Chaetocin、（+）-JQ1协同CDDP逆转骨肉瘤细胞耐药进程

1前言骨肉瘤（OS，osteosarcoma）是一种严重危害青少年、老龄人的原发性恶性肿瘤，癌症逐渐取代了传染病的地位，成为当下危害生命健康的主要威胁。发展中的医疗技术正在逐步攻克这一难症，如分子靶向治疗、免疫治疗、基因治疗、新辅助化疗，目前临床上多采用手术切除为主，药物化疗相辅的综合治疗模式，并成功将患者5年生存率提升至60~70%，但发生了肿瘤转移的患者，其5年生存率仅有20%[1]。目前新辅助化疗处于一个难以提高患者生存率的瓶颈期，亟需寻找新的治疗方案。临床骨肉瘤治疗常用化疗药物主要有阿霉素（ADM）、顺铂（DDP）、大剂量甲氨蝶呤（HD-MTX）和异环磷酰胺（IFO），然而从上世纪90年代起，骨肉瘤的化疗一直受限于药物品种少，方法单一、毒副作用大等问题而停滞不前，鉴于此，改善细胞对药物的敏感性，减轻化疗药物毒副作用，就显得尤为重要。在治疗人体骨肉瘤的各种方法中，局部根治性切除手术和辅助化学治疗相配合的综合治疗是目前治疗效果最为显著的，化学治疗是综合治疗的重要组成部分，更有效的治疗效果和更小的副作用将会是骨肉瘤治疗研究和探索的热点[2]。本课题通过前期对大量化合物的筛选，筛选出有效抑制骨肉瘤细胞增殖的两种化合物----Chaetocin和（+）-JQ1BromodomainInhibitor。查阅相关文献得知，Chaetocin是一种天然的真菌代谢物，在实体瘤中具有强大的增殖抑制活性[3]，有研究表明Chaetocin可通过诱导LC3-II、caspase-3表达的增加，进而影响细胞自噬和凋亡进程，影响人体肝癌细胞[4]，是一种理想的临床治疗药物。近年来，BET抑制剂在白血病、癌症、自身免疫性疾病的功效受到重视，（+）-JQ1是其中一种BET蛋白抑制剂，通过干扰BRD4功能，可导致细胞周期停滞和凋亡的促进，并对肿瘤细胞活性产生巨大影响[5]。PD-L1在癌症治疗中常作为一个重要的靶点[5]，有实验通过（+）-JQ1对前列腺癌、肝癌和肺癌细胞系的研究发现，（+）-JQ1对PD-L1存在抑制效果，并有成为肿瘤治疗药物的潜力[6]。通过把前期实验数据与相关文献对比后，我们认为这两种化合物有成为骨肉瘤治疗药物的潜力，下文中会对Chaetocin和（+）-JQ1在骨肉瘤细胞的治疗效果进行描述，并进一步探讨这两个化合物在骨肉瘤细胞中的作用机制，为骨肉瘤化疗提供新方案与新机遇。2实验部分2.1仪器和试剂2.1.1实验仪器实验仪器对应厂家二氧化碳细胞培养箱立新仪器有限公司超净工作台ThermoFormaPCR仪EppendorfReal-timePCR仪Eppendorf酶标仪ThermoFisher普通倒置显微镜舜宇离心机Eppendorf2.1.2细胞株小鼠骨肉瘤细胞K7M2WT、人成骨肉瘤细胞MG63均购自中科院上海细胞所。2.1.3药物Chaetocin和（+）-JQ1BromodomainInhibitor购自Sigma公司，顺铂购自R&D公司。2.1.4主要试剂2.1.4.1细胞培养试剂DMEM高糖细胞培养基购自Hyclone公司、胎牛血清（FBS）购自浙江省杭州市四季青生物工程材料有限公司。2.1.4.2SRB相关试剂10%TCA、Tris碱、冰醋酸和SRB染料（以1%醋酸配置）购自上海迈瑞尔化学技术有限公司。2.1.4.3Realtime-PCR相关试剂RNA抽提试剂Trizol、核糖核苷酸混合（DNTP）、RNA酶抑制剂、随机引物、逆转录酶、SYBRGreen反应试剂盒购自杭州禹扬生物科技有限公司。2.2实验方法2.2.1细胞培养小鼠骨肉瘤细胞K7M2、人成骨肉瘤细胞MG63培养采用10%FBS血清、90%高糖型DMEM培养基。细胞均置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。2.2.2有效化合物筛选1).