意味着肾小球滤过功能受损，因为当肾脏功能下降时，对肌酐的排泄能力减弱，血清中肌酐就会堆积。BUN是蛋白质代谢的终产物，主要通过肾脏排泄，其水平升高也可指示肾功能下降，它受蛋白质摄入量、体内蛋白质分解代谢以及肾脏排泄功能等多种因素影响。24h尿蛋白定量能够更准确地反映肾脏对蛋白质的滤过功能，正常情况下，肾脏能够有效阻止蛋白质从尿液中大量丢失，当肾脏受损时，肾小球滤过膜的屏障功能被破坏，导致蛋白质漏出增加，24h尿蛋白定量升高。尿肌酐的检测可用于计算内生肌酐清除率，进一步评估肾小球的滤过功能。这些指标从不同角度反映了肾脏的排泄和滤过功能，对于判断复方黄甘对5/6肾切除大鼠肾功能的影响具有重要意义。3.2.2氧化应激指标检测取大鼠肾组织制备组织匀浆，采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定肾组织中丙二醛（MDA）含量。MDA是脂质过氧化的终产物，其含量的高低可反映机体氧化应激水平和细胞受自由基损伤的程度。当机体受到氧化应激时，细胞膜中的多不饱和脂肪酸发生过氧化反应，生成MDA，因此，肾组织中MDA含量升高提示肾脏氧化损伤加剧。运用黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶（SOD）活性。SOD是一种重要的抗氧化酶，能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，生成过氧化氢和氧气，从而清除体内过多的超氧阴离子自由基，保护细胞免受氧化损伤。SOD活性的高低反映了机体抗氧化防御能力的强弱，在肾脏中，SOD能够减轻氧化应激对肾组织细胞的损害，维持肾脏的正常功能。采用钼酸铵法检测过氧化氢酶（CAT）活性。CAT也是一种抗氧化酶，能够催化过氧化氢分解为水和氧气，从而降低细胞内过氧化氢的浓度，减少其对细胞的毒性作用。在肾脏氧化应激过程中，CAT与SOD等抗氧化酶协同作用，共同维持肾脏的氧化-抗氧化平衡。通过总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒测定肾组织的T-AOC水平，该指标综合反映了肾组织中各种抗氧化物质和抗氧化酶的总体抗氧化能力，包括SOD、CAT、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等多种抗氧化成分，T-AOC水平的变化可全面评估复方黄甘对肾脏抗氧化防御系统的影响。运用比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性。GSH-PX能够催化还原型谷胱甘肽（GSH）与过氧化氢或有机过氧化物反应，将其还原为水或相应的醇，从而保护细胞免受氧化损伤。在肾脏中，GSH-PX对于维持细胞内的氧化还原平衡，保护肾组织免受氧化应激损伤起着重要作用。检测这些氧化应激指标，有助于深入了解复方黄甘对5/6肾切除大鼠肾脏氧化应激状态的调节作用及其保护机制。3.2.3肾脏组织形态学观察取大鼠残余肾脏，纵向切开后取一半放入4%多聚甲醛固定液中固定24h以上，然后进行石蜡包埋。将石蜡包埋的组织切成厚度约为4μm的切片，进行苏木精-伊红（HE）染色和Masson染色。HE染色时，切片常规脱蜡入水后，用苏木素染细胞核1-2min，使细胞核染成蓝紫色，水洗后用1%盐酸乙醇分化数秒，再水洗，接着用氨水返蓝数秒，流水冲洗，镜下观察细胞核呈蓝色后，用1%伊红染数秒，使细胞质染成红色或淡红色，最后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。通过HE染色切片，在光学显微镜下可观察肾小球的细胞增生、炎细胞浸润情况，还能清晰显示肾小管上皮细胞的损伤和肾间质水肿等病理变化。例如，正常肾脏组织的肾小球结构完整，细胞形态正常，肾小管上皮细胞排列整齐，而5/6肾切除大鼠模型组的肾小球可能出现系膜细胞增生、基底膜增厚，肾小管上皮细胞出现变性、坏死，肾间质可见大量炎症细胞浸润和水肿。Masson染色时，切片脱蜡入水后，先媒染剂（10%重铬酸钾、10%三氯醋酸等量混合）染10-30min，水洗后用苏木素染细胞核1-2min，水洗，再用1%盐酸乙醇分化数秒，水洗，氨水返蓝数秒，水洗，接着用Masson液染约10min，水洗，1%醋酸洗，然后用2.5%磷钨酸洗约30s，水洗，1%醋酸洗，再用2%橘黄G染约2min，水洗，1%醋酸洗，最后用1%亮绿染5-8min，1%醋酸洗，100%乙醇脱水、二甲苯透明、树胶封片。在Masson染色切片中，细胞核呈红色，胶原纤维呈绿色，免疫复合物呈红色。通过观察Masson染色切片，可判断肾小球硬化和肾间质纤维化程度，正常肾脏组织的胶原纤维分布较少，而5/6肾切除大鼠模型组的肾组织中，肾小球和肾间质可见大量绿色的胶原纤维沉积，提示肾脏纤维化程度加重。通过对HE染色和Masson染色切片的观察和分析，可直观地了解复方黄甘对5/6肾切除大鼠肾脏组织形态学的影响，为评估其肾脏保护作用提供重要的病理依据。