【金黄色葡萄球菌检测方法的研究状况国内外文献综述5800字】

代表；以抗原抗体反应为基础的免疫学检测方法，酶联免疫吸附法(Enzymelinked1.1传统培养法目前在我国检测食品中金黄色葡萄球菌采用的是传统检测方法，主要是根据骤，所需时长为78h。如图1-1所示。检样检样25g(mL样品+225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤，均质Baird-Parker平板，血平板36℃血平板18h~24hBaird-Parker平板18h~24h或45~48h涂片染色观察溶血BHI肉汤和营养琼脂小斜面血浆凝固实验报告第一步，先后在75%的氯化钠肉汤培养基、血琼脂平板Baird-Parker平板上接种待测样品。第二步，挑取疑似金黄色葡萄球菌的菌落进行染色然后镜检。第三步，进行血浆凝固酶试验以及其他生化试验。第四步，用标准阳性和菌株作对照组，全程大约需5-8d。定量检测方法：在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤上接种稀释好的三个梯度的稀释液，每个梯度平行做3管，培养一段时间后转接到Baird-Parker平板上继续培养，然后对典型菌落进行确认，通过查MPN表对金黄色葡萄球菌进行定量检测I23JI²1-23]。以上传统培养法虽然准确度较高，最低检出限可达到零，但是步骤繁琐，检测时间长，随着食品工业的发展，以及对食品安全的重视，传统检测方法已经远远不能满足食品检测的需要，迫切需要灵敏度更高、特异性更强简便快捷的食品安全检测技术和方法。1.2免疫学检测方法免疫学方法是基于抗原-抗体特异性结合的免疫学原理发展起来的检测技术，具有灵敏度高，特异性强的特点。但是该类方法也有一定的局限性，比如免疫学方法检测的灵敏度和特异性易受抗体特异性、抗体吸附能力以及基质背景干扰等因素的影响，不能满足种类繁多、组分复杂和目标菌含量低的食品样品的检测要求。(1)酶联免疫技术酶联免疫技术(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay,ELISA)是免疫分析技术中应用最广泛的方法。其基本原理是保持抗原(或抗体)原有的免疫活性并将其吸附于固相载体上，再加入酶标记进行免疫酶染色，底物显色后，分析有色产物的量即可确定样品中待测物质的含量，由于酶的催化效率很高，这就间接的放大了反应结果从而提高反应的敏感度[23I24-26]。ELISA技术在食品分析中的应用有很多，比如检测食品中的营养物质、微生物、农药残留以及重金属污染等。目前，ELISA技术在金黄色葡萄球菌的检测中主要是应用于检测其分泌的肠毒素。虽然ELISA技术以其灵敏度高、特异性强而著称，但是也存在一些缺陷，由于在该技术中所用的抗原、抗体以及标记物等生物制剂的稳定性不够强，容易在相同的检样中产生差别，同时，由于联免疫试剂的储存时间，存贮环境的条件不同也容易在检测时出现差异。同时，酶联免疫吸附技术由于试剂的特异性，可能对结构相似的化合物产生交叉反应，也不能同时应用于多种组分的检测。(2)免疫胶体金技术免疫胶体金技术(Immunecolloidalgoldtechnique,GICT)是一种免疫标记技术，以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体。胶体金可通过静电作用与抗体非共价结合，形成胶体金示踪标志物，通过抗原-抗体反应与目标抗原相结合，实现病原生物的检测。杜玉萍127]等人利用胶体金免疫层析技术建立了胶体金免疫层析试纸法，利用该方法检测金黄色葡萄球菌可在60min内完成，实验结果显示灵敏度为1×10⁶cfu/mL。刘晶1281等人利用胶体金免疫层析技术研发出方便携带的免疫层析测试卡检测金黄色葡萄球菌的肠毒素α和β,检测灵敏度分别为10ng/mL和1ng/mL,整个检测过程在10min内完成，可以满足现场快速检测的要求。胶体金技术的优势在于检测时间短、成本低廉、无需复杂仪器。但利用该方法检测食源性病原菌灵敏度较低，所制备的多克隆抗体特异性无法保证，容易发生交叉反应。(3)免疫荧光技术免疫荧光技术也叫做荧光抗体法(Immunofluorescencetechnique),已知抗原/抗体采用荧光标记物标记，然后通过标记抗原/抗体与待检样品中的抗体/抗原发生特异性的结合，使得待检样品同时也被荧光物质标记，然后利用特殊的荧光仪器判定荧光位置及强度从而达到定位或者定量检测的目的。免疫荧光技术主要包括两种方法：直接法和间接法。直接法是将荧光物质与已知抗原/抗体来结合测定未知样品。间接法是通过已知抗原/抗体与待检样品发生特异性结合后，经过洗涤，再向结合物中加入被荧光标记的二抗，通过测定已知的一抗的含量间接测定未知样品中待检成分的含量。早在1981年，朱广发29等人经过三年的研究采用免疫荧光抗体技术实现了金黄色葡萄球菌的检测性同位素等标记抗原/抗体，然后将这些标记了的抗原/抗体加入到抗原/抗体的特异性反应体系中与相应的抗体/抗原发生特异性结合，通过检测这些标记物的存在及含量来达到对检测样品中的微量被物质进行定性或定量检测的目的。Khan³0]等将免疫荧光技术与研人员将免疫荧光技术与其他技术相结合发明了抗体-直接表面滤膜荧光技术、微菌落免疫(4)免疫磁性微球技术 (ImmunomagneticBeads,IMB),是表面结合有单克隆抗体的磁性微球。免疫磁性微球技术者进行PCR检验。和酶联免疫吸附相结合的方式，在3h以检测最低限度为10⁵cfu/ml的牛奶样品。刘细霞32]利用金黄色葡萄球菌所特有的SPA(金黄色葡萄球菌A蛋白)可与IgG(免疫球蛋白G)的Fc进行免疫印记分析来检测金黄色葡萄球菌，检测限达到100cfu/ml。虽然免疫磁性微球技术1.3生物学检测方法形成了以核酸分子杂交技术、聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)等(1)核酸分子杂交技术技术。