细胞种板：把处于对数期生长的K7M2、MG63细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液加入96孔板中，每孔200μl、3000cells细胞。2).96孔板给药：种板后24h对96孔板中细胞给予1μl药物，药物以250nM、125nM、62.5nM的浓度梯度稀释，检测药物对细胞在不同浓度下的抑制率，各浓度均采用3孔为复孔，同时加2μM和1μM的CDDP（2μM为孔内终浓度）作为药物的药效对照组。给药完毕后将96孔板置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。3).SRB法：药物作用72h后，取出96孔板，弃去孔内液体，每孔加入100μl4℃预冷的10%TCA溶液固定细胞，静置5min后放入4℃冰箱中固定1h，用纯化水冲洗5遍，烘干后每孔加入4mg/mlSRB染料（以1%醋酸配制）50μl，染色20min后，以1%醋酸清洗5遍，烘干后每孔加入100μl10mM的Tris碱，轻轻振荡至晶体完全溶解。4).吸光度检测：使用酶标仪在517nm波长下检测各孔药物作用后的吸光度。抑制率=（A517cotrol-A517treated）/A517control2.2.3单克隆形成1).细胞种板：把对指数生长期的K7M2、MG63细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液加入6孔板中，每孔2ml、5×104cell细胞。2).6孔板给药：种板次日，6孔板设置为对照组、125nM药物单用组、药物联用组联用、1μMCDDP组进行给药，每孔加的药物剂量为2μL，给药完毕后将6孔板放于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。3).换液、给药：给药后24h把孔内的培养液吸出，再加入10%FBS+90%DMEM共2ml，并加入与上次相同的药物浓度、剂量，处理完毕后将6孔板放于培养箱中。4).收板：种板后的第七日，弃去培养液，每孔加入XmL甲醛固定细胞，振荡摇20min，固定细胞后用纯化水洗净，置于空气或烘箱37℃彻底干燥；再加入1mL0.1%的结晶紫溶液对细胞染色，振摇30min，用PBS清洗，至多余的结晶紫溶液冲洗干净，烘干。2.2.4Real-timePCR检测1).Trizol提取总RNA：培养皿中加入1ml的Trizol试剂充分裂解细胞，用RNase-free的EP管收集，反复吹打至溶液透明。加入200μL氯仿，剧烈振荡30s，并于冰上放置2~3min，12000rpm，4℃离心10min；吸取上清液，加入同比例的异丙醇，微微晃动，冰上放10min，4℃，12000rpm离心10min；小心吸走上清液，底部沉淀加入1ml75%乙醇轻微涡旋洗涤，4℃7600rpm，离心5min，重复两遍，弃去上清液，于室温下挥干，所得RNA沉淀加入适量0.1%DEPC水溶解。采用核酸蛋白测定仪检测总RNA的浓度，同时A260/A280比值确定总RNA纯度，直接进行后续相关试验或保存至-80℃冰箱中备用。2).逆转录为cDNA：根据RNA浓度，取定量RNA2μg（xμL）、DEPC（7-xμL），2×TSReactionMix10uL、gDNARemover1μL、总反应体系为20μL，轻轻混匀并离心至排管底部以42℃孵育30min，85℃加热5min失活程序逆转录成cDNA。3).实时荧光定量PCR：将所得cDNA加至PCR反应体系中扩增目标片段，PCR反映体系为20μL（10μM目标上游引物和下游引物各0.6μL，0.1%DEPC水8.2μL，模板cDNA0.6μL，2×QuantiTectSYBRGreenPCRMasterMix10μL）。PCR反应条件为95℃预变性15min后，94℃变性30s，X℃退火30s（X为退火温度），72℃延伸30s，40个循环。最后一次循环后做溶解曲线，并采用ACTIN做标准曲线作为参考值。