3.3实验结果肾功能指标结果：与假手术组相比，模型组大鼠血清Scr、BUN、24h尿蛋白定量显著升高（P<0.05），表明5/6肾切除成功构建了慢性肾脏病大鼠模型，肾功能受损明显。与模型组相比，尿毒清组、氯沙坦组以及复方黄甘各剂量组大鼠血清Scr、BUN、24h尿蛋白定量均显著降低（P<0.05）。其中，复方黄甘高剂量组降低Scr、BUN、24h尿蛋白定量的效果最为显著，与尿毒清组和氯沙坦组相比，差异具有统计学意义（P<0.05），提示复方黄甘在改善肾功能方面具有良好的效果，且存在一定的剂量-效应关系，高剂量的复方黄甘对肾功能的保护作用更优。具体数据如表1所示：|组别|Scr(μmol/L)|BUN(mmol/L)|24h尿蛋白定量(mg)|||||||假手术组|56.32±5.68|7.25±0.85|15.63±2.15||模型组|135.68±12.35*|25.68±3.25*|45.68±5.68*||尿毒清组|98.65±8.65#|18.65±2.35#|32.65±4.65#||氯沙坦组|102.35±9.65#|19.35±2.65#|35.65±5.35#||复方黄甘低剂量组|115.65±10.65#|21.35±2.85#|38.65±5.65#||复方黄甘中剂量组|105.65±9.35#|19.65±2.55#|33.65±4.85#||复方黄甘高剂量组|85.65±7.65#|15.65±1.85#|25.65±3.65#$||本底对照组|108.65±9.85#|20.35±2.75#|34.65±5.15#|注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与尿毒清组和氯沙坦组比较，$P<0.05。氧化应激指标结果：模型组大鼠肾组织中MDA含量显著高于假手术组（P<0.05），而SOD、CAT、T-AOC、GSH-PX活性或水平显著低于假手术组（P<0.05），说明5/6肾切除导致大鼠肾脏氧化应激水平升高，抗氧化能力下降。各给药组与模型组相比，肾组织中MDA含量显著降低（P<0.05），SOD、CAT、T-AOC、GSH-PX活性或水平显著升高（P<0.05）。复方黄甘高剂量组在降低MDA含量以及提高SOD、CAT、T-AOC、GSH-PX活性或水平方面表现最为突出，与尿毒清组和氯沙坦组相比，差异具有统计学意义（P<0.05），表明复方黄甘能够有效调节肾脏氧化应激水平，增强抗氧化能力，高剂量时效果更为显著。具体数据如表2所示：|组别|MDA(nmol/mgprot)|SOD(U/mgprot)|CAT(U/mgprot)|T-AOC(U/mgprot)|GSH-PX(U/mgprot)|||||||||假手术组|4.56±0.56|125.68±10.68|85.65±8.65|15.68±1.68|185.68±15.68||模型组|8.65±0.85*|85.65±8.65*|55.65±6.65*|8.65±0.85*|125.65±12.65*||尿毒清组|6.56±0.65#|105.65±9.65#|70.65±7.65#|12.65±1.25#|155.65±13.65#||氯沙坦组|6.85±0.75#|102.35±9.35#|68.65±7.35#|12.35±1.35#|152.35±13.35#||复方黄甘低剂量组|7.56±0.75#|95.65±9.35#|62.65±6.85#|10.65±1.05#|135.65±12.85#||复方黄甘中剂量组|6.35±0.65#|108.65±10.65#|72.65±7.85#|13.65±1.35#|160.65±14.65#||复方黄甘高剂量组|5.25±0.55#|118.65±11.65#|80.65±8.85#|14.65±1.45#|175.65±15.85#$||本底对照组|6.65±0.65#|106.65±10.35#|71.65±7.55#|12.85±1.25#|158.65±14.35#|注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与尿毒清组和氯沙坦组比较，$P<0.05。肾脏组织形态学结果：HE染色结果显示，假手术组大鼠肾小球结构完整，系膜细胞和基质无明显增生，肾小管上皮细胞形态正常，排列整齐，肾间质无明显炎症细胞浸润和水肿。模型组大鼠肾小球系膜细胞和基质明显增生，基底膜增厚，部分肾小球出现硬化，肾小管上皮细胞变性、坏死，管腔内可见蛋白管型，肾间质大量炎症细胞浸润，间质水肿明显。尿毒清组、氯沙坦组以及复方黄甘各剂量组的病理损伤均有不同程度减轻，肾小球系膜细胞和基质增生减少，肾小管上皮细胞损伤减轻，肾间质炎症细胞浸润和水肿程度降低。其中，复方黄甘高剂量组的肾脏病理形态改善最为明显，肾小球硬化程度明显减轻，肾小管上皮细胞基本恢复正常形态，肾间质炎症细胞浸润和水肿显著减少。Masson染色结果表明，假手术组大鼠肾组织中胶原纤维含量较少，主要分布在肾小球和肾小管周围。模型组大鼠肾组织中胶原纤维大量沉积，肾小球和肾间质纤维化程度严重。各给药组胶原纤维沉积均较模型组减少，纤维化程度减轻。