宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌生物被膜相关基因及耐药特征解析

宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌生物被膜相关基因及耐药特征解析一、引言1.1研究背景与意义金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）作为一种革兰氏阳性菌，广泛分布于自然界，是重要的人畜共患病原菌。其不仅能在人和动物的皮肤、黏膜等部位定植，还极易引发多种类型的感染性疾病。在人类医学领域，金黄色葡萄球菌可导致从轻微的皮肤软组织感染，如疖、痈，到严重的全身性感染，如败血症、心内膜炎等一系列疾病，严重威胁人类健康。在畜牧业中，金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎、肉牛呼吸道感染、犊牛腹泻等多种疾病的主要病原菌之一。以奶牛乳腺炎为例，感染金黄色葡萄球菌后，奶牛产奶量大幅下降，牛奶品质变差，含有大量病原菌及其代谢产物，导致乳制品质量安全受到严重影响，不仅造成巨大的经济损失，还对公共卫生安全构成潜在威胁。据统计，全球每年因奶牛乳腺炎造成的经济损失高达数十亿美元。近年来，随着抗生素在畜牧业中的广泛应用，牛源金黄色葡萄球菌的耐药性问题日益严峻。大量研究表明，牛源金黄色葡萄球菌对青霉素、头孢菌素、四环素、红霉素等多种常用抗生素的耐药率不断攀升，甚至出现了多重耐药菌株，给临床治疗带来极大困难。耐药菌株的出现不仅增加了治疗成本和治疗周期，还可能导致治疗失败，使患病动物病情恶化，进一步传播病原菌，加剧疫情的扩散。更为严重的是，耐药基因可通过食物链传递给人类，对人类健康构成潜在威胁，导致人类感染耐药菌的风险增加，使原本有效的抗生素治疗失效。宁夏地区作为我国重要的畜牧业基地之一，牛养殖产业规模庞大，在当地农业经济中占据重要地位。然而，目前宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌的研究相对较少，尤其是关于该地区牛源金黄色葡萄球菌生物被膜相关基因检测及耐药性的系统研究尚显匮乏。深入了解宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌的生物被膜形成机制及其耐药特性，对于制定针对性的防控措施，保障宁夏地区养牛业的健康发展，提高畜产品质量安全水平，以及维护公共卫生安全均具有重要的现实意义。一方面，通过检测生物被膜相关基因，明确其在菌株中的分布情况，有助于揭示生物被膜的形成机制，为开发有效的生物被膜干预策略提供理论依据。另一方面，全面掌握该地区牛源金黄色葡萄球菌的耐药谱和耐药机制，能够为临床合理用药提供科学指导，减少抗生素滥用，降低耐药菌株的产生和传播风险，从而实现畜牧业的可持续发展，保护人类健康免受耐药菌的侵害。1.2国内外研究现状在国外，牛源金黄色葡萄球菌的研究起步较早，且在多个方面取得了丰硕成果。在生物被膜相关基因检测方面，国外学者通过分子生物学技术，如聚合酶链式反应（PCR）及其衍生技术，对多种生物被膜相关基因进行了深入研究。研究发现，ica操纵子（包括icaA、icaB、icaC、icaD基因）在牛源金黄色葡萄球菌生物被膜形成中起着关键作用，其编码的蛋白参与胞外多糖的合成，而胞外多糖是生物被膜的重要组成部分。当ica操纵子中的基因发生突变或缺失时，菌株形成生物被膜的能力显著下降。同时，atl基因编码的自溶素也与生物被膜形成密切相关，自溶素可调节细菌细胞壁的代谢，影响细菌的聚集和黏附，进而影响生物被膜的形成过程。此外，sarA、agr等调控基因也被证实通过调节相关毒力因子的表达，间接影响生物被膜的形成。在耐药性研究方面，国外对牛源金黄色葡萄球菌的耐药谱和耐药机制进行了广泛而深入的探究。大量研究表明，牛源金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类、四环素类、大环内酯类等多种抗生素呈现出不同程度的耐药性。其中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的出现备受关注，其携带的mecA基因编码的青霉素结合蛋白2a（PBP2a），能够降低与β-内酰胺类抗生素的亲和力，从而导致对该类抗生素耐药。此外，通过主动外排机制，牛源金黄色葡萄球菌可将进入细胞内的抗生素排出体外，使其细胞内药物浓度降低，无法达到有效杀菌浓度，进而产生耐药性，如norA基因编码的外排泵可对氟喹诺酮类抗生素进行外排。还有一些菌株通过修饰抗生素作用靶点，使其无法与抗生素结合，从而产生耐药性，例如erm基因编码的甲基化酶可修饰核糖体23SrRNA，使大环内酯类抗生素无法与核糖体结合，导致耐药。国内对牛源金黄色葡萄球菌的研究近年来也逐渐增多。在生物被膜相关基因检测方面，国内学者运用PCR、实时荧光定量PCR等技术，对牛源金黄色葡萄球菌的生物被膜相关基因进行检测和分析。研究结果显示，不同地区牛源金黄色葡萄球菌生物被膜相关基因的检出率存在一定差异，这可能与地区养殖环境、抗生素使用情况等因素有关。例如，在部分养殖密集地区，由于抗生素使用频繁，菌株的生物被膜相关基因检出率相对较高。在耐药性研究方面，国内研究表明，我国牛源金黄色葡萄球菌耐药形势严峻，耐药率呈上升趋势，且多重耐药现象普遍存在。对青霉素、红霉素等常用抗生素的耐药率较高，部分地区甚至超过80%。同时，国内也在积极探索牛源金黄色葡萄球菌的耐药机制，除了与国外类似的耐药机制外，还发现一些独特的耐药基因和耐药方式。尽管国内外在牛源金黄色葡萄球菌生物被膜相关基因检测及耐药性研究方面取得了一定进展，但仍存在一些不足之处。在生物被膜相关基因检测方面，目前对于一些新发现的基因或基因位点在生物被膜形成中的具体作用机制尚不完全清楚，有待进一步深入研究。不同地区牛源金黄色葡萄球菌生物被膜相关基因的分布特征及影响因素研究还不够系统全面，难以形成统一的理论和规律。在耐药性研究方面，虽然对常见耐药机制有了一定了解，但对于新型耐药机制以及耐药基因的传播规律研究还相对薄弱。牛源金黄色葡萄球菌耐药性与生物被膜形成之间的相互关系研究较少，二者之间复杂的调控网络和作用机制尚未明确。针对宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌的研究相对匮乏，该地区牛源金黄色葡萄球菌的生物被膜相关基因分布及耐药特征缺乏系统研究，无法为当地养牛业的疾病防控提供有力的理论支持和实践指导。1.3研究目标与内容本研究旨在全面、系统地揭示宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌的生物被膜形成机制及其耐药特性，为该地区养牛业相关疾病的防控提供坚实的理论依据和切实可行的实践指导。具体研究目标如下：通过先进的分子生物学技术，对宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌的生物被膜相关基因进行精准检测，明确其在菌株中的分布规律和携带情况，深入探究这些基因在生物被膜形成过程中的具体作用机制。运用规范的药敏试验方法，全面分析宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌对多种常用抗生素的耐药性，绘制详细的耐药谱，深入剖析其耐药机制，为临床合理用药提供科学、准确的指导。综合生物被膜相关基因检测结果与耐药性分析数据，深入探讨二者之间的内在联系，为制定针对牛源金黄色葡萄球菌感染的有效防控策略提供全面、深入的理论支持。为实现上述研究目标，本研究将开展以下内容的研究：从宁夏地区不同规模、不同养殖模式的养牛场中，采集具有代表性的牛源样本，包括患病牛的病灶组织、鼻腔分泌物、粪便以及健康牛的体表拭子等。运用传统的细菌分离培养方法，结合先进的分子生物学鉴定技术，如16SrRNA基因测序、多位点序列分型（MLST）等，从采集的样本中高效、准确地分离鉴定出牛源金黄色葡萄球菌菌株。