查阅相关文献设计的引物序列如下：Bcl2：Forward：GAGCAGGTGCCTACAAGAAA(Sense)Reverse：CTTTGTCCTCTGACTGGGTATG(AntiSense) Bax：Forward：GTGGTTGCCCTCTTCTACTTT(Sense)Reverse：CAGCCCATGATGGTTCTGAT(AntiSense)ABCC1：Forward：GGTACCTGTGCTGGTGAATAA(Sense)Reverse：TAGGCTTGCTGGGATCTTTG(AntiSense)ABCB1：Forward：TGCTGGTTGCTGCTTACA(Sense)Reverse：GCCTATCTCCTGTCGCATTATAG(AntiSense)ABCG2：Forward：GATGAACTCCAGAGCCGTTAG(Sense) Reverse：CGGACTAGAAACCCACTCTTTAC(AntiSense)2.2.6数据分析实验至少重复三次，数据表示为¯x±SD，并查阅相关文献检查数据出入。3实验结果3.1筛选得到可以协同CDDP抑制骨肉瘤细胞增殖的化合物（+）-JQ1与Chaetocin首先我们对化合物进行药效的筛选，采用SRB法，取适当数量的K7M2细胞制成悬液，并将适宜密度的细胞接种于96孔板中，种板后24h给予梯度稀释的化合物（浓度125nM、62.5nM）与CDPP（浓度1μM），并分空白对照组、CDDP单用组、化合物单用组、联合用药组，药物作用72h后收板，使用SRB法检测每孔的吸光度，并按照（A517cotrol-A517treated）/A517control计算化合物的抑制率。最终筛选出效果明显的（+）-JQ1与Chaetocin，抑制率柱状图如图1.A/B，从图中可观察到联用组有显著的抑制细胞增殖效果，初步证明了（+）-JQ1/Chaetocin协同CDDP治疗骨肉瘤细胞的可行性。图1.（+）-JQ1/Chaetocin协同顺铂抑制骨肉瘤细胞增殖A.K7M2细胞给予1μMCDDP、62.5nM（+）-JQ1、125nM（+）-JQ1、1μMCDDP与62.5nM（+）-JQ1、1μMCDDP与125nM（+）-JQ1，并采用SRB法计算抑制率。B.K7M2细胞给予1μMCDDP、62.5nMCHAE、125nMCHAE、1μMCDDP与62.5nMCHAE、1μMCDDP与125nMCHAE，并采用SRB法计算抑制率。3.2体外实验显示（+）-JQ1/Chaetocin可以协同CDDP抑制骨肉瘤细胞克隆形成在筛选出有疗效的（+）-JQ1/Chaetocin后，通过把处于对数期生长的K7M2细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液加入6孔板中的培养，种板24h后给予CDDP（1μM）、化合物（125nM）进行化合物体外抗肿瘤活性，在给药后72h拍摄孔内细胞状态，并更换培养液与上次相同剂量浓度的药物，种板后的第7日收板并用结晶紫染色。结果显示（图2.A/B）在首次给药后的第三天可观察到药物单用组、联合用药组的细胞密度少于对照组，在第7日收板并用结晶紫染色后，明显观察的到（+）-JQ1/Chaetocin、CDDP单用组的细胞密度相对较低，而联用组则有明显的细胞密度减少，上述结果表明（+）-JQ1/Chaetocin协同CDDP有着良好体外抗肿瘤活性，证明该联用方案的可行性，并能进行下一步联用方案对骨肉瘤细胞内基因水平影响的探究。图2.Chaetocin、（+）-JQ1的增殖抑制效果A.骨肉瘤K7M2细胞分组为对照组、1μMCDDP、125nM（+）-JQ1、1μMCDDP+125nM（+）-JQ1的增殖抑制效果（从左到右）。B.骨肉瘤K7M2细胞分组为对照组、1μMCDDP、125nMChaetocin、1μMCDDP+125nMChaetocin的增殖抑制效果。C.