T∕FPSHS 021-2025 番茄抗细菌性青枯病室内鉴定技术规程

PAGEPAGE1ICS 65.020.20CCS B31团 体 标 准T/FPSHS021-2025番茄抗细菌性青枯病室内鉴定技术规程Technicalcodeofpracticeforgreenhouseevaluationoftomatoresistancetobacterialwiltdisease2025-12-25发布 2025-12-26实施福建省园艺学会 发布目次前 言 3范围 4规性用件 4术和义 4鉴程序 4接体备 5器备 5原分与定 5悬的备 6室抗鉴定 6定计 6定照料 6茄叶幼接种 6茄花幼接种 7病调查 7茄叶幼接病情查 7茄花幼接病情查 8定料处理 9性价 9附 录 A 1附 录 B 5附 录 C 6前 言本文照GB/T1.1-2020标化作则 第1分准文的构草规》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由福建省农业科学院植物保护研究所提出，由福建省园艺学会归口。本文件起草单位：福建省农业科学院植物保护研究所，福建省农业科学院作物研究所，南京农业大学植物保护学院，厦门如意种苗高科技股份有限公司，淮阴工学院，平潭县好收成农民专业合作社。本文件主要起草人：王荣波，朱海生，刘裴清，张前荣，牛冬冬，李本金，王云鹏，余知雨，冀婷婷，池仁曼，刘守成。番茄抗细菌性青枯病室内鉴定技术规程范围本文件规定了番茄抗细菌性青枯病室内鉴定技术程序。本文件适用于番茄野生种、地方种、商品种、品系及遗传材料等对细菌性青枯病的室内抗性鉴定及评价。下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T2118蔬菜育苗基质3.1番茄细菌性青枯病bacterialwiltoftomato由茄科劳尔氏菌[Ralstoniasolancearum(Smith)Yabuuchietal.]侵染茄科植物而引起的一种土传细菌病害。发病初期叶色正常，主茎和侧枝部分叶片呈现暗绿色脱水状；发病后期主茎顶叶向下逐渐萎蔫，根部腐烂发黑，剖开维管束为褐色，其茎部横切后插入清水中，可见乳白色细菌液溢出。3.2病原物分离pathogenicisolate采用人工方法从植株发病部位或病株根际土壤中分离获得病原物的纯培养物。3.3序列变种sequevars基于内源葡聚糖酶基因（endoglucanasegene，egl）的序列相似性来划分的青枯菌类群。3.4番茄子叶期幼苗cotyledon-stagetomatoseedling指番茄种子萌发后到其子叶完全展开，但真叶尚未形成的番茄植株。鉴定程序见图1。图1番茄抗细菌性青枯病室内鉴定程序示意图PCR403~30~60s，用2倍3TTC3048。称取10100mL30150rpm12min1mL9mL10-4~10-8TTC3048h。从TTCAU759-F/AU760-RFeganand进行PCR表1青枯菌鉴定特异性物引物名称引物序列（5’-3’）目的片段长度/bp退火温度AU759-FAU760-RGTCGCCGTCAACTCACTTTCCGTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG28158℃对用于抗性鉴定接种的病原分离物进行遗传多样性分析，包括生理小种、演化型、生化型和序列变种的鉴定，鉴定方法见附录A。选择福建省当地优势序列变种青枯菌菌株作为抗性鉴定接种菌株，以下接种体准备试验需要在超净工作台或达到相当无菌环境要求下开展。用无菌接种环蘸取保存在30%甘油中的青枯菌在TTC固体培养基平板上划线，置于30℃48CPG30℃、150rpm24。600nmCFU/mL（OD600nm1.0）1鉴定材料随机排列或顺序排列，每份鉴定材料重复3次，每个重复15株苗。Ailsa55℃15min300mg/L10%531/2MS±200~300μmol/m²·s16h/夜8将待测番茄幼苗转移至MS培养基平板上缓苗48h，于番茄幼苗根茎交界处接种10μL菌悬液（108CFU/mL），静置24h后平板竖立培养。