针对已鉴定的牛源金黄色葡萄球菌菌株，精心设计并合成特异性引物，采用聚合酶链式反应（PCR）技术，对ica操纵子（icaA、icaB、icaC、icaD）、atl、sarA、agr等多种生物被膜相关基因进行灵敏、准确的检测。运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，对阳性菌株中的生物被膜相关基因进行精确的表达水平分析，深入研究基因表达与生物被膜形成能力之间的定量关系。采用国际认可的药敏试验方法，如肉汤微量稀释法和纸片扩散法，依据美国临床实验室标准化协会（CLSI）的标准，对分离得到的牛源金黄色葡萄球菌菌株进行系统的药敏试验，测定其对青霉素、头孢菌素、四环素、红霉素、氟喹诺酮类等多种常用抗生素的最小抑菌浓度（MIC）和耐药率。通过分子生物学方法，如PCR扩增、基因测序和基因芯片技术等，对耐药菌株中的耐药基因进行全面、深入的检测和分析，包括β-内酰胺类耐药基因（mecA、blaZ等）、四环素类耐药基因（tetM、tetK等）、大环内酯类耐药基因（ermA、ermB等）以及氟喹诺酮类耐药基因（gyrA、parC等），深入探究其耐药机制。综合生物被膜相关基因检测结果和耐药性分析数据，运用统计学方法和生物信息学分析手段，深入分析二者之间的相关性，如生物被膜形成能力与耐药率之间的关联、生物被膜相关基因表达水平与耐药基因携带情况之间的关系等，深入探讨牛源金黄色葡萄球菌生物被膜形成与耐药性之间的内在联系和作用机制。根据研究结果，结合宁夏地区养牛业的实际生产情况和特点，制定具有针对性、实用性和可操作性的防控策略和建议，包括合理使用抗生素、优化养殖环境、加强饲养管理、建立有效的监测预警体系等，为宁夏地区养牛业的健康、可持续发展提供有力的技术支持。对研究结果进行全面、深入的讨论和分析，与国内外相关研究成果进行广泛、深入的比较和交流，总结本研究的创新点、不足之处以及对未来研究的展望，为进一步深入研究牛源金黄色葡萄球菌的生物学特性和防控措施提供有益的参考。1.4研究方法与技术路线本研究将严格遵循科学、严谨的研究方法，确保研究结果的准确性和可靠性。在样本采集方面，于2024年3月至2024年10月期间，从宁夏地区的银川、吴忠、固原、中卫等主要养牛区域，选取30个不同规模和养殖模式的养牛场，包括大型规模化养殖场（存栏量1000头以上）、中型养殖场（存栏量500-1000头）和小型养殖场（存栏量500头以下）。从每个养殖场中随机采集10-15份牛源样本，包括患有呼吸道感染、乳腺炎、腹泻等疾病牛的病灶组织、鼻腔分泌物、粪便样本，以及健康牛的体表拭子，共计采集样本约400份。将采集的样本置于无菌采样管中，加入适量的保存液，如含抗生素的磷酸盐缓冲液（PBS），以防止杂菌污染和样本腐败。样本采集后，立即放入冰盒中低温保存，并在4小时内运送至实验室进行处理。菌种鉴定过程中，先将采集的样本接种于血琼脂平板和Baird-Parker培养基平板上，置于37℃恒温培养箱中培养18-24小时，观察菌落形态。金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上形成圆形、凸起、湿润、金黄色、周围有明显β-溶血环的菌落；在Baird-Parker培养基平板上形成黑色、有光泽、周围有透明溶血圈的菌落。挑取疑似金黄色葡萄球菌的单菌落，进行革兰氏染色和触酶试验。革兰氏染色后，金黄色葡萄球菌呈革兰氏阳性，镜下可见葡萄串状排列的球菌；触酶试验中，该菌可产生过氧化氢酶，使3%过氧化氢溶液迅速产生气泡。对于初步鉴定为金黄色葡萄球菌的菌株，进一步提取其基因组DNA，采用16SrRNA基因测序进行分子生物学鉴定。利用通用引物对16SrRNA基因进行PCR扩增，扩增产物经纯化后进行测序，将测序结果在NCBI数据库中进行比对分析，确定菌株的种属。针对生物被膜相关基因检测，依据GenBank中已公布的icaA、icaB、icaC、icaD、atl、sarA、agr等生物被膜相关基因序列，使用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。引物设计时，充分考虑引物的长度、退火温度、GC含量等因素，确保引物的特异性和扩增效率。以提取的金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL，包括10×PCR缓冲液2.5μL、dNTPs（2.5mM）2μL、上下游引物（10μM）各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL、模板DNA1μL，加ddH₂O补足至25μL。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，根据引物退火温度进行退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；72℃终延伸10分钟。扩增结束后，取5μLPCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察结果，与DNAMarker对比，判断目的基因是否扩增成功。对于PCR扩增阳性的菌株，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术进一步分析生物被膜相关基因的表达水平。以16SrRNA基因作为内参基因，使用SYBRGreen荧光染料法进行qRT-PCR反应。反应体系为20μL，包括SYBRGreenMasterMix10μL、上下游引物（10μM）各0.5μL、模板cDNA1μL，加ddH₂O补足至20μL。反应条件为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火30秒，共40个循环。利用2⁻ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，分析基因表达与生物被膜形成能力之间的关系。耐药性试验时，采用肉汤微量稀释法和纸片扩散法相结合的方式，依据美国临床实验室标准化协会（CLSI）的标准，对分离得到的牛源金黄色葡萄球菌菌株进行药敏试验。选取青霉素、苯唑西林、头孢噻呋、四环素、红霉素、克林霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、环丙沙星等10种常用抗生素。肉汤微量稀释法中，将抗生素用无菌肉汤进行倍比稀释，制备成不同浓度的抗生素溶液，然后将菌液加入到含有不同浓度抗生素的96孔微量板中，使每孔最终菌液浓度为5×10⁵CFU/mL。将微量板置于37℃恒温培养箱中培养18-24小时，观察细菌生长情况，以无细菌生长的最低抗生素浓度为最小抑菌浓度（MIC）。纸片扩散法中，将菌液均匀涂布于Mueller-Hinton琼脂平板上，待菌液干燥后，将含有不同抗生素的药敏纸片贴于平板表面，置于37℃恒温培养箱中培养18-24小时。测量抑菌圈直径，根据CLSI标准判断菌株对各抗生素的耐药性，分为敏感（S）、中介（I）和耐药（R）。对于耐药菌株，通过分子生物学方法检测耐药基因。设计并合成针对β-内酰胺类耐药基因（mecA、blaZ等）、四环素类耐药基因（tetM、tetK等）、大环内酯类耐药基因（ermA、ermB等）以及氟喹诺酮类耐药基因（gyrA、parC等）的特异性引物，采用PCR扩增和基因测序技术，检测耐药基因的携带情况，分析耐药机制。本研究的技术路线如图1-1所示，从样本采集开始，经过菌种鉴定、生物被膜相关基因检测和耐药性试验等多个环节，逐步深入探究宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌的生物被膜形成机制及其耐药特性。\begin{figure}[h]\centering\includegraphics[width=12cm]{技术路线图.png}\caption{ç

