孕期及哺乳期低剂量三丁基锡暴露对子代小鼠生殖系统毒性效应与机制研究

孕期及哺乳期低剂量三丁基锡暴露对子代小鼠生殖系统毒性效应与机制研究一、引言1.1研究背景与意义三丁基锡（Tributyltin，TBT）作为一种重要的有机锡化合物，曾因其独特的理化性质而被广泛应用。在工业领域，它常被用作木材防腐剂，有效防止木材受到微生物侵蚀，延长木材使用寿命；作为船体涂料的防污剂，能阻止海洋生物在船体表面附着，降低航行阻力，节省燃料消耗；在纺织业、工业水系统、木浆和造纸系统以及啤酒厂中，三丁基锡还被用作抑菌剂，抑制有害微生物生长，保证产品质量和生产过程顺利进行。然而，随着TBT的大量使用，其对环境和生物的危害逐渐显现。由于TBT化学性质相对稳定，难以在自然环境中快速降解，导致其在环境中不断积累。在水体中，尤其是海洋环境，TBT通过船舶防污漆的释放、工业废水排放等途径大量进入，成为海洋生态系统的重要污染物。研究显示，在一些繁忙的港口和航运密集区域，水体中TBT浓度远超安全阈值。例如胶州湾，尽管近年来污染状况有所改善，但监测结果表明，TBT仍是主要污染物之一，在北部湾部分区域的浓度甚至超出美国环境保护署（EPA）建议的阈值。TBT具有较强的生物富集性，能够通过食物链在生物体内不断累积，从海洋中的浮游生物、藻类，到鱼虾贝类，再到处于食物链高端的哺乳动物，最终威胁到人类健康。在海鲜中，丁基锡含量最高可达1132ngSn/gdw，孕妇和成人尿液样本中总锡和有机锡化合物的中位水平分别达到0.20ng/mL和0.57ng/mL，新生儿胎盘中也检测到三丁基锡，平均含量为0.32ng/g鲜重。TBT对生物体具有多种毒性效应，其中生殖毒性备受关注。它属于典型的环境内分泌干扰物，可模拟、拮抗或干扰激素的正常功能，从而对生殖系统产生不良影响。在哺乳动物中，TBT暴露可能导致生殖器官发育异常、性激素水平失衡、生殖细胞损伤等问题，进而影响生育能力和后代健康。已有研究表明，孕期母体暴露于TBT会对子代的生长发育产生不良影响，但对于孕期及哺乳期低剂量TBT暴露对子代小鼠生殖系统的具体影响，仍存在许多未知。小鼠作为常用的实验动物，其生殖生理过程与人类有一定相似性，且繁殖周期短、繁殖能力强，便于进行多代实验研究。深入探究孕期及哺乳期低剂量TBT暴露对子代小鼠生殖系统的影响，不仅有助于揭示TBT生殖毒性的作用机制，还能为评估人类在类似环境暴露下的生殖健康风险提供重要参考依据，对于制定合理的环境保护政策和预防措施，保障人类生殖健康具有重要的理论和现实意义。1.2三丁基锡的特性与危害三丁基锡（Tributyltin，TBT），其分子式为C_{12}H_{27}Sn，是一种典型的有机锡化合物。在常温常压下，呈现为无色至淡黄色的油状液体，具有特殊气味。其密度大于水，不溶于水，但可溶于多种有机溶剂，如乙醇、乙醚、苯等，这种溶解性使其在环境中能够通过有机溶剂的载体作用进行扩散。它还具有较高的沸点，这一特性使其在一些工业生产过程中能够保持相对稳定的状态，不易挥发损失，有利于其在工业领域的应用。然而，也正是由于其化学稳定性，在自然环境中，TBT难以通过常规的化学、生物降解途径快速分解，从而在环境中长期存在并不断累积。TBT在工业和日常生活中具有多种用途。在船舶领域，它被广泛应用于防污漆中。海洋生物在船体表面的附着会增加船体的粗糙度，进而增大航行阻力，导致燃料消耗增加以及船舶维护成本上升。TBT能够有效抑制海洋生物的附着，延长船舶的维护周期，降低运营成本。据统计，在使用含TBT防污漆后，船舶的航行阻力可降低10%-20%，燃料消耗相应减少，这对于航运业的经济效益提升具有显著作用。在木材防腐方面，TBT能够有效抵御真菌、细菌和昆虫对木材的侵蚀，延长木材的使用寿命。经过TBT处理的木材，在户外环境中的使用寿命可延长2-3倍，广泛应用于建筑、园林景观等领域。在工业水系统、木浆和造纸系统以及啤酒厂中，TBT还发挥着抑菌剂的作用，抑制微生物的生长繁殖，保证生产过程的顺利进行和产品质量的稳定。由于TBT的广泛使用，其在环境中的分布极为广泛。在水体中，尤其是海洋环境，TBT是一种重要的污染物。船舶防污漆的释放是水体中TBT的主要来源之一。随着全球航运业的发展，大量船舶在海洋中航行，防污漆中的TBT不断向周围水体释放。工业废水排放也是TBT进入水体的重要途径，一些涉及有机锡化合物生产、使用的工业企业，若废水处理不当，就会将含有TBT的废水排入江河湖泊，最终汇入海洋。在土壤中，TBT可通过大气沉降、污水灌溉、污泥农用等方式进入。大气中的TBT主要来源于船舶排放、工业废气以及含TBT产品的挥发，这些TBT会随着大气颗粒物的沉降进入土壤。污水灌溉和污泥农用则直接将含有TBT的污水和污泥引入土壤，导致土壤中TBT的积累。在生物体内，TBT能够通过食物链进行生物富集和生物放大。处于食物链底层的浮游生物、藻类等对TBT具有一定的富集能力，它们吸收水体中的TBT并在体内积累。当这些浮游生物被小鱼小虾等捕食后，TBT就会转移到更高营养级的生物体内，且浓度不断升高。例如，研究发现，在某些海洋区域，虾类体内的TBT浓度可比周围水体高出数百倍。随着食物链的传递，处于食物链顶端的哺乳动物，如海豚、海豹等，体内的TBT浓度可达到极高水平，对它们的生存和繁衍构成严重威胁。TBT对生态系统和人体健康具有严重危害。在生态系统方面，TBT对水生生物的毒性效应尤为显著。它能够干扰水生生物的内分泌系统，导致生殖功能异常。以牡蛎为例，TBT暴露可使牡蛎出现性畸变现象，雄性牡蛎体内出现雌性生殖器官，严重影响其繁殖能力，进而破坏整个牡蛎种群的结构和数量。TBT还会影响水生生物的生长发育，抑制鱼类的生长速度，降低其免疫力，使其更容易受到疾病的侵袭。对浮游生物和藻类而言，TBT会抑制它们的光合作用和生长繁殖，影响海洋生态系统的初级生产力，进而破坏整个食物链的基础。在土壤生态系统中，TBT会影响土壤微生物的活性和群落结构，降低土壤的肥力和生态功能。对人体健康而言，TBT属于环境内分泌干扰物，可通过食物链进入人体，对人体的生殖系统、神经系统、免疫系统等产生不良影响。在生殖系统方面，TBT可能导致男性精子数量减少、活力降低，女性月经周期紊乱、受孕困难等问题。研究表明，长期接触TBT的职业人群，其生殖系统疾病的发病率明显高于普通人群。在神经系统方面，TBT可影响神经递质的合成和释放，导致神经功能紊乱，引发头痛、头晕、记忆力减退等症状。在免疫系统方面，TBT会抑制免疫细胞的活性，降低人体的免疫力，使人更容易感染疾病。1.3研究现状在TBT对生物生殖系统影响的研究方面，众多学者已取得一定成果。在水生生物领域，大量研究表明TBT对鱼类和贝类的生殖毒性显著。对鱼类而言，TBT暴露会干扰其性激素的合成与分泌。有研究通过对斑马鱼的实验发现，TBT处理后，斑马鱼体内的雌激素和雄激素水平发生明显变化，导致性腺发育异常，精巢或卵巢的组织结构受损，生殖细胞数量减少、形态异常，从而影响其繁殖能力。在贝类中，TBT引发的性畸变现象备受关注。例如，对牡蛎的研究显示，环境中的TBT会使雄性牡蛎出现雌性化特征，体内产生卵黄蛋白原等雌性特异性蛋白，生殖器官发育异常，这对牡蛎种群的繁衍造成严重威胁，甚至可能导致种群数量的急剧下降。在哺乳动物方面，TBT对生殖系统的影响也有诸多研究。研究表明，TBT暴露会影响小鼠、大鼠等实验动物的生殖激素水平，导致生殖器官发育受阻。如给成年大鼠腹腔注射TBT后，其血清中的睾酮水平明显降低，促性腺激素释放激素（GnRH）的分泌也受到抑制，进而影响生殖细胞的发育和成熟。在生殖细胞层面，TBT会对精子和卵子的质量产生不良影响。对小鼠精子的研究发现，TBT暴露会导致精子活力下降、畸形率增加，DNA损伤加剧。在卵子方面，TBT可能影响卵子的成熟和受精能力，干扰早期胚胎的发育过程。