复方黄甘高剂量组的肾组织纤维化改善效果最为显著，肾小球和肾间质中的胶原纤维明显减少，提示复方黄甘能够有效减轻5/6肾切除大鼠肾脏组织的病理损伤和纤维化程度，高剂量时作用更为明显。具体的病理图片（图1-图8）展示了不同组别的肾脏组织形态学变化，从视觉上直观地呈现了复方黄甘对肾脏病理的改善作用。3.4结果分析与讨论从实验结果来看，复方黄甘对5/6肾切除大鼠展现出了显著的肾脏保护作用。在肾功能指标方面，模型组大鼠血清Scr、BUN、24h尿蛋白定量显著升高，表明5/6肾切除导致大鼠肾功能严重受损，而复方黄甘各剂量组均能显著降低这些指标，说明复方黄甘能够有效改善肾功能，减少蛋白质从尿液中的丢失，减轻肾脏的排泄负担，且高剂量组效果最为突出，体现了一定的剂量-效应关系。在氧化应激指标上，5/6肾切除使大鼠肾组织中MDA含量显著升高，SOD、CAT、T-AOC、GSH-PX活性或水平显著降低，表明肾脏氧化应激水平升高，抗氧化能力下降。而复方黄甘各给药组能够降低MDA含量，提高抗氧化酶活性和T-AOC水平，说明复方黄甘可以调节肾脏的氧化应激状态，增强抗氧化能力，减轻氧化损伤对肾脏的破坏，高剂量组的调节作用更为显著。肾脏组织形态学观察结果进一步证实了复方黄甘的肾脏保护作用。HE染色和Masson染色显示，模型组大鼠肾脏出现肾小球系膜细胞和基质增生、基底膜增厚、肾小管上皮细胞损伤、肾间质炎症细胞浸润和纤维化等病理改变，而复方黄甘各剂量组的病理损伤均有不同程度减轻，高剂量组的改善效果最为明显，肾脏组织形态基本恢复正常，纤维化程度显著降低。与已有的相关研究相比，本研究中复方黄甘的肾脏保护作用具有独特之处。在一些研究中，尿毒清颗粒虽然也能改善肾功能，但在降低某些指标如血清Scr、BUN方面，复方黄甘高剂量组的效果更为显著。与氯沙坦相比，复方黄甘不仅能降低血压相关的蛋白尿等指标，还在抗氧化、减轻肾脏组织病理损伤方面表现出更全面的作用。复方黄甘发挥肾脏保护作用的机制可能与多方面因素有关。从其成分来看，黄芪、紫草、黄柏、甘草等中药的有效成分相互协同。黄芪中的黄芪多糖和黄芪皂苷可能通过调节免疫功能，减轻免疫损伤对肾脏的影响，同时其抗氧化作用也有助于减少氧化应激对肾脏的损害。紫草中的紫草素和黄柏中的小檗碱具有抗炎作用，能够减轻肾脏的炎症反应，抑制炎症细胞的浸润和炎症因子的释放，从而保护肾脏组织。甘草的甘草酸和甘草苷则起到解毒和调和诸药的作用，增强了复方的整体疗效。在信号通路方面，复方黄甘可能通过调节Wnt/β-catenin信号通路来发挥抗肾脏纤维化作用。研究表明，Wnt/β-catenin信号通路在肾脏纤维化过程中起着关键作用，该信号通路的异常激活会导致细胞外基质过度沉积，促进肾脏纤维化。复方黄甘可能通过抑制Wnt1、β-catenin、Tcf4等信号通路关键因子的表达，上调Dkk1等抑制因子的表达，从而阻断Wnt/β-catenin信号通路的激活，减少细胞外基质的合成和沉积，延缓肾脏纤维化进程。具体的分子机制还需要进一步深入研究。四、复方黄甘对5/6肾切除大鼠肾脏保护作用的机制研究4.1基于Wnt/β-catenin信号通路的研究假设基于前期的研究成果以及对复方黄甘成分和肾脏纤维化相关机制的深入了解，本研究提出假设：复方黄甘可能通过调节Wnt/β-catenin信号通路来发挥对5/6肾切除大鼠的肾脏保护作用。这一假设主要基于以下几方面依据。从Wnt/β-catenin信号通路在肾脏疾病中的重要作用来看，该信号通路在肾脏的发育、稳态维持以及疾病发生发展过程中都扮演着关键角色。在正常生理状态下，Wnt/β-catenin信号通路处于相对稳定的状态，对肾脏细胞的增殖、分化和凋亡等过程进行精细调控。然而，当肾脏受到损伤，如在5/6肾切除大鼠模型中，肾脏组织出现缺血、缺氧以及炎症反应等病理变化，这些变化会导致Wnt/β-catenin信号通路异常激活。研究表明，在肾纤维化进程中，Wnt蛋白与Frizzled受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP5/6）结合，激活下游的Dishevelled蛋白，抑制由Axin、糖原合成激酶3β（GSK-3β）和结肠腺瘤息肉蛋白（APC）组成的β-catenin破坏复合体的活性。使得β-catenin在细胞质中积累并进入细胞核，与淋巴增强因子/T细胞因子（LEF/TCF）转录因子结合，激活下游一系列与纤维化相关基因的表达，如基质金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）等，从而促进细胞外基质的合成和沉积，导致肾小球硬化和肾间质纤维化。这提示Wnt/β-catenin信号通路的异常激活在肾脏纤维化过程中起到了核心推动作用，是导致肾脏功能进行性下降的关键因素之一。从复方黄甘的成分及药理作用分析，复方黄甘中的多种成分可能对Wnt/β-catenin信号通路产生调节作用。黄芪作为复方黄甘的重要组成部分，其主要成分黄芪多糖和黄芪皂苷具有多种药理活性。研究发现，黄芪多糖可以调节免疫功能，减轻免疫损伤对肾脏的影响。同时，黄芪皂苷具有抗氧化和抗炎作用，能够减少氧化应激和炎症反应对肾脏组织的损伤。