【《维生素C的检测方法研究国内外文献综述》7300字】

维生素C的检测方法研究国内外文献综述目录TOC\o"1-3"\h\u2094维生素C的检测方法研究国内外文献综述 1283711.1滴定法 1133181.2电化学法 1176541.3色谱法 2196421.4荧光检测法 2125781.5比色法 2Vc是一种很容易被氧化的不稳定物质，加热、金属离子的存在都会加速Vc的氧化，因此，测定新鲜水果和蔬菜中的Vc含量对于人类膳食指导尤为重要。1.1滴定法滴定法包括氧化还原滴定法和电位滴定法。氧化还原滴定法包括碘量法和2,6-二氯靛酚滴定法。碘量法是通过添加的碘与具有强还原性的Vc发生氧化还原反应，当碘液过量时指示剂淀粉与之发生反应产生蓝色即到达滴定终点，通过计算碘标准液用量间接测定Vc含量（GB5009.86-2016）；后者则是是在酸性溶液中还原2,6-二氯靛酚染料，通过计算染料用量间接测定Vc含量。该方法测定结果比较准确，但在测定时对于滴定终点的判断存在较大试验误差，样品的碱度也会影响测定结果。且果蔬或生物材料中存在单宁、甜菜碱和巯基化合物等易被染料氧化的物质，仅适用于脱氢抗坏血酸浓度可忽略不计的情况，这些缺陷限制了该方法在食品领域的广泛应用。电位滴定法是通过测量电位的变化来确定滴定终点，其对溶液的浑浊度和颜色抗干扰性良好。陈秋丽等采用该方法测定了9种果蔬样品中的Vc含量，试验结果显示回收率在80-120%之间，且变异系数小，但此方法耗时、烦琐（陈秋丽等2004）。两点电位滴定法在测定过程中只需记录2次数据，因此在一定程度上克服了传统电位滴定法的不足。陈志慧分别采用两点滴定法与传统的电位滴定法测定了荔枝中Vc的含量，结果表明两种方法相对误差仅为0.1%（陈志慧2006），可见两种方法具有相同的准确度。1.2电化学法电化学分析法是在电化学池中发生的电化学反应，电化学池是由两个电极和电解质溶液组成，而且两电极用外电路接通（杨玲2015）。相比于传统检测法，该法在检测Vc时直接利用电信号的变化实现Vc氧化还原，该法易自动控制、仪器设备自动化且简单，目前已被广泛应用于水果、蔬菜中Vc的快速检测。根据所测量电学量的不同，主要分为毛细管电泳法，电导分析法，电位/库仑滴定法，极谱分析法，伏安法（左春艳2012）。其中伏安法是最常见的测定Vc含量的电化学分析法，可以通过修饰电极的策略提高方法的选择性和灵敏性。然而，Vc在金属电极或玻碳电极上的过电位较大，其氧化产物吸附在电极表面后容易污染电极，从而降低电极灵敏度。1.3色谱法色谱法被公认为是一种具有高灵敏度和高选择性的检测方法，能够简便地确定被分析物含量。色谱法中的液相色谱法（HPLC）因操作自动化、分析结果可靠等优点广泛用于分析复杂基质中的检测物。在测定果蔬中Vc的过程中，Vc的提取环节异常重要，Vc在碱性条件下容易被氧化，故需要选择合适的提取溶剂以确保果蔬样品的稳定性，如高离子强度酸性提取溶剂，可通过破碎细胞和沉淀蛋白质抑制代谢活性。由于偏磷酸可以防止Vc的氧化，也被用作Vc的提取保护剂，草酸也被用来提取Vc，且草酸的价格较偏磷酸便宜、低毒。另外，HPLC测定Vc时耗时较长，可能会导致测量值低于实际值，而且由于设备原因不适合用于现场检测，为此开发一种灵敏、快速、适于现场检测的Vc分析方法是必要的。1.4荧光检测法荧光检测法是利用物质的荧光特性进行定性或定量分析的一种方法。在测定Vc含量的方法中，荧光分析法因其对样品低要求、低成本和高效率而备受关注，其中碳纳米材料已被证实可用于构建荧光传感器。Lu等人设计了一种基于靶点引发的解离的猝灭剂策略，用于荧光检测Vc，SiNPs的荧光可以通过表面能转移和内部滤光效应过程被羟基氧化钴纳米颗粒（CoOOHNPs）淬灭，维生素C可以通过与CoOOHNPs反应生成Co2+导致CoOOHNPs分解，在此过程中SiNPs的蓝色荧光恢复，为测定复杂食品基质中的Vc提供了一种新颖实用的方法（Luetal.2019）。然而，大多数此类荧光传感器都包含有毒金属离子或有机试剂，这些物质对环境和食品安全都是有害的，因此，开发一种检测食品中Vc的有效环保型荧光传感器的仍然迫在眉睫。1.5比色法该法以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液色度差来确定待测组分含量。