CN107011125B 一种富集大麻二酚的方法 （云南汉木森生物科技有限责任公司）

(10)授权公告号CN107011125B(21)申请号20171031431(65)同一申请的已公布的文献号(43)申请公布日2017.08.04(73)专利权人云南汉木森生物科技有限责任公司地址657000云南省昭通市昭阳区工业园国际玩具城20幢(56)对比文件审查员陈东旭(72)发明人项伟刘绍兴李泳霖顾文云吴玉金(74)专利代理机构北京联瑞联丰知识产权代理事务所(普通合伙)11411代理人郑自群(54)发明名称一种富集大麻二酚的方法(57)摘要本发明属于化工技术领域，具体涉及一种富叶在120℃条件下干燥0.5～4小时，粉碎至50目以上，在30～55℃、13～30MPa的条件下二氧化碳超临界萃取1～9小时，回收二氧化碳，得大麻花叶初提物；S2、将大麻花叶初提物溶解于乙醇或在层析柱中装入预处理好的填料，用湿法或干法正丁醇、丙酮和氯仿中的一种或它们中任意几种的混合液进行梯度洗脱或等度洗脱；收集富含大21.一种富集大麻二酚的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将大麻花叶在120℃条件下干燥0.5～4小时，粉碎至50目以上，在30～55℃、13～30MPa的条件下二氧化碳超临界萃度洗脱或等度洗脱；收集富含大麻二酚的洗脱段次；采用湿法上样前先用1BV的磷酸缓冲液进行柱平衡，再用2BV的10%(v/v)乙醇溶液进行柱平衡；所述步骤S4包括如下步骤：2)用2～6BV的35%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液Ⅱ;3)用2～6BV的45%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液Ⅲ;4)用2～6BV的55%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液IV;5)用2～6BV的65%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液V;7)用2～6BV的85%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液V;8)用2～6BV的95%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液VⅢ;收集洗出液IV、V和VI;将洗出液IV和VI合并，浓缩至相对密度为1.1～1.4,上样于层析硅胶柱进行层析，用2～3BV的65%(v/v)的乙醇溶液进行洗脱，得洗出液IX,将洗出液IX与洗出液V合并，旋转蒸干，得大麻二酚粗品。2.根据权利要求1所述的富集大麻二酚的方法，其特征在于，采用湿法上样前先用1BV的磷酸缓冲液柱平衡，再用2BV的10%甲醇水溶液进行柱平衡。3.根据权利要求2所述的富集大麻二酚的方法，其特征在于，所述步骤S4包括如下步1)用3～5BV的甲醇：水=30:70(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液I;2)用2～5BV的甲醇：水=50:50(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液Ⅱ;3)用3～5BV的甲醇：水=60:40(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液Ⅲ;4)用2～4BV的甲醇：水=70:30(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液IV;5)用2～5BV的甲醇：水=80:20(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液V;6)用2～5BV的甲醇：水=90:10(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液VI;7)再用100%(v/v)甲醇进行洗柱；收集洗出液Ⅲ、IV和V;将洗出液Ⅲ和V合并后浓缩至相对密度1.1～1.4,上样于层析硅胶柱进行层析，用2～3BV的甲醇：水=80:20(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液VⅡ,将洗出4.根据权利要求3所述的富集大麻二酚的方法，其特征在于，将大麻二酚粗品按上样量5～15wt%,向装填大孔吸附树脂并预处理后的层析柱上样，上样结束后用超纯水洗脱2~4BV;再用水：乙醇：二甲基亚砜=25:74:1(v/v)洗脱3～5BV,收集洗脱液，将洗脱液旋转蒸35.根据权利要求1所述的富集大麻二酚的方法，其特征在于，所述填料为苯乙烯大孔吸附树脂或层析硅胶。6.根据权利要求5所述的富集大麻二酚的方法，其特征在于，所述苯乙烯大孔吸附树脂4一种富集大麻二酚的方法技术领域[0001]本发明属于化工技术领域，具体涉及一种富集大麻二酚的方法。背景技术本，高1～3米。大麻中含有的其它麻类的四氢大麻酚(THC)和大麻二酚(CBD)成分，是目前在其它动植物中尚未分离出的酚类化合物，具有很高的药用价值。研究表明，滥用THC将严重症因化疗而引起的恶心以及治疗哮喘等功能。近年来科学家还发现四氢大麻酚(THC)和大麻二酚(CBD)均为强力抗氧化剂，大麻二酚(CBD)是非成瘾性成分，具有阻断某些多酚对人体神经的不利影响，并且具有阻断乳腺癌转移、治疗癫痫、抗类风湿性关节炎、抗失眠等一系列生理活性功能。根据大麻所含有的四氢大麻酚(THC)的比例，通常把它分为工业大麻和毒品大麻两类。