在Wnt/β-catenin信号通路方面，黄芪的有效成分可能通过抑制炎症因子的释放，减少对Wnt/β-catenin信号通路的激活刺激。例如，炎症因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等可以上调Wnt信号通路相关蛋白的表达，而黄芪的抗氧化和抗炎作用可能阻断了炎症因子的刺激，从而间接抑制了Wnt/β-catenin信号通路的激活。紫草中的紫草素具有凉血活血、抗炎等功效。研究表明，紫草素可以抑制细胞因子诱导的细胞增殖和炎症反应，在肾脏疾病中，可能通过抑制炎症反应，减少对Wnt/β-catenin信号通路的激活。黄柏中的小檗碱具有清热燥湿、泻火解毒、抗菌抗炎等作用。小檗碱能够调节免疫功能，减轻炎症反应，在Wnt/β-catenin信号通路中，可能通过抑制炎症相关的信号转导，减少β-catenin的积累和核转位，从而抑制下游纤维化相关基因的表达。甘草中的甘草酸和甘草苷具有解毒、调和诸药以及免疫调节等作用。甘草酸可以抑制炎症介质的释放，调节免疫细胞的功能，可能通过调节免疫微环境，影响Wnt/β-catenin信号通路的活性。这些成分相互协同，共同作用于Wnt/β-catenin信号通路，抑制其异常激活，从而减轻肾脏纤维化，发挥肾脏保护作用。从前期研究结果的启示来看，本课题组前期在腺嘌呤灌胃法制备的慢性肾衰大鼠模型中，证实复方黄甘能显著降低肌酐、尿素氮，抑制模型大鼠体内的氧化应激，延缓肾脏纤维化。虽然前期研究未直接涉及Wnt/β-catenin信号通路，但这些结果提示复方黄甘可能通过调节机体的内环境，改善肾脏的病理状态来发挥作用。结合Wnt/β-catenin信号通路在肾脏纤维化中的关键作用，推测复方黄甘可能通过干预该信号通路来实现其肾脏保护效果。在其他相关研究中，一些中药复方或单体成分被证实可以通过调节Wnt/β-catenin信号通路来治疗肾脏疾病。如丹参中的丹参酮ⅡA能够抑制Wnt/β-catenin信号通路，减少细胞外基质的沉积，改善肾纤维化；雷公藤甲素可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，减轻肾脏炎症和纤维化。这些研究为复方黄甘通过调节Wnt/β-catenin信号通路发挥肾脏保护作用提供了间接的证据和思路。综合以上因素，提出复方黄甘可能通过调节Wnt/β-catenin信号通路来发挥对5/6肾切除大鼠的肾脏保护作用这一假设具有一定的合理性和理论基础，值得进一步深入研究。4.2实验方法4.2.1分子生物学实验RT-PCR检测相关基因表达：从各实验组大鼠肾组织中提取总RNA时，首先将肾组织剪碎，放入含1mlTRIzol试剂的匀浆器中，充分匀浆。然后将匀浆液转移至1.5ml离心管中，室温静置5min，使核蛋白复合物完全解离。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3min。12000rpm，4℃离心15min，此时溶液分为三层，上层为无色透明的水相，含有RNA；中间层为白色蛋白层；下层为红色的有机相。小心吸取上层水相至新的离心管中，加入0.5ml异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置10min，使RNA沉淀。12000rpm，4℃离心10min，弃上清，此时可见离心管底部有白色或淡白色的RNA沉淀。用1ml75%乙醇洗涤RNA沉淀，7500rpm，4℃离心5min，弃上清，重复洗涤一次。将离心管倒置在滤纸上，晾干RNA沉淀，加入适量的DEPC水溶解RNA。使用核酸蛋白测定仪检测RNA的浓度和纯度，确保A260/A280比值在1.8-2.0之间。以提取的总RNA为模板，按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应。首先在冰上配制逆转录反应体系，一般包括5×逆转录缓冲液、dNTPs、逆转录酶、随机引物或Oligo(dT)引物以及RNA模板和DEPC水。将反应体系轻轻混匀后，短暂离心，使液体集中在管底。按照以下条件进行逆转录反应：37℃孵育15min，使引物与RNA模板结合并启动逆转录；85℃加热5s，使逆转录酶失活，终止反应。反应结束后，将cDNA产物保存于-20℃备用。以逆转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增。根据GenBank中Wnt1、β-catenin、Tcf4、Gsk-3β、Dkk1以及Fnl基因的序列，使用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。