对照组、1μMCDDP、125nM（+）-JQ1、1μMCDDP+125nM（+）-JQ1结晶紫染色后的增殖抑制效果。D.对照组、1μMCDDP、125nMChaetocin、1μMCDDP+125nMChaetocin结晶紫染色后的增殖抑制效果。3.3Chaetocin、（+）-JQ1协同CDDP促进骨肉瘤细胞凋亡进程体外抗肿瘤活性检测完成后，需要进一步探究化合物对细胞内的作用机制，查阅文献得知，通过抑制Blc2基因表达[7]与促进BAX基因表达[8,9]，可促进骨肉瘤细胞的凋亡进程。我们采用RT-PCR技术检测（+）-JQ1/Chaetocin与CDDP联用后的细胞内基因的转录情况。将K7M2细胞传代于6孔板中培养，在传代后的24h后，更换培养基，并设置CDDP（1μM）组、CDDP+（+）-JQ1/Chaetocin组（CDDP1μM,（+）-JQ1/Chaetocin125nM），在给药后的0、3、5、7天检测细胞内Blc2、BAX凋亡基因水平变化。结果显示（图3.A/B）联合用药组Bcl2基因转录情况与药物作用时间呈反比，且联合用药组对Bcl2转录的抑制效果强于CDDP单用；联合用药组而BAX基因的增长趋势与CDDP单用相比更快。上述的结果表明了（+）-JQ1/Chaetocin协同CDDP可促进骨肉瘤细胞的凋亡进程。图3.Chaetocin、（+）-JQ1对凋亡基因的影响A.骨肉瘤K7M2细胞加入1μMCDDP、1μMCDDP+125nMChaetocin后，采用RT-PCR技术检测到的细胞内耐药基因ABCB1、ABCC1、ABCG2的水平。B.骨肉瘤K7M2细胞加入1μMCDDP、1μMCDDP+125nM（+）-JQ1后，采用RT-PCR技术检测到的细胞内耐药基因ABCB1、ABCC1、ABCG2的水平。3.4Chaetocin、（+）-JQ1协同CDDP逆转骨肉瘤细胞耐药进程临床治疗中肿瘤细胞对药物的敏感性会逐渐降低，为此需要逐步增加剂量，这样的一个恶性循环不仅影响了治疗效果，更会对患者的身体产生毒害。在检验凋亡基因的同时，我们还对细胞内耐药基因（ABCB1、ABCC1、ABCG2）的转录水平做了检测。结果显示（图3.A/B）CDDP的单用促进了耐药基因的转录，+）-JQ1/Chaetocin的单用对耐药基因几乎不产生影响，而当（+）-JQ1/Chaetocin协同CDDP作用后，细胞内耐药基因转录水平产生了逆转。上述结果表明在（+）-JQ1/Chaetocin协同CDDP可以通过降低耐药基因的转录，进而减少骨肉瘤细胞耐药的发生。图4.Chaetocin、（+）-JQ1对耐药基因的影响A.骨肉瘤K7M2细胞加入1μMCDDP、1μMCDDP+125nM（+）-JQ1后，采用RT-PCR技术检测到的细胞内耐药基因ABCB1、ABCC1、ABCG2的水平。B.骨肉瘤K7M2细胞加入1μMCDDP、1μMCDDP+125nMChaetocin后，采用RT-PCR技术检测到的细胞内耐药基因ABCB1、ABCC1、ABCG2的水平。4结论临床上受限于诸多因素，如肺转移[11]与治疗药物的耐药或严重的毒副作用[12]，骨肉瘤进展的控制变得尤为困难，患者往往被迫终止或改变治疗方案，如何有效的改善肿瘤转移与耐药问题，是进一步提升患者生存率的关键。本实验通过体外实验，证明了Chaetocin、（+）-JQ1协同CDDP对骨肉瘤细胞具有增殖抑制效果，其通过影响细胞内的凋亡基因Bcl2、BAX，促进骨肉瘤细胞的凋亡进程，并降低耐药基因ABCB1、ABCC1、ABCG2的转录水平，产生逆转肿瘤耐药进程的效果，增加骨肉瘤细胞对药物的敏感性。在知网、万方、PubMed数据库检索后，发现这两种化合物在其他癌症的体外实验中也表现出良好的抗肿瘤活性，揭示了Chaetocin、（+）-JQ1可能具有成为临床治疗药物的潜力，但考虑到现阶段Chaetocin、（+）-JQ1治疗骨肉瘤的有效性和安全性，以及合适的化疗方案和剂量，还需要更多的临床试验与相关数