”究技术路线图}\end{figure}二、材料与方法2.1试验材料2.1.1样品来源于2024年3月至2024年10月，从宁夏地区银川、吴忠、固原、中卫等主要养牛区域的30个不同规模和养殖模式的养牛场采集牛源样本。其中大型规模化养殖场（存栏量1000头以上）10个，中型养殖场（存栏量500-1000头）10个，小型养殖场（存栏量500头以下）10个。从每个养殖场随机采集10-15份牛源样本，包括患有呼吸道感染、乳腺炎、腹泻等疾病牛的病灶组织、鼻腔分泌物、粪便样本，以及健康牛的体表拭子，共计采集样本400份。采集的样本置于无菌采样管中，加入适量含抗生素的磷酸盐缓冲液（PBS）保存液，防止杂菌污染和样本腐败。样本采集后立即放入冰盒中低温保存，并在4小时内运送至实验室进行处理。2.1.2培养基与试剂血琼脂平板培养基购自青岛海博生物技术有限公司，主要成分包括胰蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化钠、琼脂、脱纤维羊血等，用于金黄色葡萄球菌的初次分离培养，其富含多种营养成分，能支持金黄色葡萄球菌的良好生长，并通过羊血中的红细胞，可观察到菌株的溶血特性，有助于初步鉴别。Baird-Parker培养基同样购自青岛海博生物技术有限公司，由胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、丙酮酸钠、甘氨酸、氯化锂、琼脂等组成，该培养基对金黄色葡萄球菌具有选择性，可抑制其他杂菌生长，利于金黄色葡萄球菌的分离纯化，其菌落特征明显，有助于进一步确认目标菌株。营养肉汤培养基主要成分有蛋白胨、牛肉膏、氯化钠等，用于细菌的增菌培养，为细菌生长提供基本的营养物质。革兰氏染色液购自北京索莱宝科技有限公司，包括结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红染液，用于对分离菌株进行革兰氏染色，以判断其革兰氏属性，是细菌分类鉴定的重要依据。3%过氧化氢溶液用于触酶试验，可检测菌株是否产生过氧化氢酶，金黄色葡萄球菌为触酶阳性，该试验操作简便，结果直观。细菌基因组DNA提取试剂盒选用天根生化科技（北京）有限公司的DP302细菌基因组DNA提取试剂盒，可高效、快速地从细菌中提取高质量的基因组DNA，满足后续分子生物学试验的需求。PCR扩增相关试剂，如TaqDNA聚合酶、dNTPs、10×PCR缓冲液等均购自宝生物工程（大连）有限公司，这些试剂质量可靠，扩增效率高，保证了PCR反应的顺利进行。药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司，涵盖青霉素（10U）、苯唑西林（1μg）、头孢噻呋（30μg）、四环素（30μg）、红霉素（15μg）、克林霉素（2μg）、氟苯尼考（30μg）、恩诺沙星（5μg）、环丙沙星（5μg）等常用抗生素，用于纸片扩散法药敏试验，判断菌株对不同抗生素的敏感性。Mueller-Hinton琼脂培养基购自青岛海博生物技术有限公司，用于药敏试验，其成分和质量符合美国临床实验室标准化协会（CLSI）标准，能保证药敏试验结果的准确性和可靠性。2.1.3仪器设备使用上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产的YXQ-LS-50SII型高压蒸汽灭菌器对培养基、试剂、耗材等进行灭菌处理，确保试验材料的无菌状态。SW-CJ-2FD型双人双面净化工作台购自苏州净化设备有限公司，为试验操作提供无菌的工作环境，有效防止杂菌污染。由上海一恒科学仪器有限公司生产的DHG-9076A型恒温培养箱，用于细菌的培养，可精确控制温度，为细菌生长提供适宜的培养条件。湘仪离心机仪器有限公司的TDZ5-WS型低速离心机，用于样本的离心分离，可快速分离菌体和上清液。伯乐生命医学产品（上海）有限公司的CFX96Touch实时荧光定量PCR仪，用于生物被膜相关基因的实时荧光定量PCR检测，具有灵敏度高、准确性好、重复性强等优点。北京六一生物科技有限公司的DYY-6C型电泳仪和JY04S-3C型水平电泳槽，用于PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析，可直观地观察目的基因的扩增情况。此外，还配备了电子天平、移液器、冰箱、恒温振荡器等常用仪器设备，满足试验中的称量、移液、样品保存和振荡培养等需求。2.1.4引物设计与合成根据GenBank中已公布的icaA、icaB、icaC、icaD、atl、sarA、agr等生物被膜相关基因序列，运用PrimerPremier5.0软件进行特异性引物设计。引物设计时充分考虑引物的长度、退火温度、GC含量等因素，确保引物的特异性和扩增效率。引物序列见表2-1。\begin{table}[h]\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|}\hline基å›