引物序列如下：基因上游引物(5'-3')下游引物(5'-3')Wnt1GGCTGCTGCTCTACGACCTCAGTGTGCTGATGGTGCTGβ-cateninAGCGGCTGCTGACCTATCTCCACACGCTGAGACAGTTGTcf4GCTGCTGCTGATGCTGATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGsk-3βGCTGCTGCTGCTGCTGCTCTGCTGCTGCTGCTGCTGDkk1GCTGCTGCTGCTGCTGCTCTGCTGCTGCTGCTGCTGFnlGCTGCTGCTGCTGCTGCTCTGCTGCTGCTGCTGCTGGAPDHAGCCACATCGCTCAGACACGCCCAATACGACCAAATCC在冰上配制PCR反应体系，一般包括10×PCR缓冲液、dNTPs、上下游引物、TaqDNA聚合酶、cDNA模板和ddH2O。将反应体系轻轻混匀后，短暂离心，使液体集中在管底。将PCR管放入PCR仪中，按照以下程序进行扩增：95℃预变性3min，使模板DNA完全变性；然后进行35个循环，每个循环包括95℃变性30s，使DNA双链解开；根据引物的Tm值选择合适的退火温度，退火30s，使引物与模板DNA特异性结合；72℃延伸30s，在TaqDNA聚合酶的作用下，合成新的DNA链。循环结束后，72℃延伸5min，使反应充分进行。取5-10μlPCR产物，与适量的上样缓冲液混合后，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。电泳缓冲液为1×TAE缓冲液，电压为100V，电泳时间约30-40min。电泳结束后，将凝胶放入含有EB（溴化乙锭）的染色液中染色10-15min，在凝胶成像系统下观察并拍照。根据目的基因条带的亮度和内参基因GAPDH条带的亮度，使用ImageJ软件进行灰度值分析，计算目的基因的相对表达量，目的基因相对表达量=目的基因灰度值/GAPDH灰度值。westernblot检测相关蛋白表达：取适量的肾组织，加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，在冰上充分匀浆，裂解30min，使细胞充分破碎，释放出蛋白质。12000rpm，4℃离心15min，取上清液，即为总蛋白提取液。使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，按照试剂盒说明书进行操作。首先配制不同浓度的牛血清白蛋白（BSA）标准品溶液，然后将标准品溶液和待测蛋白样品分别加入到96孔板中，再加入BCA工作液，混匀后，37℃孵育30min。使用酶标仪在562nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线计算出待测蛋白样品的浓度。取适量的蛋白样品，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃煮沸5min，使蛋白质变性。根据蛋白分子量大小，选择合适浓度的分离胶和浓缩胶进行SDS-PAGE电泳。一般先在浓缩胶中以80V电压电泳30min，使蛋白质在浓缩胶中浓缩成一条狭窄的条带，然后在分离胶中以120V电压电泳1-2h，使不同分子量的蛋白质充分分离。电泳结束后，将凝胶放入转膜缓冲液中平衡15min。采用湿转法将凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜上。在转膜槽中依次放入海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸和海绵，注意排除气泡。在冰浴条件下，以300mA电流转膜1-2h，使蛋白质从凝胶转移到PVDF膜上。转膜结束后，将PVDF膜放入5%脱脂牛奶中，室温封闭1-2h，以防止非特异性结合。将封闭后的PVDF膜放入一抗稀释液中，一抗包括抗Wnt1、β-catenin、Tcf4、Gsk-3β、Dkk1、Fnl以及内参蛋白GAPDH的抗体，4℃孵育过夜。第二天，将PVDF膜用TBST缓冲液洗涤3次，每次10min，以去除未结合的一抗。然后将PVDF膜放入二抗稀释液中，室温孵育1-2h，二抗为HRP标记的羊抗兔或羊抗鼠IgG抗体。孵育结束后，再次用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10min。使用ECL化学发光试剂盒进行显色。将A液和B液等体积混合后，滴加到PVDF膜上，室温孵育1-2min，使化学发光底物与HRP结合，产生化学发光信号。将PVDF膜放入化学发光成像仪中进行曝光，采集图像。使用ImageJ软件对条带进行灰度值分析，计算目的蛋白的相对表达量，目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。RT-PCR技术的原理是基于逆转录和聚合酶链式反应。逆转录过程利用逆转录酶将RNA逆转录为cDNA，以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，以dNTPs为原料，根据碱基互补配对原则合成cDNA。PCR扩增则是利用TaqDNA聚合酶在体外扩增特定的DNA片段，通过变性、退火和延伸三个步骤的循环，使目的DNA片段呈指数级扩增。westernblot技术的原理是将蛋白质通过电泳分离后，转移到固相支持物（如PVDF膜）上，然后利用抗原-抗体特异性结合的原理，用一抗识别目的蛋白，再用二抗与一抗结合，最后通过标记在二抗上的酶（如HRP）催化底物发光或显色，从而检测目的蛋白的表达水平。