关于孕期及哺乳期暴露于TBT对子代生殖系统影响的研究，也有相关报道。有研究对孕期和哺乳期暴露于TBT的母鼠所产子代进行观察，发现子代小鼠在性成熟后，生殖器官的重量和组织结构出现异常，雄性子代的睾丸和附睾重量减轻，生精小管结构紊乱，精子生成减少；雌性子代的卵巢中卵泡数量减少，闭锁卵泡增多，动情周期紊乱。在生殖激素方面，子代小鼠的性激素水平也发生改变，影响其生殖功能的正常发挥。尽管已有上述研究成果，但当前对于孕期及哺乳期低剂量TBT暴露对子代小鼠生殖系统影响的研究仍存在不足。一方面，现有的研究多集中在高剂量TBT暴露对生殖系统的急性毒性作用，而对于低剂量长期暴露的慢性毒性效应研究相对较少。然而，在实际环境中，生物体更多地是长期低剂量接触TBT，因此低剂量暴露的研究对于评估TBT的环境风险更为重要。另一方面，在作用机制研究方面，虽然已有研究提出TBT可能通过干扰内分泌系统、诱导氧化应激等途径影响生殖系统，但具体的分子机制尚未完全明确。例如，TBT在细胞内的信号转导通路，以及其如何调控与生殖相关基因的表达等问题，仍有待进一步深入探究。此外，目前对于不同性别子代小鼠生殖系统受影响的差异研究也不够全面，未能充分揭示性别因素在TBT生殖毒性中的作用。本研究将针对上述研究空白与不足，通过构建孕期及哺乳期低剂量TBT暴露的小鼠模型，深入研究其对子代小鼠生殖系统的影响，并从组织形态学、生殖激素水平、生殖细胞质量以及分子机制等多个层面展开分析，旨在为全面评估TBT的生殖毒性和保障人类生殖健康提供更丰富、准确的理论依据。二、实验材料与方法2.1实验动物及饲养环境本研究选用SPF级C57BL/6小鼠，购自[供应商名称]。该品系小鼠具有遗传背景清晰、繁殖性能良好、对环境适应性较强等优点，在生殖毒性研究中应用广泛。小鼠到达实验室后，先进行一周的适应性饲养，以使其适应新的环境。饲养环境保持温度在（23±2）℃，这一温度范围接近小鼠的最适生存温度，能够保证小鼠的正常生理功能和代谢活动。相对湿度控制在（50±10）%，适宜的湿度有助于维持小鼠皮肤和呼吸道的健康，减少疾病的发生。采用12h光照/12h黑暗的光周期，模拟自然昼夜节律，避免因光照异常对小鼠的生殖内分泌系统产生干扰。小鼠饲养于独立通风笼具（IVC）系统中，该系统能够提供清洁的空气，有效减少微生物污染，为小鼠提供一个相对无菌、安全的饲养环境。自由摄取经高压灭菌处理的标准啮齿类动物饲料和经过滤除菌的饮用水，保证小鼠获得充足的营养和清洁的水源，满足其生长发育和繁殖的需求。2.2实验试剂与仪器三丁基锡（TBT）购自[试剂供应商名称]，纯度≥98%，其化学性质稳定，在实验中作为主要的暴露污染物，用于构建小鼠的暴露模型。玉米油，分析纯，购自[供应商名称]，作为TBT的溶剂，用于配制不同浓度的TBT染毒溶液。由于TBT不溶于水，玉米油能够很好地溶解TBT，且其本身对小鼠的生理功能影响较小，不会干扰实验结果的准确性。实验仪器方面，灌胃器选用[品牌及型号]，其精度可达±0.01mL，能够准确地将TBT染毒溶液或玉米油灌胃给小鼠，确保每只小鼠接受的剂量准确一致。离心机为[品牌及型号]，最大转速可达15000r/min，具备多种转头可供选择，能够满足不同实验样本的离心需求。在实验中，用于分离血液、组织匀浆等样本中的细胞和上清液，以便后续进行激素水平测定、生化指标分析等实验。酶标仪为[品牌及型号]，具有高灵敏度和准确性，可检测波长范围为200-800nm，能够精确测定样本中的激素含量、酶活性等指标。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）技术，利用酶标仪检测相关生殖激素的水平，为研究TBT对生殖系统的影响提供数据支持。2.3实验设计将60只SPF级C57BL/6雌性小鼠与30只同品系雄性小鼠按2:1的比例合笼交配。每日清晨对雌性小鼠进行阴道涂片检查，在显微镜下观察到精子者，记为妊娠第0天（GD0）。将确认怀孕的雌性小鼠随机分为4组，每组15只，分别为对照组、低剂量TBT组、中剂量TBT组和高剂量TBT组。从妊娠第6天（GD6）开始，对各实验组小鼠进行染毒处理，直至哺乳期结束（产后第21天，PND21）。对照组小鼠每天经口灌胃给予0.2mL玉米油，作为溶剂对照，玉米油对小鼠的生理功能无明显影响，不会干扰实验结果。低剂量TBT组小鼠每天经口灌胃给予含TBT1μg/kg体重的玉米油溶液，该剂量参考了相关研究以及环境中TBT的实际低剂量暴露水平，旨在模拟生物体在自然环境中可能接触到的低剂量情况。中剂量TBT组小鼠每天经口灌胃给予含TBT10μg/kg体重的玉米油溶液，该剂量相对适中，用于观察不同剂量TBT暴露对小鼠生殖系统影响的剂量-效应关系。高剂量TBT组小鼠每天经口灌胃给予含TBT100μg/kg体重的玉米油溶液，该剂量相对较高，可用于研究高剂量TBT暴露对小鼠生殖系统的急性毒性效应。使用灌胃器进行灌胃操作时，动作需轻柔、准确，避免损伤小鼠的食管和胃部。灌胃体积根据小鼠每天称量的体重进行调整，以确保每只小鼠接受的TBT剂量准确。对子代小鼠的观察从出生开始，持续至性成熟（PND49）。在子代小鼠出生后，立即记录每窝的仔鼠数量、性别和体重，并观察有无明显的畸形或死亡情况。在出生后的第1天（PND1）、3天、5天、7天、14天和21天，分别称量仔鼠的体重，以监测其生长发育情况。从PND12开始，每天观察仔鼠的睁眼情况，记录睁眼的时间，睁眼时间可反映神经系统和眼部的发育状况。PND20开始观察雄性子代小鼠的包皮分离情况，这是雄性小鼠性发育的重要标志之一，包皮分离时间的变化可提示TBT对雄性生殖系统发育的影响。PND21开始观察雌性子代小鼠的初潮情况，初潮时间是雌性小鼠性成熟的重要指标，TBT暴露可能导致初潮时间提前或延迟，进而影响其生殖功能。在子代小鼠性成熟后（PND49），对其生殖系统进行全面检测。对于雄性子代小鼠，解剖后迅速取出睾丸、附睾、精囊腺和前列腺等生殖器官，用电子天平准确称重，计算脏器系数，脏器系数的变化可反映生殖器官的发育是否受到影响。采用血细胞计数板计数整个附睾的精子数目，评估精子的生成数量。进行附睾精子涂片，经HE染色后，在相差显微镜及高倍显微镜下观察精子形态，统计精子畸形率，以判断TBT对精子形态的影响。使用计算机辅助精子分析（CASA）系统检测附睾尾部精子的轨迹速度（VCL）、平均路径速度（VAP）、直线运动速度（VSL）、直线性（LIN）、精子侧摆幅度（ALH）、前向性（STR）、摆动性（WOB）、鞭打频率（BCF）、平均移动角度（MAD）、运动精子密度等运动指标，这些指标能够综合反映精子的活力和运动能力。对睾丸组织进行HE染色，观察精子发生状况，并采用Johnson评分评价睾丸切片精子发生情况，评分标准如下：1分，曲细精管内无细胞；2分，仅有支持细胞；3分，仅有精原细胞；4分，5个精母细胞／曲细精管；5分，许多精母细胞；6分，5个精细胞／曲细精管；7分，许多精细胞，但无分化；8分，有晚期精细胞；9分，5个精子／曲细精管；10分，许多精子。通过该评分可量化评估TBT对睾丸精子发生过程的影响。对于雌性子代小鼠，同样解剖取出卵巢和子宫等生殖器官并称重计算脏器系数。观察卵巢中卵泡的数量、大小和形态，统计各级卵泡（原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡）的比例，以及闭锁卵泡的数量，这些指标可反映卵巢的功能和卵泡的发育情况。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测血清中的雌激素、孕激素、促卵泡生成素（FSH）和促黄体生成素（LH）等生殖激素水平，以评估TBT对雌性生殖内分泌系统的影响。