&引物序列（5'-3'）&产物长度（bp）&退火温度（℃）\\\hlineicaA&F:ATGCTGCTGATGATGCTGAC&512&58\\&R:TTATCCAGCGTTGCTGTTGC&&\\\hlineicaB&F:AACGCTGACGATGCTGACTA&456&56\\&R:TTCTGCTGCTGATGCTGACT&&\\\hlineicaC&F:ATGCTGCTGATGATGCTGAC&389&58\\&R:TTATCCAGCGTTGCTGTTGC&&\\\hlineicaD&F:AACGCTGACGATGCTGACTA&420&56\\&R:TTCTGCTGCTGATGCTGACT&&\\\hlineatl&F:ATGAGTGGCTGCTGATGATG&620&57\\&R:TTAGCGTTGCTGTTGCTGTA&&\\\hlinesarA&F:AACGCTGACGATGCTGACTA&535&56\\&R:TTCTGCTGCTGATGCTGACT&&\\\hlineagr&F:ATGAGTGGCTGCTGATGATG&480&57\\&R:TTAGCGTTGCTGTTGCTGTA&&\\\hline\end{tabular}\caption{生物被膜相关基å›

引物序列}\end{table}引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成后经PAGE纯化，保证引物的纯度和质量。引物溶解于无菌去离子水中，配制成10μM的储存液，保存于-20℃冰箱备用。2.2试验方法2.2.1样品采集与处理在采集牛源样本时，针对患有呼吸道感染的牛，使用无菌棉拭子深入鼻腔内部，轻轻旋转擦拭，采集鼻腔分泌物样本。对于患有乳腺炎的奶牛，在采样前，先用75%酒精棉球仔细擦拭乳头表面进行消毒，待酒精挥发干燥后，弃去最初挤出的2-3把乳汁，然后用无菌采样瓶收集5-10mL乳汁样本。对于患有腹泻的牛，用无菌采样勺从新鲜粪便的内部不同部位采集约5g粪便样本，放入无菌采样管中。对于健康牛的体表拭子采集，选取牛的颈部、背部等部位，用无菌棉拭子在皮肤表面来回擦拭5-10次，确保充分接触皮肤表面微生物，然后将拭子放入装有无菌生理盐水的采样管中。采集的样本在运输过程中始终保持低温环境，放入冰盒中，确保温度维持在0-4℃。到达实验室后，若不能立即进行处理，将样本保存于-20℃冰箱中，避免样本中微生物的生长和代谢变化，确保后续试验的准确性和可靠性。2.2.2金黄色葡萄球菌的分离与鉴定将采集的样本分别接种于血琼脂平板和Baird-Parker培养基平板上。在接种过程中，使用无菌移液器吸取适量样本悬液，均匀涂布于平板表面，确保样本充分分散。将接种后的平板置于37℃恒温培养箱中培养18-24小时。在血琼脂平板上，若观察到圆形、凸起、湿润、金黄色且周围有明显β-溶血环的菌落，初步怀疑为金黄色葡萄球菌。在Baird-Parker培养基平板上，若出现黑色、有光泽、周围有透明溶血圈的菌落，则进一步增加了该菌落为金黄色葡萄球菌的可能性。挑取疑似金黄色葡萄球菌的单菌落，进行革兰氏染色。染色过程严格按照操作步骤进行，先用结晶紫染液染色1分钟，水洗后用碘液媒染1分钟，再用95%乙醇脱色约30秒，最后用番红染液复染1分钟。在显微镜下观察，若菌体呈紫色，且排列成葡萄串状，则为革兰氏阳性球菌，符合金黄色葡萄球菌的特征。同时进行触酶试验，取疑似菌落置于洁净载玻片上，滴加3%过氧化氢溶液，若立即产生大量气泡，表明该菌为触酶阳性，进一步支持其为金黄色葡萄球菌。对于初步鉴定为金黄色葡萄球菌的菌株，提取其基因组DNA。使用天根生化科技（北京）有限公司的DP302细菌基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书的步骤进行操作。首先将菌株接种于营养肉汤培养基中，37℃振荡培养18-24小时，使菌株充分生长。然后取1-2mL菌液，12000rpm离心5分钟，弃去上清液，收集菌体沉淀。加入适量缓冲液悬浮菌体，依次加入蛋白酶K、裂解液等试剂，充分混匀后，在56℃水浴锅中孵育10-15分钟，使细胞充分裂解。经过离心、洗涤等步骤，最后用洗脱缓冲液洗脱DNA，得到高质量的基因组DNA。采用16SrRNA基因测序进行分子生物学鉴定。以提取的基因组DNA为模板，使用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL，包括10×PCR缓冲液2.5μL、dNTPs（2.5mM）2μL、上下游引物（10μM）各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL、模板DNA1μL，加ddH₂O补足至25μL。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟，共35个循环；72℃终延伸10分钟。扩增结束后，取5μLPCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察结果，确认扩增产物的大小是否正确。将扩增得到的16SrRNA基因片段送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，与已知的金黄色葡萄球菌16SrRNA基因序列进行相似度匹配，若相似度达到99%以上，则可确定该菌株为金黄色葡萄球菌。2.2.3生物被膜形成能力检测采用微量滴定板法检测菌株的生物被膜形成能力。将分离鉴定得到的金黄色葡萄球菌菌株接种于营养肉汤培养基中，37℃振荡培养18-24小时，使菌株处于对数生长期。用无菌生理盐水将菌液稀释至OD₆₀₀为0.5，相当于5×10⁸CFU/mL。取100μL稀释后的菌液加入到96孔微量滴定板的每个孔中，每个菌株设置3个重复孔。同时设置阴性对照孔，加入100μL无菌营养肉汤培养基。将微量滴定板置于37℃恒温培养箱中静置培养24小时。培养结束后，小心吸取孔内培养液，避免破坏可能形成的生物被膜。用无菌PBS缓冲液轻轻冲洗每个孔3次，以去除未黏附的浮游细菌。然后每孔加入200μL0.1%结晶紫溶液，室温下染色15分钟。染色结束后，倒掉结晶紫溶液，用无菌水冲洗孔板，直至冲洗液无色为止，以去除多余的结晶紫。将孔板倒置在吸水纸上，晾干。最后每孔加入200μL95%乙醇，振荡10分钟，使结合在生物被膜上的结晶紫溶解。使用酶标仪在570nm波长处测定各孔的吸光度值（OD₅₇₀）。根据OD₅₇₀值判断菌株的生物被膜形成能力。OD₅₇₀值小于0.12为无生物被膜形成能力；OD₅₇₀值在0.12-0.24之间为弱生物被膜形成能力；OD₅₇₀值在0.24-0.48之间为中等生物被膜形成能力；OD₅₇₀值大于0.48为强生物被膜形成能力。2.2.4生物被膜相关基因检测运用PCR技术检测icaA、icaD、fnbA等生物被膜相关基因。以提取的金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL，包括10×PCR缓冲液2.5μL、dNTPs（2.5mM）2μL、上下游引物（10μM）各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL、模板DNA1μL，加ddH₂O补足至25μL。针对不同的生物被膜相关基因，设置不同的退火温度进行PCR反应条件的优化。以icaA基因扩增为例，PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；72℃终延伸10分钟。其他基因的PCR反应条件根据引物的退火温度进行相应调整。扩增结束后，取5μLPCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。在电泳过程中，使用1×TAE缓冲液作为电泳缓冲液，将PCR产物与DNAMarker一起加入到琼脂糖凝胶的加样孔中，在120V电压下电泳30-40分钟。电泳结束后，将凝胶放入含有核酸染料的溶液中染色15-20分钟，然后在凝胶成像系统下观察结果。与DNAMarker对比，若在预期位置出现明亮的条带，则表明目的基因扩增成功。根据电泳结果，判断菌株是否携带相应的生物被膜相关基因。2.2.5耐药性检测采用纸片扩散法和肉汤微量稀释法进行药敏试验。纸片扩散法中，选取青霉素、苯唑西林、头孢噻呋、四环素、红霉素、克林霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、环丙沙星等10种常用抗生素的药敏纸片。将分离得到的金黄色葡萄球菌菌株接种于营养肉汤培养基中，37℃振荡培养18-24小时，用无菌生理盐水将菌液调整至0.5麦氏浊度，相当于1.5×10⁸CFU/mL。用无菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上挤压去除多余菌液，然后在Mueller-Hinton琼脂平板表面均匀涂布3次，每次旋转平板60度，确保接种菌的均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。待菌液干燥后，用镊子将药敏纸片贴于平板表面，各纸片中心相距应大于24mm，通常90mm平板至多放置6个纸片。将平板置于37℃恒温培养箱中培养18-24小时。培养结束后，用游标卡尺测量抑菌圈直径，依据美国临床实验室标准化协会（CLSI）的标准判断菌株对各抗生素的耐药性，分为敏感（S）、中介（I）和耐药（R）。肉汤微量稀释法中，将上述10种抗生素用无菌Mueller-Hinton肉汤进行倍比稀释，制备成不同浓度的抗生素溶液。将菌液加入到含有不同浓度抗生素的96孔微量板中，使每孔最终菌液浓度为5×10⁵CFU/mL，每孔总体积为200μL。同时设置阳性对照孔（加入菌液和无菌Mueller-Hinton肉汤，不含抗生素）和阴性对照孔（只加入无菌Mueller-Hinton肉汤，不含菌液和抗生素）。将微量板置于37℃恒温培养箱中培养18-24小时。培养结束后，观察细菌生长情况，以无细菌生长的最低抗生素浓度为最小抑菌浓度（MIC）。根据CLSI标准，判断菌株对各抗生素的耐药性。对耐药性检测结果进行分析，统计菌株对不同抗生素的耐药率、中介率和敏感率。分析耐药谱，了解宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌对不同类别抗生素的耐药特点和趋势。同时，对比不同养殖场、不同牛群来源的菌株耐药性差异，探讨可能影响耐药性的因素。三、结果与分析3.1金黄色葡萄球菌的分离鉴定结果经过对宁夏地区30个养牛场采集的400份牛源样本进行分离培养，共分离出金黄色葡萄球菌120株。其中，从患病牛的病灶组织中分离出55株，鼻腔分泌物中分离出30株，粪便中分离出20株，健康牛的体表拭子中分离出15株。不同样本来源的金黄色葡萄球菌分离情况如表3-1所示。\begin{table}[h]\centering\begin{tabular}{|c|c|c|}\hlineæ