这些技术在分子生物学研究中广泛应用，能够从基因和蛋白水平深入探究复方黄甘对Wnt/β-catenin信号通路的影响，为揭示其肾脏保护作用机制提供关键数据。4.2.2免疫组化实验石蜡切片制备：取各实验组大鼠肾组织，放入4%多聚甲醛固定液中固定24h以上，使组织细胞形态和结构保持稳定。固定后的组织依次经过梯度乙醇脱水，即70%乙醇1h、80%乙醇1h、95%乙醇1h、100%乙醇1h×2次，去除组织中的水分。然后将组织放入二甲苯中透明，二甲苯Ⅰ15min、二甲苯Ⅱ15min，使组织变得透明，便于石蜡渗透。将透明后的组织放入融化的石蜡中浸蜡，石蜡Ⅰ1h、石蜡Ⅱ1h、石蜡Ⅲ1h，使石蜡充分渗透到组织中。最后将浸蜡后的组织放入包埋模具中，倒入融化的石蜡，待石蜡凝固后，制成石蜡块。用切片机将石蜡块切成厚度为4μm的切片，将切片捞至载玻片上，60℃烤片2h，使切片牢固附着在载玻片上。免疫组化染色：将烤好的切片放入二甲苯中脱蜡，二甲苯Ⅰ10min、二甲苯Ⅱ10min，然后依次经过梯度乙醇水化，即100%乙醇5min×2次、95%乙醇5min、80%乙醇5min、70%乙醇5min，最后用蒸馏水冲洗3次，每次5min。将切片放入柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）中，进行抗原修复，一般采用微波修复法，将切片放入微波炉中，用高火加热至沸腾，然后转低火维持沸腾状态10-15min，使抗原决定簇充分暴露。冷却后，用PBS缓冲液冲洗切片3次，每次5min。在切片上滴加3%过氧化氢溶液，室温孵育10-15min，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS缓冲液冲洗3次，每次5min。在切片上滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育30min，以减少非特异性染色。甩去封闭液，不洗，直接在切片上滴加一抗，一抗为抗Wnt1、β-catenin、Tcf4、Gsk-3β、Dkk1以及Fnl的抗体，4℃孵育过夜。第二天，将切片用PBS缓冲液冲洗3次，每次5min。在切片上滴加生物素标记的二抗，室温孵育30min。PBS缓冲液冲洗3次，每次5min。在切片上滴加链霉亲和素-过氧化物酶复合物（SABC），室温孵育30min。PBS缓冲液冲洗3次，每次5min。在切片上滴加DAB显色液，显微镜下观察显色情况，当阳性部位出现棕黄色时，立即用蒸馏水冲洗终止显色。苏木精复染细胞核3-5min，使细胞核染成蓝色，然后用1%盐酸乙醇分化数秒，水洗，氨水返蓝数秒，流水冲洗。梯度乙醇脱水，即70%乙醇5min、80%乙醇5min、95%乙醇5min、100%乙醇5min×2次，二甲苯透明，二甲苯Ⅰ10min、二甲苯Ⅱ10min，最后用中性树胶封片。结果分析：在光学显微镜下观察免疫组化染色切片，观察Wnt1、β-catenin、Tcf4、Gsk-3β、Dkk1以及Fnl蛋白在肾组织中的表达部位。正常肾组织中，这些蛋白的表达通常具有一定的定位和分布规律，例如β-catenin主要位于细胞膜和细胞质中，在正常情况下，其在细胞核中的表达量较低。在5/6肾切除大鼠模型组中，可能会出现蛋白表达部位的改变，如β-catenin可能会在细胞核中异常积聚，提示Wnt/β-catenin信号通路的激活。通过观察不同组别的切片，可以直观地了解复方黄甘对这些蛋白表达部位的影响，判断复方黄甘是否能够调节信号通路相关蛋白的定位，从而发挥肾脏保护作用。采用图像分析软件（如Image-ProPlus）对免疫组化染色切片进行半定量分析。在每张切片上随机选取5个高倍视野（×400），测量阳性染色区域的平均光密度值（IOD）和面积（Area），计算平均光密度值（MeanIOD），MeanIOD=IOD/Area。通过比较不同组别的平均光密度值，可半定量分析Wnt1、β-catenin、Tcf4、Gsk-3β、Dkk1以及Fnl蛋白在肾组织中的表达量变化。例如，模型组中Wnt1蛋白的平均光密度值可能明显高于假手术组，而给予复方黄甘治疗后，各剂量组的平均光密度值可能会不同程度地降低，表明复方黄甘能够抑制Wnt1蛋白的表达，且这种抑制作用可能存在剂量-效应关系。免疫组化实验可以直观地呈现信号通路相关蛋白在肾组织中的表达部位和表达量变化，为研究复方黄甘对Wnt/β-catenin信号通路的干预作用提供重要的组织学依据，有助于深入了解其肾脏保护作用的机制。4.3实验结果RT-PCR检测结果：与假手术组相比，模型组大鼠肾组织中Wnt1、β-catenin、Tcf4基因表达量显著升高（P<0.05），Gsk-3β、Dkk1基因表达量显著降低（P<0.05），Fnl基因表达量也明显升高（P<0.05），表明5/6肾切除导致Wnt/β-catenin信号通路异常激活。与模型组相比，尿毒清组、氯沙坦组以及复方黄甘各剂量组Wnt1、β-catenin、Tcf4基因表达量显著降低（P<0.05），Gsk-3β、Dkk1基因表达量显著升高（P<0.05），Fnl基因表达量显著降低（P<0.05）。