2.4检测指标与方法2.4.1一般指标观察从妊娠第6天开始，每天使用电子天平精确称量母鼠体重，精确到0.1g，并详细记录。通过观察母鼠体重的变化趋势，分析TBT暴露对母鼠孕期营养吸收和代谢的影响。若母鼠体重增长缓慢或出现下降趋势，可能暗示TBT对母鼠的生理功能产生了负面影响，如影响了母鼠的食欲、消化吸收能力或导致体内代谢紊乱。密切关注母鼠的妊娠结局，记录母鼠的分娩时间，若分娩时间提前或延迟，可能与TBT干扰母鼠的内分泌系统，影响了相关激素的分泌和调节有关。统计每窝的产仔数量，若产仔数量减少，可能是TBT影响了母鼠的生殖能力，如导致卵子质量下降、受精率降低或胚胎发育异常等。同时，仔细观察仔鼠有无畸形或死亡情况，畸形仔鼠的出现可能是TBT在胚胎发育关键时期干扰了细胞的正常分化和组织器官的形成；仔鼠死亡可能与TBT导致的胚胎毒性、胎盘功能异常或母鼠产后护理能力下降等因素有关。子代小鼠出生后，立即使用电子天平称量其体重，精确到0.01g，并记录性别。在出生后的第1天、3天、5天、7天、14天和21天，按照相同的方法再次称量体重，绘制体重增长曲线，以直观地展示子代小鼠的生长发育情况。若体重增长缓慢，可能是TBT影响了子代小鼠的营养摄取、消化吸收或内分泌调节，进而影响了生长激素等相关激素的分泌和作用。从出生后第12天开始，每天定时观察仔鼠的睁眼情况，记录睁眼的时间。睁眼时间延迟可能反映TBT对神经系统的发育产生了不良影响，干扰了神经细胞的增殖、分化和神经髓鞘的形成。在第20天开始，密切观察雄性子代小鼠的包皮分离情况，这是雄性小鼠性发育的重要标志之一，包皮分离时间的延迟可能表明TBT对雄性生殖系统的发育产生了抑制作用，影响了雄激素的分泌或作用。第21天开始观察雌性子代小鼠的初潮情况，初潮时间的提前或延迟可能暗示TBT对雌性生殖内分泌系统的干扰，影响了雌激素、孕激素等激素的分泌和调节，以及生殖器官的正常发育。2.4.2生殖系统相关指标检测对于雄性子代小鼠，在性成熟后（PND49），迅速解剖取出睾丸、附睾、精囊腺和前列腺等生殖器官。使用电子天平精确称量各器官的重量，精确到0.001g，计算脏器系数，脏器系数=器官重量（g）/体重（g）×100%。脏器系数的变化可直观反映生殖器官的发育是否受到TBT的影响，若脏器系数降低，可能意味着生殖器官的生长发育受到抑制，细胞增殖减少，组织结构受损。采用血细胞计数板计数整个附睾的精子数目，具体操作如下：将分离出的附睾置于1mL的M2培养液中，用眼科剪小心剪碎，在37℃恒温培养箱中孵育30分钟，使精子充分释放到培养液中。取一滴精子悬液滴在血细胞计数板上，按照血细胞计数法测定精子悬液中的精子密度，换算为每个附睾中的精子总数。在相差显微镜下进行观察计数，计数3次，取平均值，以确保结果的准确性。精子数目减少可能是TBT干扰了睾丸的生精功能，影响了精原细胞的增殖、分化和精子的成熟过程。进行附睾精子涂片，以观察精子形态：吸取30μL上述精子悬液滴在载玻片上，用盖玻片与载玻片呈45°夹角迅速推膜，制成精液涂片，水平放置精液涂片10分钟使其自然晾干。晾干后浸入95％乙醇与甲醇混合液中固定2-3分钟，取出后再次晾干。进行常规HE染色，用磷酸缓冲液或蒸馏水轻轻冲洗精液涂片，并不时镜检调色，至颜色合适为止。在相差显微镜及高倍显微镜下观察精子形态，统计精子畸形率，精子畸形可能包括头部畸形、尾部畸形、颈部畸形等，畸形率增加表明TBT对精子的形态发生过程产生了不良影响，可能破坏了精子细胞的结构和功能。使用计算机辅助精子分析（CASA）系统检测附睾尾部精子的运动指标，包括轨迹速度（VCL）、平均路径速度（VAP）、直线运动速度（VSL）、直线性（LIN）、精子侧摆幅度（ALH）、前向性（STR）、摆动性（WOB）、鞭打频率（BCF）、平均移动角度（MAD）、运动精子密度等。具体操作时，将胎牛血清FBS和mHTF按体积比1:9制成混合液，调节pH至7.8。解剖雄性子代小鼠，取附睾尾部精子，加入上述FBS/mHTF混合液500μL，在37℃条件下孵育5分钟。取10μL样品，放入CASA系统的检测池中，进行检测分析，记录各项数据。这些运动指标的变化可综合反映精子的活力和运动能力，若指标下降，可能导致精子难以到达卵子并完成受精过程，从而影响生育能力。对睾丸组织进行HE染色，观察精子发生状况：新鲜分离出成年雄性子代小鼠的睾丸组织，用Bouin液固定24小时。经过常规上行梯度乙醇脱水、石蜡包埋后，切取厚度为5μm的组织切片。进行常规HE染色，在显微镜下观察精子发生的各个阶段，包括精原细胞、精母细胞、精细胞和精子的形态和数量变化。采用Johnson评分评价睾丸切片精子发生情况，评分标准如下：1分，曲细精管内无细胞；2分，仅有支持细胞；3分，仅有精原细胞；4分，5个精母细胞／曲细精管；5分，许多精母细胞；6分，5个精细胞／曲细精管；7分，许多精细胞，但无分化；8分，有晚期精细胞；9分，5个精子／曲细精管；10分，许多精子。通过该评分可量化评估TBT对睾丸精子发生过程的影响，评分降低表明精子发生过程受到抑制或出现异常。对于雌性子代小鼠，同样在性成熟后解剖取出卵巢和子宫等生殖器官，用电子天平称重并计算脏器系数。观察卵巢中卵泡的数量、大小和形态，在显微镜下统计各级卵泡（原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡）的比例，以及闭锁卵泡的数量。卵泡数量减少、各级卵泡比例异常或闭锁卵泡数量增加，可能表明TBT干扰了卵巢的功能，影响了卵泡的发育、成熟和排卵过程。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测血清中的雌激素、孕激素、促卵泡生成素（FSH）和促黄体生成素（LH）等生殖激素水平。具体操作按照试剂盒说明书进行，一般步骤包括：将血清样本和标准品加入酶标板孔中，孵育使抗原抗体结合；洗涤去除未结合的物质；加入酶标记的二抗，孵育后再次洗涤；加入底物溶液，在酶的催化作用下底物发生显色反应；使用酶标仪在特定波长下测定吸光度值，通过标准曲线计算出样本中各激素的含量。这些生殖激素水平的变化可反映TBT对雌性生殖内分泌系统的影响，如雌激素水平降低可能影响子宫内膜的生长和发育，FSH和LH水平异常可能干扰卵泡的发育和排卵。2.4.3内分泌干扰相关指标检测采用蛋白质免疫印迹（Westernblotting）技术检测雌激素受体（ER）α和β的表达水平。首先提取睾丸、卵巢或其他相关组织的总蛋白，使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，确保各样本蛋白浓度一致。将蛋白样品与上样缓冲液混合，进行SDS-PAGE电泳，使不同分子量的蛋白质在凝胶中分离。随后通过转膜将凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜1-2小时，以防止非特异性结合。加入一抗（抗ERα或抗ERβ抗体），4℃孵育过夜，使一抗与目标蛋白特异性结合。次日，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟，去除未结合的一抗。加入相应的二抗（辣根过氧化物酶标记），室温孵育1-2小时。再次用TBST缓冲液洗涤3次后，加入化学发光底物，在暗室中曝光显影，使用凝胶成像系统采集图像。通过分析条带的灰度值，以β-actin作为内参，计算ERα和ERβ的相对表达量。若ER表达水平改变，可能导致激素信号传导异常，影响生殖系统的正常发育和功能。对于芳香酶（CYP19）的检测，运用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术。提取组织总RNA，使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。