首医大临床生物化学实验课件19 alp的测定

实验十九血清碱性磷酸酶的磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶是一组在碱性环境（PH为10左右）中水解磷酸酯的酶类，分子量随不同组织来源不同，广泛分布在人体的骨、肾、肠、血清、胆汁等部位，但以骨骼，牙齿、肾和肝中含量较多，正常人血清中的ALP主要来源于肝，少部分来自骨骼。

1964年，国际酶学委员会按碱性磷酸酶同工酶在淀粉胶电泳上的迁移率，从阳极至阴极依次命名为ALP1、ALP2、ALP3及ALP4，但一般习惯还是按同工酶的器官来源而命名的，分别称为肝、骨、小肠、胎盘和胆汁等五种同工酶。正常成人血清ALP主要来自肝脏，而来自骨组织的ALP一般少于总活性一半。其各自含量与年龄密切相关，但也受性别的影响。血清ALP测定可用于肝胆系统及骨骼系统疾病的辅助诊断。是临床常做的酶类检验项目之一。测定ALP的方法主要分为二种，一是测定底物解离下的磷酸根来计算酶活力，如β-甘油磷酸钠法，但存在血清本身有磷酸根及磷酸化的缺点；二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物，这种方法又可分为：1，酚化合物在显色剂的作用下显色比色测定。2，生成的酚化合物本身在一定的条件下就可显色，如磷酸对硝基酚法。磷酸对硝基苯酚（4-NPP）在碱性磷酸酶的作用下，将其磷酸基转移到2-氨基-2-甲基-1-丙醇（AMP）受体分子上，释放出的对硝基苯酚（4-NP）在碱性溶液中分子重排形成黄色醌，可在405nm下检测。黄色醌形成速率与ALP活力成正比。

ALP4-NPP+H2O→4-NP+磷酸

Mg2+,碱性

【目的要求】1、掌握磷酸苯二钠法测血清ALP活性。2、熟悉ALP测定的临床意义【实验原理】碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之水解释放出酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物，根据红色的深浅确定ALP活性。【参考范围】成人：3～13单位，儿童：5～28单位

ALP金氏单位定义是100ml血清，37℃与底物保温15分钟，产生1mg酚为1个金氏单位。操作步骤：1，校正曲线的制作按表操作加入物(ml)B

1

23

4

5酚标准液0.00.2

0.4

0.6

0.8

1.0蒸馏水1.10.90.70.50.30.1碳酸盐缓冲液1.01.0

1.0

1.0

1.0

1.0铁氰化钾溶液3.0

3.0

3.0

3.0

3.0

3.0相当于金氏单位010

203040

50立即混匀，于510nm波长处比色，比色杯光径为1.0cm，用蒸馏水调零，读取各管吸光度。以吸光度值为纵坐标，相应的酶活性单位为横坐标绘制校正曲线。2，标本的测定按表操作加入物(ml)对照管测定管血清-0.1碳酸盐缓冲液1.0

1.0

37度水浴5分钟底物溶液(预温至37度)1.01.0混匀,37度水浴15分钟铁氰化钾溶液3.0

3.0

血清0.1-立即混匀，于510nm波长处比色，比色杯光径为1.0cm，用蒸馏水调零，读取各管吸光度。以测定管与对照管吸光度之差值查校正曲线，得酶活性。【注意事项】1，底物溶液中不应含有游离的酚，如有酚则空白管显红色，说明磷酸苯二钠已经开始分解，应弃去不用。2，铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定显色的作用。该液应避光保存，如出现蓝绿色即应废弃。3,加入铁氰化钾溶液后必须应即混匀，否则显色不完全。4，黄疸血清及溶血血清应分别作对照管，一般血清标本可以共用对照管。【方法评价】磷酸苯二钠比色法与更早的β-甘油磷酸钠法相比具有较大的优点，如水解速度快，保温时间较短、灵敏度较高、显色稳定、不需去蛋白、操作简单、快速。但与磷酸对硝基酚连续监测法相比，准确度、精密度较低；操作比较繁琐,，灵敏度低。酶单位不是国际单位，受胆红素和溶血的干扰。【临床意义】1，升高：肝胆疾病。主要见于（1）阻塞性黄疸，急、慢性黄疸性肝炎，肝癌等均可引起血清ALP活力不同程度的升高，其中以癌性梗阻最明显。（2）各种骨骼疾病如佝偻病、纤维性骨病、成骨不全症、骨转移癌和骨折修复愈合期等，由于骨损伤或病变使骨细胞内高浓度的ALP释放入血，引起血清ALP升高。2，降低：主要见于呆小症，磷酸酶过少症，维生素C缺乏症。【思考题】1，血清ALP测定有何临床意义。2，对于ALP水解的底物测定有哪些方法卡门氏单位：1.0ml血清在25℃，340nm，反应体积3.0ml,光