工业大麻属低毒大麻，其中四氢大麻酚(THC)的含量最高不超0.3%,不具有毒品利用价值；而在毒品大麻的叶子和花枝中四氢大麻酚(THC)的含量较高，属高毒大麻。[0003]申请公布日为2017年1月4日，申请公布号为CN106278828A的中国发明专利申请，公开了一种从工业大麻叶中提取大麻二酚的方法，包括以下步骤：将工业大麻的花叶粉碎、烘干得到药材粉末；将药材粉末采用30-100v%的乙醇提取得到提取液；将提取液浓缩得到浸膏；将浸膏进行水沉，去除杂质得到水沉液；将水沉液离心并向获得的沉淀中加入10-100v%乙醇，溶解得到沉淀物的醇溶液；将沉淀物的醇溶液进行柱层析；浓缩柱层析后洗脱获得的洗脱液，加入乙醇过饱和溶解，获得结晶物；将结晶物加入纯化水或乙醇洗涤，得到[0004]申请公布日为2014年4月23日，申请公布号为CN10379585A的中国发明专利申请，萃取以及浓缩分离过程。[0005]上述两篇专利公开的大麻二酚的提取方法在一定程度上提高了大麻二酚的纯度，但是大麻二酚的纯度还不够高，而且在大麻二酚中四氢大麻酚的含量较高。发明内容[0006]本发明要解决的技术问题是提供一种提高大麻二酚纯度、降低四氢大麻酚含量的大麻二酚富集方法。[0007]为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：[0009]S1、将大麻花叶在120℃~30MPa的条件下二氧化碳超临界萃取1～9小时，回收二氧化碳，得大麻花叶初提物；CN107011125B说明书2/7页5[0012]S4、用水、甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮和氯仿中的一种或它们中任意几种的混合液进行梯度洗脱或等度洗脱；收集富含大麻二酚的洗脱段次。[0013]在本发明提供的富集大麻二酚的方法中，优选地，采用湿法上样前先用1BV的磷酸[0014]在本发明提供的富集大麻二酚的方法中，优选地，所述步骤S4包括如下步骤：[0019]5)用2～6BV的65%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液V;[0020]6)用2～6BV的75%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液VI;[0021]7)用2～6BV的85%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液V;[0022]8)用2～6BV的95%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液VⅢ;[0023]收集洗出液IV、V和VI;将洗出液IV和VI合并，浓缩至相对密度为1.1～1.4,上样于层析硅胶柱进行层析，用2～3BV的65%(v/v)的乙醇溶液进行洗脱，得洗出液IX,将洗出液IX与洗出液V合并，旋转蒸干，得大麻二酚粗品。[0024]在本发明提供的富集大麻二酚的方法中，优选地，采用湿法上样前先用1BV的磷酸缓冲液柱平衡，再用2BV的10%(v/v)甲醇水溶液进行柱平衡。[0025]在本发明提供的富集大麻二酚的方法中，优选地，所述步骤S4包括如下步骤：[0026]1)用3～5BV的甲醇：水=30:70(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液I;[0027]2)用2～5BV的甲醇：水=50:50(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液Ⅱ;[0028]3)用3～5BV的甲醇：水=60:40(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液Ⅲ;[0029]4)用2～4BV的甲醇：水=70:30(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液IV;[0030]5)用2～5BV的甲醇：水=80:20(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液V;[0031]6)用2～5BV的甲醇：水=90:10(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液VI;[0032]7)再用100%(v/v)甲醇进行洗柱；[0033]收集洗出液Ⅲ、IV和V;将洗出液Ⅲ和V合并后浓缩至相对密度1.1～1.4,上样于层析硅胶柱进行层析，用2～3BV的甲醇：水=80:20(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液VⅡ,将洗出液VⅡ与洗出液IV合并，旋转蒸干，得大麻二酚粗品。[0034]在本发明提供的富集大麻二酚的方法中，优选地，将大麻二酚粗品按上样量3~15wt%,向装填大孔吸附树脂并预处理后的层析柱上样，上样结束后用超纯水洗脱2～4BV;再用水：乙醇：二甲基亚砜=25:74:1(v/v)洗脱3～5BV,收集洗脱液，将洗脱液旋转蒸干，得大麻二酚。[0035]在本发明提供的富集大麻二酚的方法中，优选地，所述填料为苯乙烯大孔吸附树脂或层析硅胶。[0037]采用上述技术方案，使用一次二氧化碳超临界萃取和一次柱层析就可以将大麻二酚的含量提高至39.53%以上，四氢大麻酚降低至0.22%以下；将经过一次二氧化碳超临界6萃取和一次柱层析所得到的大麻二酚粗品再经一次柱层析，就能将大麻二酚的含量提高至88.56%以上，四氢大麻酚降低至0.06%以下；在第二次柱层析中，二甲基亚砜对提高大麻二酚和降低四氢大麻酚的含量起着至关重要的作用。