该法因直观、低成本、无需大型仪器设备和可实现直接现场检测等优点而备受人们关注。Yao等人利用具有有效的内源过氧化物酶性质的氨基功能化铜金属有机骨架纳米粒子（Cu-BDC-NH2NPs）提出了一种快速、灵敏的抗坏血酸（AA）的比色分析策略，如图1-2所示，Cu-BDC-NH2NPs催化H2O2氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine,TMB）生成蓝色的氧化态TMB（oxTMB）。AA可以减少ox-TMB的生成，导致生成的蓝色明显退色以及吸光度的减小。结果表明该比色方法具有在0.5-60μmol/L的检测范围内具有较低的检测限，为0.15μmol/L。除此之外，Cu-BDC-NH2NPs传感系统还可以成功应用于比色检测人血清、食品和制药样本中的AA，为检测AA提供高选择性、灵敏的光学传感系统、开发具有模拟酶活性的金属有机骨架纳米颗粒在比色生物传感中的广泛应用提供新的平台（Yaoetal.2019a）。图1-2（A）存在不同浓度AA时溶液体系的照片（AA从左到右的浓度分别为0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mmol/L）（B）不同浓度AA存在时的紫外吸收光谱（C）ΔA与AA浓度的关系图（插图：检测AA的线性校准图）（Yaoetal.2019a）Fig.1-2(A)PhotographsofthesolutionsystemsintheabsenceandpresenceofdifferentconcentrationsofAA.(ConcentrationsofAAfromlefttorightare0,5,10,20,30,40,50,60,70,80,90and100mM,respectively.)(B)UV-visabsorptionspectraoftheproposedsysteminthepresenceofdifferentconcentrationsofAA.(C)RelationshipofDAandtheconcentrationofAA.(Inset:thelinearcalibrationplotfordetectionofAA)（Yaoetal.2019a）比色法是基于颜色变化的原位视觉观测，不需要借助复杂的仪器，因此在现场快速检测领域具有潜在的应用价值。目前各种纳米材料已广泛应用于Vc检测以及其他各种目标分子的比色检测，特别是基于酶的纳米材料的传感器已经成为一个相当重要的比色平台（Huangetal.2019a）。酶是具有高催化特异性和反应活性的一种生物催化剂，因其催化特异性、效率高、环境友好等特性广泛应用于比色法中。天然酶是一类高效的生物催化剂，主要由蛋白质组成，少数是RNA分子。天然酶具有高催化活性、底物特异性和反应条件温和等特性，在传感、生物医学、农业科学和食品加工等领域有着广泛应用（Huangetal.2019b）。然而，天然酶催化活性不稳定、制备和纯化工艺复杂、回收困难、价格高昂以及难以满足现在工业的需求等，这些缺陷限制了它们的进一步应用。因而，开发具有强稳定性、低成本及制备简单等优点的模拟酶来满足现代工业需求必将成为趋势。模拟酶是一种人工合成的具有类天然酶活性的催化剂材料，不仅具有天然酶高效的催化性活性，还能克服天然酶稳定性差的缺点。目前，模拟酶的研究已取得很多成果，开发出了大量新型高效的模拟酶，如卟啉、血红素、血红蛋白、蛋白质、树枝状分子、超分子等（Songetal.2019b）。传统的模拟酶主要从天然酶的金属离子、活性中心结构、整体模型三个方向模拟，其具有价格便宜、热稳定性好以及耐酸碱等优点。但仍存在一些犹如催化效率低、催化活性位点单一、难重复利用等缺陷，因此发展一种具有高活性、稳定性强且易制备的新型模拟酶成为人们研究的热点问题。纳米技术的发展为上述问题提供了思路，其具有的独特理化性质不仅赋予纳米酶多样化的功能，还为有针对性的设计材料以及潜在的应用领域创造了条件。纳米酶这一专业术语是Manea等人在2004年提出来的，特指具有出色类酶活性的纳米材料，用于描述由三氮杂环环烷图1-3近年来纳米酶应用于生物传感、环境处理、抗菌、癌症治疗和细胞保护等领域（Wuetal.2019）Fig.1-3Inrecentyears,nanoenzymeshavebeenusedinbiosensorsforenvironmentaltreatmentofantimicrobialcancertherapyandcellprotection.