首医大临床生物化学实验课件09胆红素的测定

血清胆红素测定（TB、DB）改良赖氏法

【目的要求】

1、掌握重氮盐法测定血清胆红素的原理。

2、熟悉质量控制工作的日常开展。1977年通过X射线法阐明了人体内间接反应胆红素的B、C吡咯环上丙酸基侧链的两个氧原子分别和D、C及A、D吡咯环上的氮原子以及和D、A吡咯环上的氧原子形成分子内氢键，使分子开成立体的舟状结构，这样使疏水基团暴露在外，因此间接胆红素不溶于水而溶于有机溶剂，直接胆红素无分子内氢键故溶于水。七十年代未高效液相色谱证明黄疸血存在α、β、γ、δ四种胆红素。它们依次代表游离胆红素、胆红素单葡萄糖醛酸苷、胆红素双萄葡糖醛酸苷及白蛋白紧密结合（很可能共价结合）的胆红素。所以按照这种新观点血清总胆红素包括上述四种胆红素测定的方法归纳起来可以大致分为分光光度法，偶氮反应法、荧光法、氧化反应四类。近十年来又开发了以偶氮反应为基础的干片化学法、高效液相法和胆红素氧化酶的酶分析法以及正在探索适用于儿科的无损伤的血中胆红素测定的方法。

【原理】血清中结合胆红素可直接与重氮试剂(由对氨基苯磺酸与亚硝酸钠形成的重氮苯磺酸)反应，产生偶氮胆红素；非结合胆红素须有加速剂咖啡因一苯甲酸钠一醋酸钠作用，其分子内氢键破坏后才能与重氮试剂反应，也产生偶氮胆红素。生成2分子偶氮二吡咯-偶氮胆红素，它在中性时呈红紫色，在酸或碱性时呈蓝色。

本法重氮反应pH6．5，最后加入碱性酒石酸钠使紫色偶氮胆红素(吸收峰530nm)转变成蓝色偶氮胆红素，在600nm波长比色，使检测灵敏度提高。

结合胆红素能直接与重氮试剂反应称为直接反应，但游离胆红素在“加速剂”促进下，才能与重氮试剂作用而生成没有葡萄糖醛酸的偶氮胆红素A，称为间接反应。最早使用乙醇作为“加速剂”，后来的研究者采用甲醇、咖啡因、苯甲酸钠、乙酰胺、尿素和醋酸钠等。这些“加速剂”的作用机制尚未阐明，可能形成复合物或破坏游离胆红素的分子内氢键结构。在为数很多的重氮反应方法中选择合适的方法的条件是：1，方法简便；2，敏感度高；3，准确度和精密好；4，直接反应和间接反应能同时测定；5，误差因素小；6，溶血影响小；7，有自动化条件。我国全国医学检验学会推荐的方法是J－G法，因为具备了上述2-7的相对优点。J-G法采用咖啡因苯甲酸钠作为“加速剂”，用酒石酸钠碱化使偶氮胆红素呈蓝色，呈色后色泽稳定。

试剂1，总胆红素测定试剂：R1：盐酸，对-氨基苯磺酸，表面活性剂（加速剂），R2：亚硝酸钠2，直接胆红素测定试剂：R1：盐酸，对-氨基苯磺酸，R2：亚硝酸钠【实验操作】试剂应用液配制：总胆红素：R1：R2＝50：1。直接胆红素：R1：R2＝100：1。加入物空白管标准管测定管质控品工作试剂2.02.02.02.037℃孵育5分钟血清－－0.2－定值血清－0.2－蒸馏水0.2－－质控血清0.2混匀后，总胆红素水浴15分钟，直接胆红素水浴1分钟，在550纳米处，722分光光度计比色读A值【参考范围】血清总胆红素：5．1~19μmol／L血清结合胆红素：1．7～6．8μmol/L【注意事项】1，胆红素对光敏感，标准液及标本均应尽量避光保存。2，轻度溶血对本法无影响，但严重溶血时可使测定结果偏低，其原因是血红蛋白与重氮试剂反应形成的产物可破坏偶氮胆红素，还可被亚硝酸氧化为高铁血红蛋白而干扰吸光度测定，血脂及脂溶色素对测定有干扰，应尽量取空腹血。3，叠氮钠能破坏重氮试剂，终止偶氮反应。凡用叠氮钠作防腐剂的质控血清，可引起偶氮反应不完全，甚至不呈色。4，本法测定血清总胆红素，在10－37度条件下不受温度变化的影响，呈色在2小时内非常稳定。5，胆红素大于342ummol/L的标本可减少标本用量，或用0.154mmol/L的氯化钠溶液稀释血清后重测。6，标本对照管的吸光度一般很接近，若遇标本量很少时可不作标本对照管，参照其他标本对照管的吸光度。7，结合胆红素测定在临床上应用很广，但至今无侯选参考方法，国内也无推荐方法。方法不同，反应时间不同，结果相差很大。时间短、非结合胆红素参与反应少，结合胆红素反应也不完全；时间长，结合胆红素反应较完全，但一部分非结合胆红素也参与反应，这是一个很难权衡的问题。在没有结合胆红素标准液的情况下，问题更复杂【方法评价】1，灵敏度和线性范围本法摩尔吸光系数为74380，标本中胆红素17.1mol/L时吸光度约0.08，正常血清总胆红素多数小于17.1mol/L，手工法测定显得灵敏度很不够。2，精密度正常浓度时精密度较差，特别是批间CV，高浓度时精密度较佳。3，重氮反应法测定胆红素，也可用甲醇或二甲亚砜等作加速剂，可做成单一试剂，反应PH和显色PH都在酸性。4，本法灵敏度高，且可避免其他有色物质的干扰，是测定血清总胆红素的参考方法，但不能自动化分析是其缺点。现有些商品试剂盒称咖啡因法或J-G法，但不加碱性酒石酸，即不在碱性条件下显色，其灵敏度和特异性不加上述方法。【临床意义】1，血清总胆红素测定意义有无黄疸及黄疸程度的鉴别。肝细胞损害程度和预后的判断胆红素浓度明显升高反映有严重的肝细胞损伤害。但某些疾病如胆汁淤积型肝炎时