将处理后番茄幼苗移入光照培养箱，温度：28±2℃，相对湿度（RH）>65%，光照：200~300μmol/m²·s，光周期：昼16h/夜8h。55℃15min300mg/L28℃NY/T2118（121℃，25min）5~91cm15mL（108CFU/mL）。将处理后番茄幼苗移入温室，温度：28±2℃，相对湿度（RH）>65%，光照强度：300~550μmol/m²·s，光周期：昼16h/夜8h，常规栽培管理。7病情调查接种病原菌5~7d后调查病情。表2 番子期苗病病级的分病情级别 症状描述3 3/45 1/2~3/41/4）7 1/21/2（）9 调查每份鉴定材料接种植株发病情况，根据病害症状描述，逐株调查病情级别，并统计出病情指数（DI）。病情指数计算公式（1）如下：∑（s×n）DI=———————×100 (1)N×S式中：∑——各病情级别数值与各病情级别植株数乘积的总和；s——各病情级别数值；n——各病情级别病株数；N——调查总株数；S——最高病情级别数值。依据鉴定材料3次重复的病情指数（DI）平均值确定其抗性水平，划分标准见表3。表3番茄子叶期幼苗对青枯病抗性的评价标准病情数（DI） 抗性价DI0 0<DI20 高抗（HR）20<DI40 抗病（R）40<DI60 中抗（MR）60<DI80 感病（S）DI80 高感（HS）当感病对照材料的病情指数大于等于60（DI≥60）时，该批次抗性鉴定判定为有效。如果抗性鉴定三次重复出现差异，以较高发病级别指标优先确定；如果评价级别相差两级以上（含两个级别）则需要对该品种做重复抗性鉴定。接种病原菌后10~14d调查发病情况。病情级别及其相对应的症状描述（见表4）。表4番茄初花期幼苗接种病情级别的划分病情级别症状描述0整株无症状1植株25%以下叶片萎蔫2植株25%~50%片叶萎蔫3植株50%~75%叶片萎蔫4整株75%以上叶片萎蔫或植株枯死7.2.3逐株调查枯萎叶片数量占全部可统计叶片数量的比例，根据枯萎叶片比例确定病情级别（表4），并计算病情指数（DI），病情级别的划分以及计算公式如下。病情指数（DI）按下列公式（1）计算：∑（s×n）DI=———————×100 (1)N×S式中：∑——各病情级别数值与各病情级别植株数乘积的总和；s——各病情级别数值；n——各病情级别病株数；N——调查总株数；S——最高病情级别数值。依据鉴定材料3次重复的病情指数（DI）平均值确定其抗性水平，抗性标准划分见表5。表5番茄初花期幼苗抗青枯病鉴定的评价标准病情数（DI） 抗性价DI0 0<DI12.5 高抗（HR）12.5<DI25 抗病（R）25<DI50 中抗（MR）50<DI75 感病（S）DI75 高感（HS）当感病对照材料的病情指数大于等于50（DI≥50）时，该批次抗性鉴定判定为有效。如果抗性鉴定三次重复出现差异，以较高发病级别指标优先确定；如果评价级别相差两级以上（含两个级别）则需要对该品种做重复抗性鉴定。鉴定完毕后将番茄植株、残体及栽培基质集中进行无害化处理。1包括）番茄子叶期幼苗接种按照附录B填写鉴定表格；番茄初花期幼苗接种按照附录C11参考文献Buddenhagen,I.1962.DesignationofracesinPseudomonassolanacearum.Phytopathology52:726.Fegan,M.,andPrior,P.2005.HowcomplexistheRalstoniasolanacearumspeciescomplex.BacterialwiltdiseaseandtheRalstoniasolanacearumspeciescomplex1:449-461.Hayward,A.1964.CharacteristicsofPseudomonassolanacearum.JournalofAppliedBacteriology27:265-277.王荣波,,等.[J].园,2024,51(11):2540-2554.附 录 A（规范性）番茄青枯病病原菌基本信息及其遗传多样性A.1病原菌基本信息A.1.1学名茄科劳尔氏菌[Ralstoniasolancearum(Smith)Yabuuchietal.]A.1.2分类地位该菌属于变形菌门（Proteobacteria）、伯克氏菌科（Burrkholderiaceae）、劳尔氏菌属（Ralstonia）。