·æœ¬æ¥æº&æ

·æœ¬æ•°é‡&金黄色葡萄球菌分离æ

ªæ•°\\\hline病灶组织&150&55\\鼻腔分泌物&100&30\\粪便&80&20\\体表拭子&70&15\\\hline\end{tabular}\caption{不同æ

·æœ¬æ¥æºçš„金黄色葡萄球菌分离情况}\end{table}对分离得到的菌株进行形态学观察，在血琼脂平板上，这些菌株形成了圆形、凸起、湿润、金黄色且周围有明显β-溶血环的典型菌落，这与金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上的菌落特征高度相符。在Baird-Parker培养基平板上，菌株呈现出黑色、有光泽、周围有透明溶血圈的菌落形态，进一步支持了这些菌株可能为金黄色葡萄球菌的判断。革兰氏染色结果显示，所有菌株均被染成紫色，且在显微镜下呈葡萄串状排列，这是革兰氏阳性球菌的典型特征，与金黄色葡萄球菌的革兰氏染色特性一致。触酶试验中，所有菌株均能使3%过氧化氢溶液迅速产生气泡，表明这些菌株为触酶阳性，这也是金黄色葡萄球菌的重要生物学特性之一。通过16SrRNA基因测序及在NCBI数据库中的BLAST比对分析，结果显示所有分离菌株与已知金黄色葡萄球菌16SrRNA基因序列的相似度均达到99%以上，从而最终确定这些分离菌株为金黄色葡萄球菌。不同部位的金黄色葡萄球菌分离率存在差异，具体分离率如图3-1所示。病灶组织的分离率最高，达到36.7%（55/150），这可能是因为患病牛的病灶组织中病原菌数量较多，易于分离。鼻腔分泌物的分离率为30.0%（30/100），表明牛的鼻腔是金黄色葡萄球菌的一个重要定植部位，可能通过呼吸道传播导致感染。粪便的分离率为25.0%（20/80），提示牛源金黄色葡萄球菌可能存在于肠道中，并通过粪便排出，污染养殖环境。体表拭子的分离率相对较低，为21.4%（15/70），但仍表明健康牛的体表也可能携带金黄色葡萄球菌。\begin{figure}[h]\centering\includegraphics[width=10cm]{不同部位金黄色葡萄球菌分离率.png}\caption{不同部位金黄色葡萄球菌分离率}\end{figure}3.2生物被膜形成能力检测结果采用微量滴定板法对分离得到的120株牛源金黄色葡萄球菌的生物被膜形成能力进行检测，以未接种细菌的无菌营养肉汤培养基作为阴性对照，其在570nm波长处的吸光度值（OD₅₇₀）作为判断标准。结果显示，120株菌株中，有95株能够形成生物被膜，生物被膜形成菌株比例为79.2%（95/120）。不同生物被膜形成能力的菌株分布情况如表3-2所示。\begin{table}[h]\centering\begin{tabular}{|c|c|c|}\hline生物被膜形成能力&菌æ

ªæ•°é‡&所å

比例（%）\\\hline强&25&20.8\\中等&40&33.3\\å¼±&30&25.0\\æ—

&25&20.8\\\hline\end{tabular}\caption{不同生物被膜形成能力的菌æ

ªåˆ†å¸ƒæƒ…况}\end{table}其中，具有强生物被膜形成能力（OD₅₇₀值大于0.48）的菌株有25株，占总菌株数的20.8%；中等生物被膜形成能力（OD₅₇₀值在0.24-0.48之间）的菌株有40株，占33.3%；弱生物被膜形成能力（OD₅₇₀值在0.12-0.24之间）的菌株有30株，占25.0%；无生物被膜形成能力（OD₅₇₀值小于0.12）的菌株有25株，占20.8%。不同生物被膜形成能力的菌株分布比例如图3-2所示。\begin{figure}[h]\centering\includegraphics[width=10cm]{不同生物被膜形成能力的菌æ

ªåˆ†å¸ƒæ¯”例.png}\caption{不同生物被膜形成能力的菌æ

ªåˆ†å¸ƒæ¯”例}\end{figure}从图3-2中可以直观地看出，宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌中，中等生物被膜形成能力的菌株所占比例最高，其次是弱生物被膜形成能力和强生物被膜形成能力的菌株，无生物被膜形成能力的菌株所占比例相对较低。这表明宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌具有较强的生物被膜形成能力，生物被膜的形成可能在其感染过程中发挥重要作用。为进一步分析不同样本来源的菌株生物被膜形成能力是否存在差异，对来自病灶组织、鼻腔分泌物、粪便和体表拭子的菌株分别进行统计分析。结果如表3-3所示。\begin{table}[h]\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|c|}\hlineæ

·æœ¬æ¥æº&菌æ

ªæ•°é‡&强生物被膜形成菌æ

ªæ•°&中等生物被膜形成菌æ

ªæ•°&弱生物被膜形成菌æ

ªæ•°\\\hline病灶组织&55&15&20&10\\鼻腔分泌物&30&5&10&8\\粪便&20&3&6&5\\体表拭子&15&2&4&7\\\hline\end{tabular}\caption{不同æ

·æœ¬æ¥æºèŒæ

ªçš„生物被膜形成能力分布}\end{table}不同样本来源菌株的生物被膜形成能力分布情况如图3-3所示。由图可知，来自病灶组织的菌株中，强生物被膜形成能力的菌株比例相对较高，这可能与病灶组织中细菌的生存环境和感染机制有关，生物被膜的形成有助于细菌在病灶部位的黏附和定植，抵抗宿主的免疫防御，从而导致感染的持续和加重。而来自体表拭子的菌株中，弱生物被膜形成能力的菌株比例相对较高，可能是因为体表环境相对不利于生物被膜的大量形成，细菌在体表主要以浮游状态存在，生物被膜形成能力相对较弱。通过统计学分析（采用卡方检验），发现不同样本来源的菌株生物被膜形成能力存在显著差异（P<0.05）。这表明样本来源是影响牛源金黄色葡萄球菌生物被膜形成能力的一个重要因素，在研究和防控牛源金黄色葡萄球菌感染时，需要考虑不同样本来源菌株的生物被膜形成特性。\begin{figure}[h]\centering\includegraphics[width=10cm]{不同æ

·æœ¬æ¥æºèŒæ

ªçš„生物被膜形成能力分布.png}\caption{不同æ

·æœ¬æ¥æºèŒæ

ªçš„生物被膜形成能力分布}\end{figure}3.3生物被膜相关基因检测结果对120株牛源金黄色葡萄球菌进行生物被膜相关基因icaA、icaD、fnbA的PCR检测，结果如表3-4所示。120株菌株中，icaA基因的检出率为70.8%（85/120），icaD基因的检出率为65.8%（79/120），fnbA基因的检出率相对较高，为80.0%（96/120）。\begin{table}[h]\centering\begin{tabular}{|c|c|c|}\hline基å›

&检出阳性菌æ

ªæ•°&检出率（%）\\\hlineicaA&85&70.8\\icaD&79&65.8\\fnbA&96&80.0\\\hline\end{tabular}\caption{生物被膜相关基å›

检测结果}\end{table}不同生物被膜形成能力菌株的生物被膜相关基因检出情况如表3-5所示。在强生物被膜形成能力的25株菌株中，icaA基因检出20株，检出率为80.0%；icaD基因检出18株，检出率为72.0%；fnbA基因检出22株，检出率为88.0%。中等生物被膜形成能力的40株菌株中，icaA基因检出30株，检出率为75.0%；icaD基因检出26株，检出率为65.0%；fnbA基因检出33株，检出率为82.5%。弱生物被膜形成能力的30株菌株中，icaA基因检出20株，检出率为66.7%；icaD基因检出18株，检出率为60.0%；fnbA基因检出23株，检出率为76.7%。无生物被膜形成能力的25株菌株中，icaA基因检出15株，检出率为60.0%；icaD基因检出17株，检出率为68.0%；fnbA基因检出18株，检出率为72.0%。\begin{table}[h]\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|}\hline生物被膜形成能力&菌æ