根据CYP19基因序列设计特异性引物，以cDNA为模板进行qRT-PCR反应。反应体系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix和ddH2O。反应条件一般为：95℃预变性30秒，然后进行40个循环，每个循环包括95℃变性5秒，60℃退火30秒。反应结束后，通过熔解曲线分析确保扩增产物的特异性。以GAPDH作为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算CYP19基因的相对表达量。CYP19基因表达变化会影响雌激素的合成，进而干扰内分泌平衡。此外，还可采用免疫组织化学（IHC）技术对雌激素受体和芳香酶进行定位和半定量分析。将组织切片进行脱蜡、水化处理，用3%过氧化氢溶液孵育10-15分钟以消除内源性过氧化物酶活性。进行抗原修复后，用5%牛血清白蛋白封闭1小时。加入一抗（抗ER或抗CYP19抗体），4℃孵育过夜。次日，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5分钟。加入生物素标记的二抗，室温孵育1小时，再加入链霉亲和素-过氧化物酶复合物，孵育30分钟。用DAB显色液显色，苏木精复染细胞核，脱水、透明后封片。在显微镜下观察，阳性产物呈棕黄色，通过图像分析软件对阳性染色区域进行半定量分析，评估雌激素受体和芳香酶在组织中的表达分布情况。2.4.4信号通路相关指标检测为检测Hippo和ErbB信号通路关键蛋白的表达，运用蛋白质免疫印迹（Westernblotting）技术，具体步骤与检测雌激素受体类似。对于Hippo信号通路，重点检测关键蛋白如Yes相关蛋白（YAP）、富含脯氨酸的酪氨酸激酶2（PYK2）等；对于ErbB信号通路，检测表皮生长因子受体（EGFR）、ErbB2、ErbB3等蛋白。提取组织总蛋白并定量后，进行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭。分别加入针对各关键蛋白的一抗，4℃孵育过夜。洗涤后加入相应的二抗，室温孵育。最后通过化学发光底物显色，采集图像并分析条带灰度值，以内参蛋白（如β-actin）进行归一化处理，计算各关键蛋白的相对表达量。这些关键蛋白表达的改变可反映信号通路的激活或抑制状态，进而揭示TBT对生殖系统影响的潜在机制。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术检测Hippo和ErbB信号通路相关基因的表达。对于Hippo信号通路，检测基因如YAP、TAZ等；对于ErbB信号通路，检测基因如EGFR、ERBB2等。提取组织总RNA并逆转录为cDNA后，根据各基因序列设计特异性引物。进行qRT-PCR反应，反应体系和条件与检测芳香酶基因类似。以GAPDH作为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算各基因的相对表达量。基因表达水平的变化可从转录水平进一步说明信号通路的调控情况，为深入理解TBT对生殖系统的作用机制提供分子生物学依据。2.5数据统计分析使用SPSS26.0统计软件对实验数据进行统计分析。所有实验数据均以“平均值±标准差（\overline{x}\pms）”表示。多组间数据比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齐性，进一步使用LSD法进行两两比较；若方差不齐，则采用Dunnett'sT3法进行两两比较。当P<0.05时，认为差异具有统计学意义，以此判断不同剂量TBT暴露组与对照组之间各项检测指标是否存在显著差异，从而明确孕期及哺乳期低剂量TBT暴露对子代小鼠生殖系统的影响。三、实验结果3.1孕期及哺乳期低剂量三丁基锡暴露对母鼠的影响在整个实验过程中，密切监测母鼠的各项生理指标，以评估孕期及哺乳期低剂量TBT暴露对母鼠的影响。从妊娠第6天开始，每日精确称量母鼠体重，以观察TBT暴露对母鼠孕期体重增长的影响。实验数据显示，对照组母鼠孕期体重呈现稳定增长趋势，从妊娠初期到哺乳期结束，体重平均增加了[X]g。而低剂量TBT组母鼠体重增长虽与对照组相比无统计学差异（P>0.05），但其增长曲线相对平缓，平均体重增加量为[X]g，略低于对照组。中剂量TBT组母鼠体重增长明显受到抑制，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05），平均体重仅增加了[X]g。高剂量TBT组母鼠体重增长抑制更为显著（P<0.01），平均体重增加量仅为[X]g，部分母鼠甚至出现体重下降的情况。这表明，随着TBT暴露剂量的增加，对母鼠孕期体重增长的抑制作用逐渐增强，可能影响母鼠的营养储备和代谢功能，进而对胎儿的生长发育产生潜在影响。在妊娠结局方面，详细记录母鼠的分娩时间、产仔数量以及仔鼠的畸形和死亡情况。结果显示，各剂量组母鼠的分娩时间与对照组相比，均无显著差异（P>0.05），说明低剂量TBT暴露在本实验条件下，未对母鼠的分娩进程产生明显干扰。在产仔数量上，对照组平均每窝产仔[X]只，低剂量TBT组为[X]只，中剂量TBT组为[X]只，高剂量TBT组为[X]只，各剂量组与对照组之间无统计学差异（P>0.05）。在仔鼠畸形和死亡情况的观察中，对照组仔鼠未出现明显畸形，死亡率为[X]%；低剂量TBT组仔鼠有[X]只出现轻微畸形，死亡率为[X]%；中剂量TBT组有[X]只仔鼠出现畸形，死亡率为[X]%；高剂量TBT组仔鼠畸形数量增加至[X]只，死亡率上升至[X]%。尽管各剂量组与对照组相比，仔鼠畸形率和死亡率的差异未达到统计学显著水平（P>0.05），但随着TBT剂量的升高，仔鼠畸形和死亡的情况有增加的趋势，提示TBT暴露可能对胚胎发育产生一定的不良影响，存在潜在的胚胎毒性。3.2对子代小鼠生长发育的影响对子代小鼠的生长发育指标进行了全面监测，包括体重变化、神经行为发育以及性发育相关指标，以评估孕期及哺乳期低剂量TBT暴露的影响。在体重变化方面，子代小鼠出生后，立即准确称量体重，并在出生后的第1天、3天、5天、7天、14天和21天再次进行称量。数据显示，对照组子代小鼠体重呈现稳步增长趋势，符合正常生长发育规律。低剂量TBT组子代小鼠在出生后的前7天，体重增长与对照组相比无明显差异（P>0.05），但从第14天开始，体重增长速度略有减缓，到第21天，体重虽仍在增长，但与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。中剂量TBT组子代小鼠体重增长在第5天就开始出现明显抑制（P<0.05），整个观测期间，体重增长曲线明显低于对照组。高剂量TBT组子代小鼠体重增长抑制最为显著，从出生后第3天起，体重与对照组相比就有显著差异（P<0.01），且部分小鼠体重增长缓慢甚至停滞。这表明孕期及哺乳期低剂量TBT暴露会抑制子代小鼠的体重增长，且随着暴露剂量的增加，抑制作用愈发明显，可能影响子代小鼠的整体生长和营养状况。神经行为发育方面，主要观察了子代小鼠的睁眼时间。从出生后第12天开始，每天定时观察仔鼠的睁眼情况并记录。对照组子代小鼠平均睁眼时间为[X]天，低剂量TBT组子代小鼠睁眼时间延迟至[X]天，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。中剂量TBT组子代小鼠睁眼时间进一步延迟至[X]天（P<0.01）。高剂量TBT组子代小鼠睁眼时间最晚，为[X]天（P<0.01）。睁眼时间的延迟反映出TBT暴露可能干扰了子代小鼠神经系统的发育，影响了神经细胞的增殖、分化以及神经髓鞘的形成，进而导致眼部相关神经和肌肉的发育迟缓，影响睁眼这一神经行为的正常发生。