A.1.3形态特征茄科劳尔氏菌是一种好氧性革兰氏阴性菌，为变形菌。菌体呈短杆状，长度一般为0.5~1.51~3pH6.6pH4~830~35TTC图A.1茄科劳尔氏菌的形态特征A.2青枯菌遗传多样性分析A.2.1培养基的制备CPG5.0g1.0g10.0g1000LH7100L250L2%121（±1）℃20minTTC培养基：2,3,5–氯化三苯基四氮唑（TTC）溶于无菌水中，使其终浓度为0.5%，用0.22μm4NA50℃左100mL1mL0.5%TTCTTC1/2MS2.215gMS30g1MKOHPAGEPAGE2调节H至5.70001.75g1215。A.2.2DNA提取CPGCPG液30℃、150rpm24h1mL菌液采用细菌基因组DNADNADNA-20A.2.3青枯菌生理小种鉴定A.2.3.1采用的鉴别寄主用于鉴别菌株生理小种的寄主有：烟草、茄子、番茄、花生、香蕉、马铃薯。A.2.3.2生理小种鉴定10cm100μL（10820mL（108CFU/mL），20mL28±80%15（见表A.1）。茄子马铃薯茄子马铃薯番茄花生香蕉1＋＋＋＋－2－－－－＋3－＋＋－－

表A.1青枯菌生理小种划分标准寄主植物注1：“＋”代表能侵染，“－”代表不能侵染。注2：生理小种按Buddenhagen等（1962）的分类法划分。A.2.4青枯菌生化型鉴定3（）3（）（见表A.2）。表A.2青枯菌生化变种的划分标准生化变种乳糖麦芽糖纤维二糖甘露醇山梨醇甜醇Ⅰ－－－－－－Ⅱ＋＋＋－－－Ⅲ＋＋＋＋＋＋Ⅲ-1＋＋＋＋＋－Ⅲ-2＋－＋＋＋－Ⅳ－－－＋＋＋Ⅴ＋＋＋＋－－注1：“＋”代表能利用，“－”代表不能利用。注2：生化型按Hayward等（1964）的分类法划分。A.2.5青枯菌演化型鉴定PCR25μL：2×MasterMix12.5AU759-F/AU760-R1Nmult21:1FNmult21:2FNmult和Nmult22:InF0.251μLPCR95℃53090s，72℃30s，3072℃10minGMI1000（Ⅰ）Po41（Ⅱ）DNAPCR1.2%（A.3）。表A.3青枯菌演化型鉴定特异性引物演化型Phylotype引物名称引物序列（5’-3’）片段大小/bp演化型ⅠNmult21:1FCGTTGATGAGGCGCGCAATTT144演化型ⅡNmult21:2FAAGTTATGGACGGTGGAAGTC372演化型ⅢNmult23:AFATTACAGAGCAATCGAAAGATT91演化型ⅣNmult22:InFATTGCCAAGACGAGAGAAGTA213Nmult22:RRTCGCTTGACCCTATAACGAGTAA.2.6青枯菌序列变种鉴定EnGTCTTCC）PCR25μL，2×MasterMix12.5μL1μL，1μLDNAddH2OPCR95℃3min；95℃15s，60℃60s，72℃48s，3072℃5minGenBank4A.4表A.4基于egl序列的系统发育分析中使用的部分青枯菌参考菌株参考菌株寄主来源演化型序列变种GenBank登录号R288桑树中国Ⅰ12GQ907153JT523马铃薯留尼汪岛Ⅰ13AF295252PSS81番茄中国Ⅰ14FJ561066PSS358番茄中国Ⅰ15EU407298UW151姜澳大利亚Ⅰ16AF295254P11花生中国Ⅰ17FJ561068GMI1000番茄法国Ⅰ18AF295251JT519天竺葵留尼汪岛Ⅰ31GU295032PSS219番茄中国Ⅰ34FJ561167O3橄榄树中国Ⅰ44FJ561069Tb28烟草中国Ⅰ44FJ561127Tb43烟草中国Ⅰ44FJ561129Bd11木槿中国Ⅰ44FJ561098CIP365马铃薯菲律宾Ⅰ45GQ907151MAD17辣椒马达加斯加Ⅰ46GU295040GMI8254番茄印度尼西亚Ⅰ47GU295014M2桑树中国Ⅰ48FJ561067CMR87番茄喀麦隆Ⅱ35EF439727CMR121番茄喀麦隆Ⅱ52EF43972