（Wuetal.2019）官能化硫醇自组装到金纳米颗粒表面上形成的基于金纳米颗粒的转磷酸化作用模拟物（Maneaetal.2004）。2007年，Gao等第一次提出磁性纳米颗粒可以用来模拟辣根过氧化物酶的催化（Gaoetal.2007）。2013年，WeiandWang论述了具体关于纳米酶的定义，既具有类酶活性的纳米材料（WeiandWang2013）。到目前为止，如图1-3所示，研究人员开发出大量具有各种类酶活性的纳米材料应用于生物传感、环境处理、抗菌、癌症治疗及细胞保护等领域中（Huetal.2017;Muetal.2019;Sangetal.2019;Fanetal.2018;Sohetal.2017;Wuetal.2019），对提高人类生命质量以及改善自然环境做出巨大贡献。各种各样的纳米材料被报道出具有类酶活性，主要包括层状双金属氢氧化物纳米材料、碳基纳米材料、金属纳米材料及金属氧化物纳米材料。（1）层状双金属氢氧化物纳米酶层状双金属氢氧化物（Layereddoublehydroxides,LDHs）是一类具有层状结构的无机功能材料（周洁2015），结构如图1-4所示。LDHs通常用公式[[MII1-xMIIIx(OH)2][Anx/n]xH2O]表示，其因巨大的表面积和独特的物理化学性质在在传感器、催化、能源设备和生物医学应用领域成为一个热门的研究话题（Sunetal.2014）。近年来，被报道出一些典型的层状双金属氢氧化物具有类氧化酶和类过氧化物酶活性（Fanetal.2014）。例如，通过共沉淀法改进合成的CoFe-LDH纳米片用于模拟过氧化物酶，制备的CoFe-LDH纳米片具有优异的类过氧化物酶，在酸性条件下H2O2催化氧化TMB，在较宽范围的pH（2-10）和温度（0-60°C）条件下处理后，并在水溶液中保存2个月后仍能保持其催化活性，表现出良好的稳定性（Zhangetal.2012）。另外，材料结构的不同会带来意想不到的结果。Zhao等以六方相溶致液晶为纳米反应器，也合成了具有分层绳索状结构的CoFe-LDH纳米片（Zhaoetal.2013），制备得到的CoFe-LDHs纳米片具有较强的类氧化酶活性，可通过溶解氧氧化底物TMB。动力学研究结果显示，以TMB为底物时，米氏常数Km值低至0.05mmol/L，远远低于辣根过氧化物酶（HRP）和许多典型纳米酶的Km值，表明CoFe-LDHs纳米片对TMB有非凡的亲和力。层次分明的绳状结构对其类氧化酶活性高低起着重要作用。相比之下，在没有表面活性剂的情况下合成的20-30nm纳米片和添加表面活性剂（曲拉通）制备得到的表面形貌为纳米片或小颗粒的样品，其类氧化酶活性更低。图1-4LDHs的结构图（Sunetal.2014）Fig.1-4StructurediagramofLDHs.（Sunetal.2014）（2）碳基纳米酶随着纳米制造技术的迅速发展，愈来愈多的碳基纳米材料被合成且被报道具有内在的类过氧化物酶活性。研究发现，功能化的羧基和羟基对过氧化物酶的性质起着重要的作用。Song等报道的羧基修饰氧化石墨烯（GO-COOH）可在H2O2的帮助下催化TMB氧化，表现出良好的类过氧化物酶活性（Songetal.2010）。动力学研究结果表明，氧化石墨烯的-COOH对TMB底物的亲和力高于HRP，表现出优异的催化效率。由于羧基和羟基的修饰，GO-COOH与过氧化物酶底物H2O2和TMB之间的相互作用促进了电子的转移从而提高了类过氧化物酶的活性。除石墨烯，自2004年首次报告碳点，其因独特的物理化学特性而受到越来越多的关注（Xuetal.2004）。现已有研究报道，碳点（CDs）也拥有固有的类过氧化物酶活性，可以作为高效的纳米酶，这是因为CDs可以接收TMB氨基上的孤对电子，并能将电子转移到H2O2（Zhengetal.2013）。石墨烯量子点是一种典型的碳点，可由石墨烯或小分子热解制备。研究发现，由于石墨烯量子点具有更小的体积，与氧化石墨烯相比，它有着更高的类过氧化物酶催化活性。