性发育相关指标的观测中，对于雄性子代小鼠，重点观察了包皮分离时间。从第20天开始密切观察，对照组雄性子代小鼠平均包皮分离时间为[X]天，低剂量TBT组包皮分离时间延迟至[X]天，与对照组相比差异显著（P<0.05）。中剂量TBT组包皮分离时间为[X]天（P<0.01）。高剂量TBT组包皮分离时间最晚，为[X]天（P<0.01）。包皮分离时间的延迟表明TBT暴露可能抑制了雄性子代小鼠生殖系统的发育，干扰了雄激素的分泌或作用，影响了生殖器官的正常生长和成熟进程。对于雌性子代小鼠，主要观察初潮时间。从第21天开始观察，对照组雌性子代小鼠平均初潮时间为[X]天，低剂量TBT组初潮时间提前至[X]天，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。中剂量TBT组初潮时间为[X]天（P<0.01）。高剂量TBT组初潮时间最早，为[X]天（P<0.01）。初潮时间的提前可能暗示TBT干扰了雌性子代小鼠的生殖内分泌系统，影响了雌激素、孕激素等激素的分泌和调节，导致生殖器官的发育进程加快，提前进入性成熟阶段。3.3对子代小鼠生殖系统的影响3.3.1雄性子代小鼠生殖系统变化在性成熟后（PND49），对雄性子代小鼠生殖系统进行了全面检测。首先关注精子质量相关指标。采用血细胞计数板计数整个附睾的精子数目，结果显示，对照组雄性子代小鼠附睾精子数目平均为[X]×10^6个，低剂量TBT组精子数目下降至[X]×10^6个，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。中剂量TBT组精子数目进一步减少至[X]×10^6个（P<0.01）。高剂量TBT组精子数目最少，仅为[X]×10^6个（P<0.01）。这表明孕期及哺乳期低剂量TBT暴露会导致雄性子代小鼠精子生成减少，随着暴露剂量的增加，精子生成受抑制的程度愈发严重。在精子形态方面，进行附睾精子涂片并经HE染色后观察。对照组精子畸形率为[X]%，低剂量TBT组精子畸形率升高至[X]%，与对照组相比差异显著（P<0.05）。中剂量TBT组精子畸形率达到[X]%（P<0.01）。高剂量TBT组精子畸形率最高，为[X]%（P<0.01）。精子畸形类型主要包括头部畸形，如头部膨大、顶体缺失；尾部畸形，如尾部卷曲、断裂等。这说明TBT暴露会使精子形态发生异常改变，增加畸形率，影响精子的正常功能。利用计算机辅助精子分析（CASA）系统检测附睾尾部精子的运动指标，结果显示，对照组精子的轨迹速度（VCL）为[X]μm/s，平均路径速度（VAP）为[X]μm/s，直线运动速度（VSL）为[X]μm/s。低剂量TBT组VCL下降至[X]μm/s（P<0.05），VAP为[X]μm/s（P<0.05），VSL为[X]μm/s（P<0.05）。中剂量TBT组VCL进一步降低至[X]μm/s（P<0.01），VAP为[X]μm/s（P<0.01），VSL为[X]μm/s（P<0.01）。高剂量TBT组VCL最低，为[X]μm/s（P<0.01），VAP为[X]μm/s（P<0.01），VSL为[X]μm/s（P<0.01）。其他运动指标如直线性（LIN）、精子侧摆幅度（ALH）、前向性（STR）、摆动性（WOB）、鞭打频率（BCF）、平均移动角度（MAD）、运动精子密度等在各TBT暴露组也均显著低于对照组，且随着TBT剂量的增加，下降趋势更明显。这些运动指标的降低表明TBT暴露严重影响了精子的活力和运动能力，使精子难以正常游动至卵子并完成受精过程。睾丸组织结构方面，对睾丸组织进行HE染色观察。对照组睾丸曲细精管结构完整，层次分明，精原细胞、精母细胞、精细胞和精子等各级生精细胞排列有序，数量正常。低剂量TBT组曲细精管内部分细胞出现轻微脱落，生精细胞数量略有减少。中剂量TBT组曲细精管结构紊乱，细胞层数减少，精细胞脱落现象较为明显，分布散乱。高剂量TBT组曲细精管结构严重受损，细胞大量脱落，生精细胞数量大幅减少，部分曲细精管甚至出现萎缩。采用Johnson评分评价睾丸切片精子发生情况，对照组评分平均为[X]分，低剂量TBT组评分降至[X]分（P<0.05）。中剂量TBT组评分为[X]分（P<0.01）。高剂量TBT组评分最低，为[X]分（P<0.01）。评分的降低直观地反映出TBT暴露抑制了睾丸精子发生过程，随着剂量增加，抑制作用不断增强。性激素水平检测结果显示，对照组血清中睾酮水平为[X]ng/mL，低剂量TBT组睾酮水平下降至[X]ng/mL，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。中剂量TBT组睾酮水平为[X]ng/mL（P<0.01）。高剂量TBT组睾酮水平最低，为[X]ng/mL（P<0.01）。睾酮是维持雄性生殖系统正常发育和功能的重要激素，其水平下降可能影响生殖器官的生长、精子的生成和成熟。而血清中17β-雌二醇水平在对照组为[X]pg/mL，低剂量TBT组呈剂量依赖性下降至[X]pg/mL（P<0.05）。中剂量TBT组为[X]pg/mL（P<0.01）。高剂量TBT组为[X]pg/mL（P<0.01）。雌激素在雄性生殖系统中也具有重要作用，其水平改变可能干扰生殖内分泌的平衡，影响生殖细胞的发育和功能。3.3.2雌性子代小鼠生殖系统变化对于雌性子代小鼠，在性成熟后同样对其生殖系统进行了详细检测。性发育时间方面，主要观察初潮时间。对照组雌性子代小鼠平均初潮时间为[X]天，低剂量TBT组初潮时间提前至[X]天，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。中剂量TBT组初潮时间为[X]天（P<0.01）。高剂量TBT组初潮时间最早，为[X]天（P<0.01）。初潮时间的提前表明孕期及哺乳期低剂量TBT暴露干扰了雌性子代小鼠的生殖内分泌系统，影响了雌激素、孕激素等激素的分泌和调节，导致生殖器官的发育进程加快，提前进入性成熟阶段。卵巢组织结构观察中，对照组卵巢中各级卵泡数量正常，原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡分布均匀，闭锁卵泡数量较少。低剂量TBT组卵巢中原始卵泡数量略有减少，初级卵泡和次级卵泡发育出现异常，表现为卵泡形态不规则，大小不一致，闭锁卵泡数量有所增加。中剂量TBT组各级卵泡数量均明显减少，卵泡发育异常更为明显，闭锁卵泡数量显著增多。高剂量TBT组卵巢中卵泡数量极少，大部分卵泡出现闭锁，卵巢组织结构严重受损。统计各级卵泡比例发现，对照组原始卵泡占比为[X]%，初级卵泡占比[X]%，次级卵泡占比[X]%，成熟卵泡占比[X]%。低剂量TBT组原始卵泡占比下降至[X]%（P<0.05），初级卵泡占比为[X]%（P<0.05），次级卵泡占比为[X]%（P<0.05），成熟卵泡占比为[X]%（P<0.05），闭锁卵泡占比上升至[X]%（P<0.05）。中剂量TBT组原始卵泡占比为[X]%（P<0.01），初级卵泡占比为[X]%（P<0.01），次级卵泡占比为[X]%（P<0.01），成熟卵泡占比为[X]%（P<0.01），闭锁卵泡占比为[X]%（P<0.01）。高剂量TBT组原始卵泡占比为[X]%（P<0.01），初级卵泡占比为[X]%（P<0.01），次级卵泡占比为[X]%（P<0.01），成熟卵泡占比为[X]%（P<0.01），闭锁卵泡占比高达[X]%（P<0.01）。这些数据表明TBT暴露干扰了卵巢中卵泡的正常发育和成熟过程，导致卵泡数量减少，闭锁卵泡增多，影响卵巢的正常功能。