ªæ•°é‡&icaA基å›

检出率（%）&icaD基å›

检出率（%）&fnbA基å›

检出率（%）\\\hline强&25&80.0&72.0&88.0\\中等&40&75.0&65.0&82.5\\å¼±&30&66.7&60.0&76.7\\æ—

&25&60.0&68.0&72.0\\\hline\end{tabular}\caption{不同生物被膜形成能力菌æ

ªçš„生物被膜相关基å›

检出情况}\end{table}为进一步分析生物被膜相关基因与生物被膜形成能力之间的关联，对不同生物被膜形成能力菌株中各基因的检出率进行统计学分析（采用卡方检验）。结果显示，icaA基因在强生物被膜形成能力菌株中的检出率显著高于无生物被膜形成能力菌株（P<0.05），表明icaA基因的携带与强生物被膜形成能力密切相关。icaD基因在强生物被膜形成能力菌株中的检出率也相对较高，但与其他生物被膜形成能力菌株相比，差异无统计学意义（P>0.05）。fnbA基因在不同生物被膜形成能力菌株中的检出率虽有差异，但未达到统计学显著水平（P>0.05）。各基因在不同生物被膜形成能力菌株中的检出率分布情况如图3-4所示。\begin{figure}[h]\centering\includegraphics[width=10cm]{各基å›

在不同生物被膜形成能力菌æ

ªä¸­çš„检出率分布.png}\caption{各基å›

在不同生物被膜形成能力菌æ

ªä¸­çš„检出率分布}\end{figure}从图3-4中可以直观地看出，随着生物被膜形成能力的增强，icaA基因的检出率呈现上升趋势，进一步支持了icaA基因与生物被膜形成能力之间的正相关关系。而icaD基因和fnbA基因的检出率在不同生物被膜形成能力菌株中的变化趋势相对不明显。此外，对同时携带多个生物被膜相关基因的菌株进行统计分析。结果发现，同时携带icaA、icaD和fnbA基因的菌株有50株，占总菌株数的41.7%（50/120）。在强生物被膜形成能力的菌株中，同时携带这三个基因的菌株比例为60.0%（15/25）；中等生物被膜形成能力的菌株中，该比例为45.0%（18/40）；弱生物被膜形成能力的菌株中，比例为33.3%（10/30）；无生物被膜形成能力的菌株中，比例为28.0%（7/25）。随着生物被膜形成能力的增强，同时携带三个生物被膜相关基因的菌株比例逐渐升高，表明多个生物被膜相关基因的协同作用可能对生物被膜的形成具有重要影响。3.4耐药性检测结果采用纸片扩散法和肉汤微量稀释法对120株牛源金黄色葡萄球菌进行药敏试验，检测其对青霉素、苯唑西林、头孢噻呋、四环素、红霉素、克林霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、环丙沙星等10种常用抗生素的耐药性，结果如表3-6所示。\begin{table}[h]\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|}\hline抗生ç´

&耐药æ

ªæ•°&耐药率（%）&中介æ

ªæ•°&中介率（%）&敏感æ

ªæ•°&敏感率（%）\\\hline青霉ç´

&95&79.2&15&12.5&10&8.3\\苯唑西林&60&50.0&25&20.8&35&29.2\\头孢噻呋&40&33.3&30&25.0&50&41.7\\四环ç´

&70&58.3&20&16.7&30&25.0\\红霉ç´

&85&70.8&15&12.5&20&16.7\\克林霉ç´

&75&62.5&20&16.7&25&20.8\\氟苯尼考&30&25.0&25&20.8&65&54.2\\恩诺沙星&45&37.5&25&20.8&50&41.7\\环丙沙星&50&41.7&20&16.7&50&41.7\\\hline\end{tabular}\caption{牛源金黄色葡萄球菌对10种抗生ç´

的耐药性检测结果}\end{table}从表3-6可以看出，120株牛源金黄色葡萄球菌对不同抗生素的耐药率存在明显差异。其中，对青霉素的耐药率最高，达到79.2%，这可能是由于青霉素在畜牧业中使用历史悠久且使用频率较高，长期的药物选择压力导致菌株对青霉素产生了高度耐药性。对红霉素的耐药率也较高，为70.8%，表明红霉素在治疗牛源金黄色葡萄球菌感染时的效果可能受到限制。对苯唑西林、四环素、克林霉素的耐药率分别为50.0%、58.3%、62.5%，均超过了50%，显示出该地区牛源金黄色葡萄球菌对这些抗生素的耐药情况较为严重。相对而言，对氟苯尼考的耐药率较低，为25.0%，说明氟苯尼考在治疗牛源金黄色葡萄球菌感染时可能具有较好的疗效。对头孢噻呋、恩诺沙星、环丙沙星的耐药率分别为33.3%、37.5%、41.7%，处于中等水平。各抗生素耐药率分布情况如图3-5所示。\begin{figure}[h]\centering\includegraphics[width=10cm]{各抗生ç´

耐药率分布.png}\caption{各抗生ç´

耐药率分布}\end{figure}从图3-5中可以直观地看出，青霉素和红霉素的耐药率明显高于其他抗生素，而氟苯尼考的耐药率最低。这提示在宁夏地区养牛业临床治疗中，应谨慎使用青霉素和红霉素，优先考虑氟苯尼考等耐药率较低的抗生素。进一步分析多重耐药菌株情况，结果显示，120株菌株中，多重耐药菌株有80株，多重耐药率为66.7%（80/120）。多重耐药菌株对3-8种抗生素耐药，具体耐药谱特征如表3-7所示。\begin{table}[h]\centering\begin{tabular}{|c|c|c|}\hline耐药谱&菌æ

ªæ•°é‡&所å

比例（%）\\\hline耐3种抗生ç´

&10&12.5\\耐4种抗生ç´

&20&25.0\\耐5种抗生ç´

&25&31.2\\耐6种抗生ç´

&15&18.8\\耐7种抗生ç´

&8&10.0\\耐8种抗生ç´

&2&2.5\\\hline\end{tabular}\caption{多重耐药菌æ

ªçš„耐药谱特征}\end{table}从表3-7可以看出，耐5种抗生素的多重耐药菌株数量最多，占多重耐药菌株总数的31.2%。耐4种和6种抗生素的菌株数量次之，分别占25.0%和18.8%。耐3种、7种和8种抗生素的菌株数量相对较少。多重耐药菌株的耐药谱分布情况如图3-6所示。\begin{figure}[h]\centering\includegraphics[width=10cm]{多重耐药菌æ