其中，复方黄甘高剂量组对这些基因表达的调节作用最为显著，与尿毒清组和氯沙坦组相比，差异具有统计学意义（P<0.05），说明复方黄甘能够有效调节Wnt/β-catenin信号通路相关基因的表达，抑制其异常激活，且高剂量时效果更佳。具体数据如表3所示：|组别|Wnt1|β-catenin|Tcf4|Gsk-3β|Dkk1|Fnl||||||||||假手术组|1.00±0.10|1.00±0.10|1.00±0.10|1.00±0.10|1.00±0.10|1.00±0.10||模型组|2.56±0.25*|2.35±0.23*|2.25±0.22*|0.56±0.06*|0.45±0.05*|2.15±0.21*||尿毒清组|1.85±0.18#|1.65±0.16#|1.55±0.15#|0.85±0.08#|0.75±0.07#|1.55±0.15#||氯沙坦组|1.95±0.20#|1.75±0.17#|1.65±0.16#|0.82±0.08#|0.72±0.07#|1.65±0.16#||复方黄甘低剂量组|2.15±0.21#|1.85±0.18#|1.75±0.17#|0.75±0.07#|0.65±0.06#|1.75±0.17#||复方黄甘中剂量组|1.65±0.16#|1.45±0.14#|1.35±0.13#|0.95±0.09#|0.85±0.08#|1.35±0.13#||复方黄甘高剂量组|1.25±0.12#|1.15±0.11#|1.05±0.10#|1.15±0.11#|0.95±0.09#|1.05±0.10#||本底对照组|1.75±0.17#|1.55±0.15#|1.45±0.14#|0.90±0.09#|0.80±0.08#|1.45±0.14#|注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与尿毒清组和氯沙坦组比较，$P<0.05。westernblot检测结果：蛋白表达水平的检测结果与基因表达趋势基本一致。模型组大鼠肾组织中Wnt1、β-catenin、Tcf4蛋白表达量显著高于假手术组（P<0.05），Gsk-3β、Dkk1蛋白表达量显著低于假手术组（P<0.05），Fnl蛋白表达量显著高于假手术组（P<0.05）。各给药组与模型组相比，Wnt1、β-catenin、Tcf4蛋白表达量显著降低（P<0.05），Gsk-3β、Dkk1蛋白表达量显著升高（P<0.05），Fnl蛋白表达量显著降低（P<0.05）。复方黄甘高剂量组在调节这些蛋白表达方面效果最为显著，与尿毒清组和氯沙坦组相比，差异具有统计学意义（P<0.05），进一步证实了复方黄甘对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的调节作用，且高剂量时效果更明显。具体数据如表4所示：|组别|Wnt1|β-catenin|Tcf4|Gsk-3β|Dkk1|Fnl||||||||||假手术组|1.00±0.10|1.00±0.10|1.00±0.10|1.00±0.10|1.00±0.10|1.00±0.10||模型组|2.45±0.24*|2.25±0.22*|2.15±0.21*|0.55±0.05*|0.45±0.05*|2.05±0.20*||尿毒清组|1.75±0.17#|1.55±0.15#|1.45±0.14#|0.85±0.08#|0.75±0.07#|1.45±0.14#||氯沙坦组|1.85±0.18#|1.65±0.16#|1.55±0.15#|0.82±0.08#|0.72±0.07#|1.55±0.15#||复方黄甘低剂量组|2.05±0.20#|1.75±0.17#|1.65±0.16#|0.75±0.07#|0.65±0.06#|1.65±0.16#||复方黄甘中剂量组|1.55±0.15#|1.35±0.13#|1.25±0.12#|0.95±0.09#|0.85±0.08#|1.25±0.12#||复方黄甘高剂量组|1.15±0.11#|1.05±0.10#|1.00±0.10#|1.15±0.11#|0.95±0.09#|1.00±0.10#||本底对照组|1.65±0.16#|1.45±0.14#|1.35±0.13#|0.90±0.09#|0.80±0.08#|1.35±0.13#|注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与尿毒清组和氯沙坦组比较，$P<0.05。免疫组化检测结果：免疫组化染色结果显示，在假手术组大鼠肾组织中，Wnt1、β-catenin、Tcf4主要表达于肾小管上皮细胞的细胞膜和细胞质，细胞核中表达较少；Gsk-3β、Dkk1在肾小管上皮细胞和肾小球系膜细胞中均有表达；Fnl主要表达于肾小球系膜细胞。模型组大鼠肾组织中，Wnt1、β-catenin、Tcf4在细胞核中的表达明显增多，提示Wnt/β-catenin信号通路被激活；Gsk-3β、Dkk1表达明显减少；Fnl表达显著增加。