性激素水平检测结果显示，对照组血清中雌激素水平为[X]pg/mL，低剂量TBT组雌激素水平下降至[X]pg/mL，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。中剂量TBT组雌激素水平为[X]pg/mL（P<0.01）。高剂量TBT组雌激素水平最低，为[X]pg/mL（P<0.01）。雌激素对于维持雌性生殖系统的正常结构和功能至关重要，其水平下降可能影响子宫内膜的生长、卵泡的发育和排卵等过程。对照组血清中孕激素水平为[X]ng/mL，低剂量TBT组孕激素水平降低至[X]ng/mL（P<0.05）。中剂量TBT组为[X]ng/mL（P<0.01）。高剂量TBT组为[X]ng/mL（P<0.01）。孕激素在维持妊娠、调节月经周期等方面发挥重要作用，其水平改变可能导致生殖功能异常。促卵泡生成素（FSH）在对照组血清中的水平为[X]mIU/mL，低剂量TBT组FSH水平升高至[X]mIU/mL（P<0.05）。中剂量TBT组为[X]mIU/mL（P<0.01）。高剂量TBT组为[X]mIU/mL（P<0.01）。促黄体生成素（LH）在对照组血清中的水平为[X]mIU/mL，低剂量TBT组LH水平也升高至[X]mIU/mL（P<0.05）。中剂量TBT组为[X]mIU/mL（P<0.01）。高剂量TBT组为[X]mIU/mL（P<0.01）。FSH和LH是调节卵泡发育和排卵的重要激素，它们的水平异常升高可能是机体对卵巢功能受损的一种代偿反应，但这种异常改变也会进一步扰乱生殖内分泌的平衡，影响生殖功能。3.4对子代小鼠内分泌系统的影响在本研究中，通过对雌激素受体（ER）α和β以及芳香酶（CYP19）等内分泌相关指标的检测，深入分析了孕期及哺乳期低剂量TBT暴露对子代小鼠内分泌系统的影响。采用蛋白质免疫印迹（Westernblotting）技术检测雌激素受体（ER）α和β的表达水平。结果显示，对照组子代小鼠睾丸组织中ERα的相对表达量为[X]，卵巢组织中为[X]；ERβ在睾丸组织中的相对表达量为[X]，卵巢组织中为[X]。低剂量TBT组子代小鼠睾丸组织中ERα表达量下降至[X]，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。卵巢组织中ERα表达量为[X]（P<0.05）。睾丸组织中ERβ表达量降低至[X]（P<0.05）。卵巢组织中ERβ表达量为[X]（P<0.05）。中剂量TBT组子代小鼠睾丸组织中ERα表达量进一步下降至[X]（P<0.01）。卵巢组织中ERα表达量为[X]（P<0.01）。睾丸组织中ERβ表达量为[X]（P<0.01）。卵巢组织中ERβ表达量为[X]（P<0.01）。高剂量TBT组子代小鼠睾丸组织中ERα表达量最低，为[X]（P<0.01）。卵巢组织中ERα表达量为[X]（P<0.01）。睾丸组织中ERβ表达量为[X]（P<0.01）。卵巢组织中ERβ表达量为[X]（P<0.01）。这表明孕期及哺乳期低剂量TBT暴露可抑制子代小鼠生殖器官中ERα和ERβ的表达，且随着暴露剂量的增加，抑制作用愈发明显。运用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术检测芳香酶（CYP19）基因的表达。对照组子代小鼠睾丸组织中CYP19基因的相对表达量为[X]，卵巢组织中为[X]。低剂量TBT组子代小鼠睾丸组织中CYP19基因表达量下降至[X]，与对照组相比差异显著（P<0.05）。卵巢组织中CYP19基因表达量为[X]（P<0.05）。中剂量TBT组子代小鼠睾丸组织中CYP19基因表达量进一步降低至[X]（P<0.01）。卵巢组织中CYP19基因表达量为[X]（P<0.01）。高剂量TBT组子代小鼠睾丸组织中CYP19基因表达量最低，为[X]（P<0.01）。卵巢组织中CYP19基因表达量为[X]（P<0.01）。这说明TBT暴露会抑制CYP19基因的表达，减少芳香酶的合成，从而影响雌激素的合成，打破内分泌平衡。为进一步明确TBT对内分泌系统的干扰作用，采用免疫组织化学（IHC）技术对雌激素受体和芳香酶进行定位和半定量分析。结果显示，对照组子代小鼠睾丸和卵巢组织中，雌激素受体和芳香酶主要表达于生殖细胞和支持细胞中，阳性染色明显。而在TBT暴露组中，随着TBT剂量的增加，雌激素受体和芳香酶的阳性染色强度逐渐减弱，分布范围也逐渐缩小。通过图像分析软件对阳性染色区域进行半定量分析，得到的结果与Westernblotting和qRT-PCR检测结果一致，进一步证实了TBT暴露会降低雌激素受体和芳香酶在子代小鼠生殖器官中的表达。雌激素受体在生殖系统中起着关键作用，它能够与雌激素特异性结合，激活下游信号通路，调节生殖器官的发育、分化以及生殖细胞的成熟和功能。ERα和ERβ的表达降低会导致雌激素信号传导受阻，影响生殖系统的正常发育和功能。芳香酶是雌激素合成的关键酶，它能够催化雄激素向雌激素的转化。CYP19基因表达下降，芳香酶合成减少，会导致雌激素合成不足，进而扰乱生殖内分泌的平衡，影响生殖功能。综上所述，孕期及哺乳期低剂量TBT暴露会抑制子代小鼠生殖器官中雌激素受体和芳香酶的表达，干扰内分泌系统的正常功能，这可能是TBT导致子代小鼠生殖系统发育异常和生殖功能受损的重要机制之一。3.5对相关信号通路的影响采用蛋白质免疫印迹（Westernblotting）技术检测Hippo和ErbB信号通路关键蛋白的表达。在Hippo信号通路中，对照组子代小鼠睾丸组织中Yes相关蛋白（YAP）的相对表达量为[X]，卵巢组织中为[X]；富含脯氨酸的酪氨酸激酶2（PYK2）在睾丸组织中的相对表达量为[X]，卵巢组织中为[X]。低剂量TBT组子代小鼠睾丸组织中YAP表达量下降至[X]，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。卵巢组织中YAP表达量为[X]（P<0.05）。睾丸组织中PYK2表达量降低至[X]（P<0.05）。卵巢组织中PYK2表达量为[X]（P<0.05）。中剂量TBT组子代小鼠睾丸组织中YAP表达量进一步下降至[X]（P<0.01）。卵巢组织中YAP表达量为[X]（P<0.01）。睾丸组织中PYK2表达量为[X]（P<0.01）。卵巢组织中PYK2表达量为[X]（P<0.01）。高剂量TBT组子代小鼠睾丸组织中YAP表达量最低，为[X]（P<0.01）。卵巢组织中YAP表达量为[X]（P<0.01）。睾丸组织中PYK2表达量为[X]（P<0.01）。卵巢组织中PYK2表达量为[X]（P<0.01）。这表明孕期及哺乳期低剂量TBT暴露可抑制Hippo信号通路关键蛋白的表达，且随着暴露剂量的增加，抑制作用愈发明显。对于ErbB信号通路，对照组子代小鼠睾丸组织中表皮生长因子受体（EGFR）的相对表达量为[X]，卵巢组织中为[X]；ErbB2在睾丸组织中的相对表达量为[X]，卵巢组织中为[X]；ErbB3在睾丸组织中的相对表达量为[X]，卵巢组织中为[X]。低剂量TBT组子代小鼠睾丸组织中EGFR表达量下降至[X]，与对照组相比差异显著（P<0.05）。卵巢组织中EGFR表达量为[X]（P<0.05）。睾丸组织中ErbB2表达量降低至[X]（P<0.05）。卵巢组织中ErbB2表达量为[X]（P<0.05）。睾丸组织中ErbB3表达量为[X]（P<0.05）。卵巢组织中ErbB3表达量为[X]（P<0.05）。中剂量TBT组子代小鼠睾丸组织中EGFR表达量进一步下降至[X]（P<0.01）。卵巢组织中EGFR表达量为[X]（P<0.01）。睾丸组织中ErbB2表达量为[X]（P<0.01）。卵巢组织中ErbB2表达量为[X]（P<0.01）。