此外，如单链碳纳米角（SWCNHs）的碳材料也被报道表现出优异的类过氧化物酶的活性，而且羧基功能化的单链碳纳米角在温度和pH条件下比HRP具有更高的稳定性（Zhuetal.2015）。（3）金属纳米酶金属纳米酶具有优异的电子性能和生物相容性，广泛应用于电催化、传感和生物医学等领域（Cobleyetal.2011），其中贵金属类纳米材料的研究颇多。Jv等报道了带有正电荷、平均粒径为34nm、zeta电位约为+11.3mV的金纳米颗粒，具有较强的类过氧化物酶活性，这与其修饰的半胱胺的NH3+基团有关（Jvetal.2010）。研究结果表明，与带有正电荷的金纳米颗粒相比，柠檬酸修饰的带有负电荷的金纳米颗粒的类过氧化物酶催化活性要低得多。研究者们进一步探究了配体对酶类催化活性的影响（Wangetal.2016;Zhaoetal.2015;Jiangetal.2017），结果表明，pH值在决定酶类效率方面起着至关重要的作用。例如，金纳米颗粒通常在酸性溶液（pH=4.0左右）中表现出最大的类过氧化物酶活性，但在生理pH值时则相当低，从而限制了在生物方面的应用（Heetal.2013）。对此问题可以通过在中性条件下引入肝素可以显著提高金纳米颗粒的类过氧化物酶活性，这是因为底物TMB与肝素修饰的带负电荷金纳米晶之间的静电相互作用有助于增强金纳米颗粒的催化活性（Huetal.2018）。除具有类过氧化物酶活性外，金纳米颗粒还被证明具有类氧化酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和葡萄糖氧化酶活性（Lienetal.2013;Caoetal.2016;Borgheietal.2018;Luoetal.2010）。有研究证明金纳米颗粒表面金属离子的沉积可以控制酶模拟的类型（Lienetal.2013）。如图1-5所示，在金纳米颗粒表面用Ag+、Bi3+或Pb2+修饰后，可获得较强的类过氧化物酶活性；然而，分别修饰Ag+/Hg2+和Hg2+/Bi3+后，表现出优良的类氧化酶和类过氧化氢酶活性，这一结果证实了金纳米颗粒的氧化状态在类酶活性性质中起着关键作用。另外，小尺寸的金纳米颗粒能够催化葡萄糖氧化生成葡萄酸盐和H2O2，可以模拟天然的葡萄糖氧化酶，且与天然葡萄糖氧化酶相比，制备的具有类葡萄糖氧化酶的金纳米颗粒具有更好的pH、热稳定性和存储稳定性（Luoetal.2010）。图1-5金纳米颗粒经金属离子修饰后表现出（A）过氧化物酶、类氧化酶和（B）类过氧化氢酶活性的示意图（Lienetal.2013）Fig.1-5SchematicillustrationsofAunanoparticlesexhibiting(A)peroxidaseandoxidase-likeand(B)catalase-likeactivitiesaftermodificationwithmetalions.（Lienetal.2013）与金纳米颗粒类似，铂、钯、银纳米颗粒也作为生产酶的模拟物相继出现（Liuetal.2014;Weietal.2015;Songetal.2019a）。例如Liu等报道的铂纳米颗粒通常在酸性溶液中表现出优良的类过氧化物酶活性，在中性和碱性介质中表现出明显的过氧化氢酶和清除1O2自由基活性，而在中性溶液中具有超氧化物歧化酶活性（Liuetal.2014）。Rostami等人基于银纳米粒子（AgNPs）的种子介导生长建立了一种简单、灵敏的检测抗坏血酸（AA）的方法，生长液中存在的银离子通过与AA的氧化还原反应还原为银种子表面的银原子，如图1-6所示。在420nm处出现紫外吸收带，这是由于AgNPs局部表面产生的等离子体共振峰，导致体系溶液颜色由无色变为黄色。试验结果表明，该比色传感器在0.25-25μmol/L的检测范围内具有较低的检测限，为0.054μmol/L。另外，该方法对AA检测具有较高的选择性且可与AA共存（RostamiSetal.2016）。聚乙烯吡咯烷酮修饰的铱纳米粒子和柠檬酸盐覆盖的钌纳米粒子均可作为高效酶模拟物，研究表明出它们具有内在的过氧化氢酶和过氧化物酶样活性（Suetal.2015;Cholevaetal.2018）。铱纳米颗粒粒径小（仅1.5nm），不仅具有较好的过氧化氢酶和过氧化物酶活性，而且还有着良好的生物相容性和抗氧化性，适于生物医学方面的应用（Suetal.2015）。