ªçš„耐药谱分布.png}\caption{多重耐药菌æ

ªçš„耐药谱分布}\end{figure}从图3-6中可以清晰地看到，宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌多重耐药情况较为复杂，耐药谱呈现多样化特征。这表明在临床治疗中，单一使用某一种抗生素很难有效控制牛源金黄色葡萄球菌感染，需要综合考虑药物的联合使用和合理用药方案。同时，多重耐药菌株的高比例存在，也对宁夏地区养牛业的疾病防控带来了巨大挑战，应加强对耐药菌株的监测和管理，防止耐药菌株的传播和扩散。四、讨论4.1宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌的分布特征本研究从宁夏地区不同养牛场采集的400份牛源样本中成功分离出120株金黄色葡萄球菌，整体分离率为30.0%。不同样本来源的金黄色葡萄球菌分离率存在显著差异，其中病灶组织的分离率最高，达到36.7%，鼻腔分泌物、粪便和体表拭子的分离率分别为30.0%、25.0%和21.4%。病灶组织中较高的分离率表明，当牛感染金黄色葡萄球菌引发疾病时，病灶部位是病原菌大量聚集和繁殖的场所，这与牛源金黄色葡萄球菌能够在宿主体内引发感染性疾病，如呼吸道感染、乳腺炎、腹泻等的特性相符。在这些疾病过程中，金黄色葡萄球菌在病灶组织中大量增殖，以适应宿主环境并逃避宿主的免疫防御机制，从而导致病灶组织成为分离病原菌的主要来源。鼻腔分泌物中较高的分离率提示，牛的鼻腔是金黄色葡萄球菌的重要定植部位。金黄色葡萄球菌可通过空气传播、接触传播等方式进入牛的呼吸道，并在鼻腔黏膜表面定植。鼻腔内相对湿润、温暖且富含营养物质的环境，为金黄色葡萄球菌的生存和繁殖提供了有利条件。当牛的免疫力下降或受到其他应激因素影响时，定植在鼻腔的金黄色葡萄球菌可能会进一步侵入呼吸道深部组织，引发呼吸道感染疾病。粪便中分离出金黄色葡萄球菌，表明该菌可能存在于牛的肠道中，并通过粪便排出体外，污染养殖环境。这可能与牛的饲养管理方式、饲料卫生状况以及肠道菌群平衡有关。如果养殖环境中存在大量被金黄色葡萄球菌污染的饲料、饮水或垫料，牛在采食、饮水或活动过程中，可能会摄入病原菌，导致肠道感染。此外，肠道菌群失衡也可能为金黄色葡萄球菌在肠道内的定植和繁殖创造条件。健康牛体表拭子中也分离出金黄色葡萄球菌，说明健康牛的体表也可能携带该菌。牛的体表经常与外界环境接触，可能通过接触被污染的物体表面、其他患病动物或饲养人员等途径感染金黄色葡萄球菌。虽然这些菌株在体表可能处于相对低水平的携带状态，但在一定条件下，如皮肤破损、免疫力下降时，仍有可能引发感染。与其他地区的研究结果相比，宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌的分离率及分布特征存在一定差异。在某些养殖密集且卫生条件相对较差的地区，牛源金黄色葡萄球菌的分离率可能更高，这可能与养殖环境中病原菌的传播和扩散更为容易有关。在一些管理规范、卫生条件良好的养殖场，金黄色葡萄球菌的分离率相对较低。不同地区牛源金黄色葡萄球菌在样本来源上的分布也可能因养殖模式、气候条件等因素而有所不同。在以放牧为主的养殖模式下，牛群与自然环境接触频繁，可能导致鼻腔分泌物和体表拭子中金黄色葡萄球菌的分离率相对较高；而在封闭式养殖模式下，牛群相对集中，粪便污染环境的风险增加，可能使得粪便中金黄色葡萄球菌的分离率升高。宁夏地区的气候条件较为干燥，这可能对金黄色葡萄球菌在环境中的生存和传播产生一定影响，进而导致其在牛群中的分布特征与其他地区不同。造成这些差异的原因是多方面的。首先，养殖环境和饲养管理水平是重要影响因素。在卫生条件差、养殖密度高的养殖场，病原菌更容易在牛群中传播和扩散。通风不良会导致养殖环境中细菌浓度增加，为金黄色葡萄球菌的传播提供了有利条件。饲养人员不规范的操作，如不及时更换工作服、不进行严格的消毒措施等，也可能将病原菌带入养殖场，增加牛感染的风险。饲料和饮水的卫生状况也直接关系到牛源金黄色葡萄球菌的感染情况。如果饲料受到污染，含有大量的金黄色葡萄球菌，牛在采食后就容易感染。其次，抗生素的使用情况对金黄色葡萄球菌的分布和耐药性也有重要影响。不合理使用抗生素，如滥用、超剂量使用或不按疗程使用等，会导致牛体内菌群失衡，使金黄色葡萄球菌更容易在体内定植和繁殖。长期使用抗生素还会产生选择压力，促使耐药菌株的产生和传播。如果养殖场频繁使用青霉素类抗生素，可能会筛选出对青霉素耐药的金黄色葡萄球菌菌株，这些耐药菌株在养殖场中逐渐占据优势地位，从而影响金黄色葡萄球菌的分布和耐药特征。此外，牛群的健康状况和免疫力也是影响金黄色葡萄球菌分布的因素之一。免疫力低下的牛更容易感染金黄色葡萄球菌，且感染后病情可能更为严重。犊牛由于免疫系统尚未发育完全，对病原菌的抵抗力较弱，因此更容易成为金黄色葡萄球菌的感染对象。患有其他疾病的牛，如呼吸道疾病、消化道疾病等，其免疫力也会受到影响，增加了感染金黄色葡萄球菌的风险。4.2生物被膜相关基因与生物被膜形成的关系本研究对宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌的生物被膜相关基因icaA、icaD、fnbA进行了检测，结果显示，icaA基因检出率为70.8%，icaD基因检出率为65.8%，fnbA基因检出率为80.0%。生物被膜形成能力检测结果表明，79.2%的菌株能够形成生物被膜，其中强生物被膜形成能力的菌株占20.8%，中等生物被膜形成能力的菌株占33.3%，弱生物被膜形成能力的菌株占25.0%。进一步分析不同生物被膜形成能力菌株的生物被膜相关基因检出情况发现，icaA基因在强生物被膜形成能力菌株中的检出率显著高于无生物被膜形成能力菌株（P<0.05），且随着生物被膜形成能力的增强，icaA基因的检出率呈现上升趋势。这表明icaA基因在牛源金黄色葡萄球菌生物被膜形成过程中发挥着关键作用。icaA基因是ica操纵子的重要组成部分，ica操纵子编码的蛋白参与多糖细胞间粘附素（PIA）的合成，而PIA是生物被膜基质的主要成分。PIA能够介导细菌间的粘附以及细菌与宿主细胞或生物材料表面的粘附，从而促进生物被膜的形成。当icaA基因表达正常时，菌株能够合成足够的PIA，使得细菌之间以及细菌与表面之间的粘附力增强，有利于生物被膜的初始粘附和后续的结构发育。若icaA基因发生突变或缺失，PIA的合成受阻，细菌形成生物被膜的能力将显著下降。本研究中，强生物被膜形成能力菌株中icaA基因的高检出率，进一步证实了icaA基因与生物被膜形成能力之间的紧密联系。icaD基因在强生物被膜形成能力菌株中的检出率相对较高，但与其他生物被膜形成能力菌株相比，差异无统计学意义（P>0.05）。这可能是因为icaD基因虽然参与PIA的合成过程，但在生物被膜形成过程中的作用相对icaA基因而言较为次要。icaD基因编码的蛋白可能在PIA合成的特定阶段或环节发挥作用，其对生物被膜形成能力的影响可能受到其他因素的调节或掩盖。也有可能是由于本研究的样本量有限，导致未能检测到icaD基因在不同生物被膜形成能力菌株中的显著差异。未来需要进一步扩大样本量，并结合功能研究，深入探讨icaD基因在牛源金黄色葡萄球菌生物被膜形成中的具体作用机制。fnbA基因在不同生物被膜形成能力菌株中的检出率虽有差异，但未达到统计学显著水平（P>0.05）。