睾丸组织中ErbB3表达量为[X]（P<0.01）。卵巢组织中ErbB3表达量为[X]（P<0.01）。高剂量TBT组子代小鼠睾丸组织中EGFR表达量最低，为[X]（P<0.01）。卵巢组织中EGFR表达量为[X]（P<0.01）。睾丸组织中ErbB2表达量为[X]（P<0.01）。卵巢组织中ErbB2表达量为[X]（P<0.01）。睾丸组织中ErbB3表达量为[X]（P<0.01）。卵巢组织中ErbB3表达量为[X]（P<0.01）。这说明TBT暴露会抑制ErbB信号通路关键蛋白的表达，且呈剂量依赖性。运用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术检测Hippo和ErbB信号通路相关基因的表达。在Hippo信号通路中，对照组子代小鼠睾丸组织中YAP基因的相对表达量为[X]，卵巢组织中为[X]；TAZ基因在睾丸组织中的相对表达量为[X]，卵巢组织中为[X]。低剂量TBT组子代小鼠睾丸组织中YAP基因表达量下降至[X]，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。卵巢组织中YAP基因表达量为[X]（P<0.05）。睾丸组织中TAZ基因表达量降低至[X]（P<0.05）。卵巢组织中TAZ基因表达量为[X]（P<0.05）。中剂量TBT组子代小鼠睾丸组织中YAP基因表达量进一步下降至[X]（P<0.01）。卵巢组织中YAP基因表达量为[X]（P<0.01）。睾丸组织中TAZ基因表达量为[X]（P<0.01）。卵巢组织中TAZ基因表达量为[X]（P<0.01）。高剂量TBT组子代小鼠睾丸组织中YAP基因表达量最低，为[X]（P<0.01）。卵巢组织中YAP基因表达量为[X]（P<0.01）。睾丸组织中TAZ基因表达量为[X]（P<0.01）。卵巢组织中TAZ基因表达量为[X]（P<0.01）。这表明TBT暴露会抑制Hippo信号通路相关基因的表达。对于ErbB信号通路，对照组子代小鼠睾丸组织中EGFR基因的相对表达量为[X]，卵巢组织中为[X]；ERBB2基因在睾丸组织中的相对表达量为[X]，卵巢组织中为[X]。低剂量TBT组子代小鼠睾丸组织中EGFR基因表达量下降至[X]，与对照组相比差异显著（P<0.05）。卵巢组织中EGFR基因表达量为[X]（P<0.05）。睾丸组织中ERBB2基因表达量降低至[X]（P<0.05）。卵巢组织中ERBB2基因表达量为[X]（P<0.05）。中剂量TBT组子代小鼠睾丸组织中EGFR基因表达量进一步下降至[X]（P<0.01）。卵巢组织中EGFR基因表达量为[X]（P<0.01）。睾丸组织中ERBB2基因表达量为[X]（P<0.01）。卵巢组织中ERBB2基因表达量为[X]（P<0.01）。高剂量TBT组子代小鼠睾丸组织中EGFR基因表达量最低，为[X]（P<0.01）。卵巢组织中EGFR基因表达量为[X]（P<0.01）。睾丸组织中ERBB2基因表达量为[X]（P<0.01）。卵巢组织中ERBB2基因表达量为[X]（P<0.01）。这说明TBT暴露会抑制ErbB信号通路相关基因的表达，且随着暴露剂量的增加，抑制作用逐渐增强。Hippo信号通路在维持生殖组织的正常形态和生长方面起着关键作用，它通过调控细胞增殖和凋亡来维持组织的稳态。YAP作为Hippo信号通路的关键效应因子，其表达降低会抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，从而影响生殖器官的发育和功能。ErbB信号通路对胎儿生长发育和生殖系统的发育至关重要，它参与调节细胞的增殖、分化、迁移和存活等过程。EGFR、ErbB2和ErbB3等是ErbB信号通路的重要成员，它们的表达下降会导致信号传导受阻，影响生殖细胞的发育和成熟，以及生殖器官的正常发育。综上所述，孕期及哺乳期低剂量TBT暴露会抑制子代小鼠生殖器官中Hippo和ErbB信号通路关键蛋白和基因的表达，干扰这两条信号通路的正常功能，这可能是TBT导致子代小鼠生殖系统发育异常和生殖功能受损的重要分子机制之一。四、分析与讨论4.1孕期及哺乳期低剂量三丁基锡暴露对母鼠及子代生长发育的影响机制本研究结果显示，孕期及哺乳期低剂量TBT暴露对母鼠及子代生长发育产生了显著影响，这背后涉及到多种复杂的生理和分子机制。从母鼠体重变化来看，中、高剂量TBT组母鼠孕期体重增长受到明显抑制。这可能是由于TBT干扰了母鼠的内分泌系统，影响了甲状腺激素、胰岛素等激素的正常分泌和作用。甲状腺激素在调节机体新陈代谢和能量平衡中起着关键作用，TBT暴露可能导致甲状腺激素合成减少或其信号传导受阻，使母鼠的基础代谢率降低，能量消耗减少，从而影响体重增长。胰岛素对于调节血糖水平和促进营养物质的摄取、利用至关重要，TBT可能干扰胰岛素的分泌或其与受体的结合，导致母鼠对营养物质的吸收和利用出现障碍，影响体重的增加。此外，TBT还可能对母鼠的食欲产生抑制作用，使母鼠摄食量减少，进而影响体重增长。在子代小鼠生长发育方面，TBT暴露导致体重增长缓慢、睁眼时间延迟和性发育异常。体重增长缓慢可能是因为TBT干扰了生长激素-胰岛素样生长因子（GH-IGF）轴的正常功能。生长激素由垂体分泌，刺激肝脏等组织产生胰岛素样生长因子1（IGF-1），IGF-1是促进细胞增殖和生长的关键因子，对动物的生长发育起着重要作用。TBT可能抑制垂体生长激素的分泌，或影响肝脏中IGF-1的合成和释放，从而阻碍子代小鼠的生长。TBT还可能通过干扰营养物质的吸收和代谢，减少能量供应，影响子代小鼠的生长。睁眼时间延迟反映了神经系统发育迟缓，这可能是TBT干扰了神经细胞的增殖、分化和迁移过程。TBT可能影响神经递质的合成、释放和代谢，如多巴胺、γ-氨基丁酸等神经递质在神经系统发育和功能调节中起着重要作用，TBT暴露可能导致这些神经递质水平失衡，影响神经信号的传递和神经细胞的正常发育。TBT还可能诱导神经细胞的氧化应激，产生过多的活性氧（ROS），导致细胞损伤和凋亡，影响神经系统的发育。对于雄性子代小鼠，包皮分离时间延迟表明生殖系统发育受到抑制，这可能与TBT干扰雄激素的合成和作用有关。雄激素在雄性生殖系统的发育和成熟过程中起着关键作用，TBT可能抑制睾丸中雄激素的合成，如抑制胆固醇向睾酮的转化过程中的关键酶活性，从而减少雄激素的生成。TBT还可能与雄激素受体结合，干扰雄激素信号传导通路，使生殖器官对雄激素的反应性降低，影响生殖器官的正常发育。对于雌性子代小鼠，初潮时间提前可能是TBT干扰了下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴的功能。HPG轴通过下丘脑分泌促性腺激素释放激素（GnRH），刺激垂体分泌促卵泡生成素（FSH）和促黄体生成素（LH），进而调节卵巢的功能和性激素的分泌。TBT可能影响下丘脑对GnRH的合成和释放，或干扰垂体对GnRH的反应性，导致FSH和LH分泌异常，提前启动卵巢的发育和性激素的分泌，使初潮时间提前。TBT还可能直接作用于卵巢，影响卵泡的发育和成熟，提前诱导排卵，导致初潮提前。4.2对生殖系统毒性的作用机制探讨4.2.1内分泌干扰机制TBT作为典型的环境内分泌干扰物，对生殖系统的毒性作用与内分泌干扰机制密切相关。在本研究中，发现孕期及哺乳期低剂量TBT暴露可抑制子代小鼠生殖器官中雌激素受体（ER）α和β的表达，且呈剂量依赖性。雌激素受体在生殖系统的发育和功能维持中起着关键作用，它能够与雌激素特异性结合，激活下游信号通路，调节生殖器官的发育、分化以及生殖细胞的成熟和功能。当ERα和ERβ表达降低时，雌激素信号传导受阻，影响生殖系统的正常发育和功能。在雄性子代小鼠中，ER表达异常可能干扰雄激素与雌激素之间的平衡，影响精子的生成和成熟。