除贵金属纳米材料外，纳米铜等非贵金属也因其合成容易、催化活性高、成本低而被认为是一种高效的酶仿生材料（Yanetal.2017b;Xuetal.2016）。更有趣的是，包覆有牛血清白蛋白的铜纳米团簇在pH值（2.0-10.0）和温度（20-80°C）范围内均表现出非常稳定的催化活性，也进一步扩大了其在生物化学和环境工程领域的应用。牛血清白蛋白修饰的铜纳米团簇之所以拥有的优异的稳定性可能与铜组分的内在特性有关，这也是启发研究者们关注这类材料的原因之一。图1-6（a）银纳米颗粒比色检测AA的照片；（b）不同AA浓度在420nm处的吸收变化校准曲线（RostamiSetal.2016）（A）银纳米颗粒比色检测AA的照片；（B）不同AA浓度在420nm处的吸收变化校准曲线Fig.1-6(a)PhotographofAgNPssolutionforcolorimetricdetectionofAA.(b)Calibrationcurveoftheabsorptionchangeat420nmwithdifferentconcentrationsofAA.（RostamiSetal.2016）（4）金属氧化物纳米酶除上述纳米材料外，金属氧化物基纳米材料也是制造高效模拟酶的潜在材料之一（Heetal.2014）。其中，Fe3O4具有较强的类过氧化物酶活性，在生物传感等方面具有良好的应用前景（Chenetal.2012;Chenetal.2018）。Gao等首次报道不同尺寸的Fe3O4纳米颗粒可以催化底物TMB、重氮氨基苯（DAB）和邻苯二胺（OPD）氧化，溶液分别呈现蓝色、棕色和橙色，表现出较强的类过氧化物酶活性（Gaoetal.2007），（图1-7），其中潜在的原因可能是纳米Fe3O4中亚铁离子的存在对其类过氧化物酶活性起主导作用。动力学试验结果显示，相比于HRP，Fe3O4纳米颗粒具有更低的Km值，说明Fe3O4纳米颗粒对TMB的亲和力更强。CeO2纳米酶具有良好的类氧化酶活性，可以催化一系列有机染料和小分子的氧化。Asati等通过分别制备葡聚糖和聚丙烯酸包覆的CeO2纳米颗粒，探究了材料的类酶活性（Asatietal.2009b）。葡聚糖和聚丙烯酸包覆的CeO2纳米颗粒在酸性介质中表现出类氧化酶活性，该活性与pH、CeO2纳米颗粒的大小、聚合物涂层的厚度密切相关，较低的pH值（4.0）、较小的CeO2尺寸和较薄的聚合物涂层均可使CeO2纳米颗粒具有更高的类氧化酶活性。此外，CeO2纳米材料还可以模拟其他类型的酶。例如CeO2-x纳米棒还具有类脲性质，它可以催化尿素水解，类脲酶催化活性（Kcat）估计为每秒95.8，仅略低于天然的洋刀豆脲酶（Korscheltetal.2018）；而且CeO2-x纳米棒具有成本低、生物相容性好、长期稳定性好等优点，可作为一种绿色酶的替代品。Lian等制备了苝酰亚胺（PDI）修饰的磁性gamma--Fe2O3/CeO2纳米颗粒（gamma-Fe2O3/CeO2-PDI），具有良好的过氧化物酶活性。由于PDI的修饰，gamma-Fe2O3/CeO2-PDI比gamma-Fe2O3/CeO2具有更多表面缺陷（Ce3+）和活性氧物种，因此具有更加优异的催化性能，对Vc也表现出较好的选择性，在生物医学和食品分析领域具有广阔的应用前景（Lianetal.2019）。与Fe3O4和CeO2类似，VOx纳米材料也表现出优异的类酶性能（Andreetal.2011;Sunetal.2016）。Andre等制备的V2O5纳米线在酸性条件下（pH=4.0），类过氧化物酶活性最佳（Andreetal.2011），动力学试验结果表明，V2O5纳米线的Km值远低于辣根过氧化物酶，表明底物对V2O5纳米线有更好的亲和力。此外，通过水热反应合成的平均宽度为103.1nm的VO2纳米带也是一种有效的过氧化物酶模拟物（Nieetal.2014），而且基于VO2纳米带的类过氧化物酶催化反应的机理遵循双底物反应的顺序原理。图1-7（A）不同粒径的Fe3O4纳米颗粒的TEM图；（B）Fe3O4纳米颗粒催化H2O2氧化底物TMB、DAB和OPD产生不同的颜色；（C）类过氧化物酶催化反应示意图（Gaoetal.2007）Fig.1-7(A)TEMimagesofFe3O4nanoparticleswithvaried