fnbA基因编码的纤连蛋白结合蛋白A（FnBPA）是一种重要的粘附素，能够介导金黄色葡萄球菌与宿主细胞表面的纤连蛋白结合，促进细菌在宿主组织表面的粘附和定植。在生物被膜形成的初始阶段，FnBPA可以帮助细菌快速附着在宿主细胞或生物材料表面，为后续生物被膜的形成奠定基础。然而，本研究中fnbA基因的检出率与生物被膜形成能力之间未呈现出明显的相关性，可能是因为生物被膜的形成是一个复杂的过程，受到多种基因和因素的共同调控。除了fnbA基因外，其他粘附素基因、调控基因以及环境因素等都可能对生物被膜的形成产生影响，从而掩盖了fnbA基因与生物被膜形成能力之间的关系。在某些情况下，即使菌株携带fnbA基因，但如果其他关键基因或因素缺失或异常，生物被膜的形成能力也可能受到影响。同时携带icaA、icaD和fnbA基因的菌株占总菌株数的41.7%，且随着生物被膜形成能力的增强，同时携带这三个基因的菌株比例逐渐升高。这表明多个生物被膜相关基因之间可能存在协同作用，共同促进生物被膜的形成。icaA和icaD基因通过参与PIA的合成，为生物被膜提供结构支撑；fnbA基因编码的FnBPA则增强了细菌与宿主表面的粘附能力。当这些基因同时存在且正常表达时，它们的协同作用可能使得细菌在生物被膜形成过程中，既能有效地粘附在表面，又能通过PIA的合成构建稳定的生物被膜结构，从而增强生物被膜的形成能力。在强生物被膜形成能力的菌株中，同时携带这三个基因的菌株比例较高，说明这些基因的协同作用在强生物被膜形成过程中可能更为关键。4.3耐药性分析及耐药机制探讨本研究对宁夏地区120株牛源金黄色葡萄球菌进行了耐药性检测，结果显示该地区牛源金黄色葡萄球菌对多种常用抗生素存在不同程度的耐药性。对青霉素的耐药率最高，达到79.2%，这与青霉素在畜牧业中广泛且长期的使用密切相关。长期大量使用青霉素，使得金黄色葡萄球菌受到强烈的药物选择压力，促使其逐渐产生耐药机制以适应这种环境。对红霉素的耐药率也高达70.8%，同样是因为红霉素在临床治疗中频繁应用，导致菌株对其耐药性不断增加。对苯唑西林、四环素、克林霉素的耐药率均超过50%，表明这些抗生素在治疗牛源金黄色葡萄球菌感染时的效果可能受到较大影响。相对而言，对氟苯尼考的耐药率较低，为25.0%，这可能是由于氟苯尼考在宁夏地区养牛业中的使用频率相对较低，细菌尚未对其产生广泛的耐药性。对头孢噻呋、恩诺沙星、环丙沙星的耐药率处于中等水平，分别为33.3%、37.5%、41.7%。多重耐药菌株的比例高达66.7%，这表明宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌的耐药情况十分复杂，给临床治疗带来了极大的挑战。多重耐药菌株对3-8种抗生素耐药，其中耐5种抗生素的菌株数量最多，占多重耐药菌株总数的31.2%。这种复杂的耐药谱特征可能是由于养殖场长期不合理使用多种抗生素，导致细菌在多种药物的选择压力下，逐渐积累耐药基因，从而形成多重耐药菌株。在实际养殖过程中，一些养殖户为了追求治疗效果，往往随意加大抗生素的使用剂量，或者同时使用多种抗生素，这种不规范的用药行为加速了耐药菌株的产生和传播。此外，抗生素在饲料和饮水中的滥用，也使得牛群长期处于低剂量抗生素的暴露环境中，进一步促进了细菌耐药性的发展。牛源金黄色葡萄球菌产生耐药性的机制是多方面的。首先，细菌可以通过产生灭活酶来破坏抗生素的结构，使其失去抗菌活性。对于β-内酰胺类抗生素，金黄色葡萄球菌可产生β-内酰胺酶，如blaZ基因编码的青霉素酶，能够水解β-内酰胺环，从而使青霉素、头孢菌素等β-内酰胺类抗生素失去抗菌作用。携带blaZ基因的菌株能够在含有β-内酰胺类抗生素的环境中存活和繁殖，导致对这类抗生素的耐药性。其次，细菌可以改变抗生素的作用靶点，使抗生素无法与之结合，从而产生耐药性。例如，mecA基因编码的青霉素结合蛋白2a（PBP2a），其与β-内酰胺类抗生素的亲和力极低。当金黄色葡萄球菌携带mecA基因时，即使在β-内酰胺类抗生素存在的情况下，PBP2a仍能发挥正常的细胞壁合成功能，使细菌继续生长和繁殖，表现出对β-内酰胺类抗生素的耐药性。在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）中，mecA基因的携带率通常较高，这也是MRSA对多种β-内酰胺类抗生素耐药的重要原因。此外，细菌还可以通过主动外排机制将进入细胞内的抗生素排出体外，降低细胞内药物浓度，使其无法达到有效杀菌浓度，从而产生耐药性。norA基因编码的外排泵能够将氟喹诺酮类抗生素排出细胞外，导致细菌对氟喹诺酮类药物耐药。当金黄色葡萄球菌中norA基因表达上调时，外排泵的活性增强，更多的氟喹诺酮类抗生素被排出细胞，使得细菌对这类药物的耐药性增加。与其他地区的研究结果相比，宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌的耐药率和耐药谱存在一定差异。在一些养殖密集且抗生素使用不规范的地区，牛源金黄色葡萄球菌对某些抗生素的耐药率可能更高。在部分南方地区，由于气候湿润，养殖环境中细菌易于繁殖，且抗生素使用量较大，牛源金黄色葡萄球菌对青霉素、红霉素等抗生素的耐药率可能超过80%。而在一些管理规范、抗生素使用合理的地区，耐药率相对较低。在一些现代化养殖场，通过严格控制抗生素的使用，加强养殖环境的卫生管理，牛源金黄色葡萄球菌的耐药率得到了有效控制。这些差异可能与当地的养殖模式、抗生素使用习惯、养殖环境等因素密切相关。在以散养为主的养殖模式下，牛群活动范围广，与外界环境接触频繁，容易感染耐药菌株。而在规模化养殖模式下，如果管理不善，抗生素滥用现象可能更为严重，导致耐药菌株的传播和扩散。不同地区的气候条件、饲料来源等也可能影响牛源金黄色葡萄球菌的耐药性。在高温高湿的环境中，细菌更容易产生耐药性变异。饲料中可能存在的抗生素残留，也会对牛源金黄色葡萄球菌的耐药性产生影响。4.4研究的局限性与展望本研究虽在宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌的生物被膜相关基因检测及耐药性研究方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。在样本采集方面，虽然覆盖了宁夏地区多个主要养牛区域的不同规模和养殖模式的养牛场，但样本数量相对有限，可能无法全面、准确地反映宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌的真实分布和特性。不同季节和年份牛源金黄色葡萄球菌的生物被膜形成能力和耐药性可能存在差异，本研究仅在2024年3月至2024年10月期间采集样本，无法探究这种时间因素对研究结果的影响。在生物被膜相关基因检测方面，仅检测了icaA、icaD、fnbA等部分生物被膜相关基因，对于其他可能参与生物被膜形成的基因，如atl、sarA、agr等未进行检测，可能遗漏一些重要的基因信息，影响对生物被膜形成机制的全面理解。在耐药性检测中，虽然选取了10种常用抗生素，但随着新型抗生素的不断研发和应用，以及细菌耐药谱的动态变化，本研究结果可能无法完全反映牛源金黄色葡萄球菌对所有抗生素的耐药情况。对于耐药机制的研究，仅从基因层面进行了初步探讨，未深入研