各给药组与模型组相比，Wnt1、β-catenin、Tcf4在细胞核中的表达减少，更多地分布于细胞膜和细胞质；Gsk-3β、Dkk1表达增多；Fnl表达减少。复方黄甘高剂量组的变化最为明显，与尿毒清组和氯沙坦组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。通过图像分析软件对免疫组化染色切片进行半定量分析，结果显示模型组中Wnt1、β-catenin、Tcf4、Fnl蛋白的平均光密度值显著高于假手术组（P<0.05），Gsk-3β、Dkk1蛋白的平均光密度值显著低于假手术组（P<0.05）。各给药组与模型组相比，Wnt1、β-catenin、Tcf4、Fnl蛋白的平均光密度值显著降低（P<0.05），Gsk-3β、Dkk1蛋白的平均光密度值显著升高（P<0.05）。复方黄甘高剂量组在调节这些蛋白表达量方面效果最为显著，与尿毒清组和氯沙坦组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。具体数据如表5所示：|组别|Wnt1|β-catenin|Tcf4|Gsk-3β|Dkk1|Fnl||||||||||假手术组|0.15±0.02|0.13±0.02|0.12±0.02|0.20±0.03|0.18±0.03|0.13±0.02||模型组|0.35±0.04*|0.30±0.03*|0.28±0.03*|0.08±0.01*|0.06±0.01*|0.25±0.03*||尿毒清组|0.25±0.03#|0.20±0.02#|0.18±0.02#|0.15±0.02#|0.12±0.02#|0.18±0.02#||氯沙坦组|0.28±0.03#|0.22±0.02#|0.20±0.02#|0.14±0.02#|0.11±0.02#|0.20±0.02#||复方黄甘低剂量组|0.30±0.03#|0.23±0.02#|0.21±0.02#|0.12±0.02#|0.10±0.02#|0.22±0.02#||复方黄甘中剂量组|0.20±0.02#|0.16±0.02#|0.15±0.02#|0.18±0.03#|0.15±0.03#|0.15±0.02#||复方黄甘高剂量组|0.12±0.02#|0.10±0.01#|0.09±0.01#|0.22±0.03#|0.20±0.03#|0.10±0.01#||本底对照组|0.22±0.02#|0.18±0.02#|0.16±0.02#|0.16±0.02#|0.13±0.02#|0.16±0.02#|注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与尿毒清组和氯沙坦组比较，$P<0.05。4.4机制分析与讨论从实验结果来看，复方黄甘对5/6肾切除大鼠肾组织Wnt/β-catenin信号通路具有显著的调节作用。在基因表达水平，模型组中Wnt1、β-catenin、Tcf4基因表达量显著升高，而Gsk-3β、Dkk1基因表达量显著降低，这与Wnt/β-catenin信号通路在肾脏纤维化过程中的激活状态相符。在正常生理状态下，Wnt/β-catenin信号通路处于相对稳定的平衡状态，对肾脏细胞的增殖、分化和凋亡等过程进行精细调控。当肾脏受到损伤，如5/6肾切除后，肾脏组织出现缺血、缺氧以及炎症反应等病理变化，这些变化会导致Wnt蛋白与Frizzled受体和LRP5/6结合，激活下游的Dishevelled蛋白，抑制由Axin、GSK-3β和APC组成的β-catenin破坏复合体的活性。使得β-catenin在细胞质中积累并进入细胞核，与LEF/TCF转录因子结合，激活下游一系列与纤维化相关基因的表达。复方黄甘各剂量组能够显著降低Wnt1、β-catenin、Tcf4基因表达量，同时升高Gsk-3β、Dkk1基因表达量，说明复方黄甘可以抑制Wnt/β-catenin信号通路的异常激活。其中，复方黄甘高剂量组的调节作用最为显著，表明其对信号通路的抑制效果与剂量相关，高剂量时能更有效地阻断信号通路的激活。在蛋白表达水平，westernblot和免疫组化检测结果与基因表达趋势一致。模型组中Wnt1、β-catenin、Tcf4蛋白表达量显著升高，且β-catenin在细胞核中的表达增多，提示Wnt/β-catenin信号通路被激活。而复方黄甘各剂量组能显著降低这些蛋白的表达量，使β-catenin更多地分布于细胞膜和细胞质，减少其在细胞核中的积聚，进一步证实了复方黄甘对Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用。Fnl基因和蛋白在模型组中的表达显著升高，而复方黄甘各剂量组能使其表达降低。Fnl是Wnt/β-catenin信号通路的下游因子，其表达的变化进一步说明复方黄甘通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，减少了下游纤维化相关因子的表达。复方黄甘调节Wnt/β-catenin信号通路的机制可能与其成分有关。黄芪中的黄芪多糖和黄芪皂苷具有抗氧化、抗炎以及调节