我国从1986年开始相继展开了核酸探针技术的研究工作。目前已成功应用该技术检放射性同位素标记，生物素标记等),然后根据核苷酸分子间的碱基互补配对原则，通过原色葡萄球菌特异性的DNA探针与经过增菌处理的待检样品中的金黄色葡萄球菌的rRNA序列进行杂交，生成RNA:DNA杂交体，然后利用荧光发光仪在450mm处读取其吸收峰，当色葡萄球菌的检出最低限为10cfu/mL,增菌以后食品中的金黄色葡萄球菌鉴定时间仅需半样进行金黄色葡萄球菌的检测，与核酸斑点杂交检测结果的符合率达到100%,检测准确性较(2)聚合酶链式反应(PCR)聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR),是上世纪80年代RaryB.Mullis135]等人发明的体外酶促基因扩增技术，应用常养法具有特异性强、简单快速、灵敏度高的特点。PCR技术通过提取目的DNA,然后进行低温退火适温延伸的反复循环，使目的DNA的数量呈现几何级数的增长，达到迅速扩增目的DNA的效果。然后再对扩增产物进行电泳、染色，扩增的目的DN射下可见，根据不同的DNA带可以鉴定不同的DNA用这种方法可以进行DNA序列分析，色葡萄球菌，结果显示了100%的特异性，随着目标DNA洗涤次数的增加，灵敏度也从53%增加到90%。但是常规PCR具有易受食品复杂基质以及环境影响、靶序列或扩增产物导致多重PCR(multiplexPCR)技术是在常规PCR技术基础上发展起来的新技术，近年来越路和乳制甜品样品中分离出金黄色葡萄球菌和肠毒素。但是多重PCR技术对引物设计的要求非常高，在食品微生物的检测中，多重PCR引物与非靶点序列结合容易导致非特异性扩物学检测中，与传统PCR技术相比，实时荧光定量PCR技术极大地改善和简化了核酸定量检测，所花费时间更短，检测效率更高，交污染风险比如PCR产物呈指数增长、发射光谱重叠、假阴性结果增加等。本研究将使用普通PCR技然而，目前该技术多处于研究阶段，且检测费用昂贵，不利于推广。近几年，基因芯片技术在生命科学领域迅速发展，它是一项基于基因表达和基因功能研究的革命性技术，综合了分子生物学、半导体微电子、激光、化学染料等领域的最新科学技术，把生命科学与信息科学联系在了一起，是当今前沿科学的研究热点41-42]。该技术可以有效的鉴别微生物和转基因成分，为现代社会检测人们所关注的食品安全问题提供了一个新方向。目前基因芯片主要应用在检测食品原料和食品成分方面，对监督食品的卫生、安全和食品质量有着深刻的作用[43-44]。但要想要更广泛的应用基因芯片技术，还需要解决如何建立标准化程序、降低检测费用、简化样品制作和标记操作、进一步提检测特异性等问题。电阻抗法是近年发展起来的一项生物学技术。其原理培养基中的碳水化合物、蛋白质和脂类等大分子电惰性物质，随着细菌的生长被代谢成乳酸盐、醋酸盐等小分子电活性物质，[45]。这些小分子电活性物质可以增加培养基导电性，使培养基的电阻发生变化，通过检测培养基电阻变化情况，就可以判定细菌在培养基中生长繁殖特性，即可以检测出相应的细菌[1]TongS,DavisJS,EichenbergerE,etaPathophysiology,ClinicalManifestations,andManagement[J].ClinicalMicrobioReviews,2015,28(3):603-661.[5]QuiteriaJ,DCid,SanzR,etal.InfluenceofageofthedonorsheepoStaphylococcusaureussubspeciesanaerobiusandResearchinVeterinaryScience,1996,61(3萄球菌PCR-ELISA检测技术建立[J].食品工业科技，2016,[8]A,JindaiFan,etal.PreliminarytreatmentofbovinemastitiscausedbyStaphylococcuswithtrx-SA1,recombinantendolysinofS.aureusbacteriophageIME-SA1Microbiology,2016,191:65-71.[9]MoriY,NagamineK,TomitaN,etal.Detectionofloop-mediatedisothermalreactionbyturbidityderivedfrommagnesiumpyrophosphateformation.[J].BioResCommun,2001,289(1):150-154.[10]刘邦慧.金黄色葡萄球菌Rsp调控毒力基因表达的分子机制[D].中国科学技术大学，2020.[11]汪慧春.面包虾中金黄色葡萄球菌生长预测模型的建立[D].广东海洋大学，2015.[12]李天铭.AraC家族转录调节蛋白Rsp对金黄色葡萄球菌毒力的调节及机制[D].复旦大[13]颜文光.不同来源金黄色葡萄球菌的肠毒素基因分布与SCCmec,spa及MLST分型研究包装与食品机械，2012,3005:40-43.[16]UmedaK,NakamuraH,YamamotoK,etal.MolecularandepidemiologofstaphylococcalfoodborneoutbreakofStaphylococcusaureuselugeneswithoutproductionofclassicalenterotoxins.[fFoodMicrobiology,2017,256:30-35.theGradyMemorialHospitalexperiencewithmethicillin-resistantSaureusbacteremia.[J].AmericanHeartJournal,2004,147(3):536-539.[18]王林会.基于荚膜及外毒素的免疫策略防治金黄色葡萄球菌感染效果研究[D].大连理工[19]TiradoC,S