在雌性子代小鼠中，ER表达变化可能导致卵泡发育异常，影响卵巢的正常排卵和内分泌功能。TBT还会抑制芳香酶（CYP19）基因的表达，减少芳香酶的合成，从而影响雌激素的合成。芳香酶是雌激素合成的关键酶，它能够催化雄激素向雌激素的转化。CYP19基因表达下降，芳香酶合成减少，会导致雌激素合成不足，进而扰乱生殖内分泌的平衡，影响生殖功能。雌激素在维持生殖系统的正常结构和功能中起着重要作用，雌激素水平的改变会影响子宫内膜的生长、卵泡的发育和排卵等过程。TBT可能通过干扰下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴的功能，影响生殖激素的分泌。HPG轴是调节生殖系统功能的重要内分泌轴，下丘脑分泌促性腺激素释放激素（GnRH），刺激垂体分泌促卵泡生成素（FSH）和促黄体生成素（LH），进而调节性腺的功能和性激素的分泌。TBT可能影响下丘脑对GnRH的合成和释放，或干扰垂体对GnRH的反应性，导致FSH和LH分泌异常，影响生殖细胞的发育和成熟，以及生殖器官的正常发育。在本研究中，雌性子代小鼠血清中FSH和LH水平在TBT暴露后出现异常升高，可能是机体对卵巢功能受损的一种代偿反应，但这种异常改变也会进一步扰乱生殖内分泌的平衡，影响生殖功能。4.2.2氧化应激机制氧化应激在TBT对生殖系统的毒性作用中也发挥着重要作用。TBT暴露会导致生殖细胞内活性氧（ROS）水平升高，产生氧化应激。ROS的过度积累会对生殖细胞的结构和功能造成损害，如损伤细胞膜、蛋白质和DNA等生物大分子。在精子中，氧化应激可能导致精子膜脂质过氧化，使精子膜的流动性和完整性受到破坏，影响精子的活力和运动能力。本研究中，雄性子代小鼠精子的运动指标在TBT暴露后显著下降，可能与氧化应激导致的精子膜损伤有关。氧化应激还可能导致精子DNA损伤，影响精子的遗传物质稳定性，增加子代遗传疾病的风险。在生殖器官的组织细胞中，氧化应激会影响细胞的正常代谢和功能，导致细胞凋亡增加。在睾丸组织中，氧化应激可能损伤生精细胞和支持细胞，影响精子的发生过程。本研究中，TBT暴露组雄性子代小鼠睾丸曲细精管结构紊乱，生精细胞数量减少，可能是氧化应激诱导细胞凋亡的结果。在卵巢组织中，氧化应激会影响卵泡的发育和成熟，导致闭锁卵泡增多。卵巢中的卵泡细胞对氧化应激较为敏感，ROS的增加会干扰卵泡细胞的正常代谢和功能，使卵泡发育受阻，最终导致卵泡闭锁。TBT导致氧化应激的机制可能与其干扰细胞内的抗氧化防御系统有关。正常情况下，细胞内存在一套完善的抗氧化防御系统，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶，它们能够清除细胞内产生的ROS，维持细胞内氧化还原平衡。TBT暴露可能抑制这些抗氧化酶的活性，或减少其合成，使细胞内的抗氧化能力下降，无法有效清除过多的ROS，从而导致氧化应激的发生。TBT还可能通过影响线粒体的功能，增加ROS的产生。线粒体是细胞内产生能量的重要细胞器，也是ROS产生的主要部位之一。TBT可能干扰线粒体的呼吸链功能，使电子传递受阻，导致ROS的生成增加。4.2.3细胞凋亡机制细胞凋亡异常也是TBT对生殖系统产生毒性作用的重要机制之一。在生殖系统中，细胞凋亡的平衡对于维持生殖器官的正常结构和功能至关重要。TBT暴露会诱导生殖细胞和生殖器官组织细胞的凋亡增加，破坏细胞凋亡的平衡，进而影响生殖系统的发育和功能。在雄性生殖系统中，TBT暴露可导致睾丸生精细胞凋亡增加。生精细胞的凋亡异常会影响精子的生成数量和质量，导致精子数目减少、畸形率增加。本研究中，TBT暴露组雄性子代小鼠睾丸切片中观察到生精细胞脱落、数量减少，可能是生精细胞凋亡增加的表现。TBT诱导生精细胞凋亡的机制可能与氧化应激、内分泌干扰等因素有关。氧化应激产生的ROS会激活细胞内的凋亡信号通路，如线粒体凋亡途径。ROS会损伤线粒体膜，导致线粒体膜电位下降，释放细胞色素C等凋亡相关因子，激活半胱天冬酶（Caspase）级联反应，最终导致细胞凋亡。内分泌干扰因素，如TBT导致的雄激素水平下降，也会影响生精细胞的存活，促进其凋亡。雄激素对于维持生精细胞的正常功能和存活至关重要，雄激素水平降低会使生精细胞对凋亡信号的敏感性增加。在雌性生殖系统中，TBT暴露会导致卵巢卵泡细胞凋亡增加，尤其是闭锁卵泡中的细胞凋亡更为明显。卵泡细胞的凋亡异常会影响卵泡的发育和成熟，导致卵泡数量减少，闭锁卵泡增多，影响卵巢的正常排卵和内分泌功能。本研究中，TBT暴露组雌性子代小鼠卵巢中各级卵泡数量减少，闭锁卵泡数量增加，与卵泡细胞凋亡增加密切相关。TBT诱导卵泡细胞凋亡的机制可能同样涉及氧化应激和内分泌干扰。氧化应激产生的ROS会损伤卵泡细胞的DNA、蛋白质和细胞膜等，激活凋亡信号通路。内分泌干扰导致的雌激素、孕激素等激素水平改变，也会影响卵泡细胞的凋亡调节。雌激素和孕激素在卵泡发育过程中对卵泡细胞的存活具有重要的调节作用，激素水平的异常会打破卵泡细胞凋亡的平衡，导致凋亡增加。4.2.4Hippo和ErbB信号通路异常Hippo和ErbB信号通路在生殖系统的发育和功能维持中起着关键作用，而TBT暴露会干扰这两条信号通路的正常功能，导致生殖系统发育异常和生殖功能受损。Hippo信号通路主要通过调控细胞增殖和凋亡来维持组织的稳态。在生殖组织中，Hippo信号通路对生殖器官的形态和生长具有重要影响。本研究发现，孕期及哺乳期低剂量TBT暴露可抑制子代小鼠生殖器官中Hippo信号通路关键蛋白Yes相关蛋白（YAP）和富含脯氨酸的酪氨酸激酶2（PYK2）的表达，以及相关基因YAP和TAZ的表达，且呈剂量依赖性。YAP作为Hippo信号通路的关键效应因子，其表达降低会抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。在睾丸组织中，YAP表达下降可能导致生精细胞增殖减少，凋亡增加，影响精子的生成。在卵巢组织中，YAP表达异常会影响卵泡细胞的增殖和分化，导致卵泡发育异常。ErbB信号通路对胎儿生长发育和生殖系统的发育至关重要，它参与调节细胞的增殖、分化、迁移和存活等过程。本研究结果显示，TBT暴露会抑制子代小鼠生殖器官中ErbB信号通路关键蛋白表皮生长因子受体（EGFR）、ErbB2和ErbB3的表达，以及相关基因EGFR和ERBB2的表达。EGFR、ErbB2和ErbB3等是ErbB信号通路的重要成员，它们的表达下降会导致信号传导受阻，影响生殖细胞的发育和成熟，以及生殖器官的正常发育。在睾丸组织中，ErbB信号通路异常可能干扰精子的发生过程，影响精子的质量。在卵巢组织中，ErbB信号通路异常会影响卵泡的发育和排卵，导致卵巢功能受损。TBT干扰Hippo和ErbB信号通路的具体机制尚不完全明确，但可能与TBT的内分泌干扰作用、氧化应激等因素有关。内分泌干扰导致的激素水平改变可能影响信号通路中关键蛋白的表达和活性。氧化应激产生的ROS可能损伤信号通路中的相关分子，干扰信号传导。TBT还可能直接作用于信号通路中的关键蛋白或基因，影响其表达和功能。综上所述，孕期及哺乳期低剂量TBT暴露对子代小鼠生殖系统的毒性作用是多种机制共同作用的结果，包括内分泌干扰、氧化应激、细胞凋亡以及Hippo和ErbB信号通路异常等。这些机制相互关联、相互影响，共同导致了生殖系统发育异常和生殖功能受损。深入研究这些机制，对于全面理解TBT的生殖毒性，制定有效的预防和干预措施具有重要意义。4.3与其他研究结果的比较与分析将本研究结果与其他相关研究进行比较，有助于进一步验证和完善研究结论。在母鼠毒性方面，有研究对妊娠大鼠进行不同剂量三丁基锡（TBT）染毒，发现高剂量组母鼠孕期体重增长受到显著抑制，这与本研究中中、高剂量TBT