具体实施方式[0038]下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。[0040]本实施例提供了一种富集大麻二酚的方法，包括如下步骤：氧化碳超临界萃取2小时，回收二氧化碳，得大麻花叶初提物；[0042]S2、将大麻花叶初提物溶解于10倍重量的乙醇中，再将溶液冷却至0℃,保持温度[0043]S3、在层析柱中装入已经预先处理好的D101大孔吸附树脂，先用1BV的磷酸缓冲液柱平衡，再用2BV的10%(v/v)乙醇溶液进行柱平衡；将步骤S2中精细过滤所得的大麻花叶初提物用乙醇溶解，按上样量为5wt%上样于层析柱中；[0044]S4、用不同浓度的乙醇溶液按如下步骤进行洗脱：[0045]1)用4BV的25%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液I;[0046]2)用3BV的35%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液Ⅱ;[0047]3)用5BV的45%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液Ⅲ;[0048]4)用2BV的55%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液IV;[0049]5)用3BV的65%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液V;[0050]6)用3BV的75%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液VI;[0051]7)用3BV的85%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液V;[0052]8)用3BV的95%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液VⅢ;[0053]收集洗出液IV、V和VI;将洗出液IV和VI合并，浓缩至相对密度为1.8,上样于层析硅胶柱进行层析，用3BV的65%(v/v)的乙醇溶液进行洗脱，得洗出液IX,将洗出液IX与洗出[0054]实施例2[0055]本实施例提供了一种富集大麻二酚的方法，包括如下步骤：氧化碳超临界萃取7小时，回收二氧化碳，得大麻花叶初提物；[0057]S2、将大麻花叶初提物溶解于10倍重量的甲醇中，将溶液冷却至0℃,保持温度不[0058]S3、在层析柱中装入已经预先处理好的AB-8大孔吸附树脂，先用1BV的磷酸缓冲液柱平衡，再用2BV的甲醇：水=15:85(v/v)的溶液进行柱平衡；将步骤S2中精细过滤所得的大麻花叶初提物用甲醇溶解，按上样量为5wt%上样于层析柱中；[0059]S4、用不同浓度的甲醇溶液按如下步骤进行洗脱：7[0060]1)用4BV的甲醇：水=30:70(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液I;[0061]2)用3BV的甲醇：水=50:50(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液Ⅱ;[0062]3)用5BV的甲醇：水=60:40(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液Ⅲ;[0063]4)用2BV的甲醇：水=70:30(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液IV;[0064]5)用3BV的甲醇：水=80:20(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液V;[0065]6)用3BV的甲醇：水=90:10(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液VI;[0066]7)用3BV的100%(v/v)甲醇进行洗柱；[0067]收集洗出液Ⅲ、IV和V;将洗出液Ⅲ和V合并后浓缩至相对密度1.6,上样于层析硅胶柱进行层析，用2BV的甲醇：水=80:20(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液VⅡ,将洗出液VⅡ与洗出液IV合并，旋转蒸干，得大麻二酚粗品。[0068]实施例3[0069]本实施例提供了一种富集大麻二酚的方法，包括如下步骤：[0070]S1、将大麻花叶在120℃条件下干燥4小时，粉碎至70目，在45℃、30MPa的条件下二氧化碳超临界萃取9小时，回收二氧化碳，得大麻花叶初提物；[0071]S2、将大麻花叶初提物溶解于10倍重量的甲醇中，将溶液冷却至0℃,保持温度不变，并静置12小时，精细过滤除去杂质，蒸干溶剂，备用；[0072]S3、在层析柱中装入已经预先处理好的HPD-100A大孔吸附树脂，先用1BV的磷酸缓冲液柱平衡，再用2BV的甲醇：水=35:65(v/v)的溶液进行柱平衡；将步骤S2中精细过滤所得的大麻花叶初提物用甲醇溶解，按上样量为6wt%上样于层析柱中；[0073]S4、用甲醇：水=75:25(v/v)的溶液进行等度洗脱，HPLC分析大麻二酚含量降低至含量小于30%时，用100%甲醇洗柱。[0074]实施例4[0075]本实施例提供了一种富集大麻二酚的方法，包括如下步骤：[0076]S1、将大麻花叶在120℃条件下干燥3小时，粉碎至80目，在52℃、30MPa的条件下二氧化碳超临界萃取8小时，回收二氧化碳，得大麻花叶初提物；[0077]S2、将大麻花叶初提物溶解于8倍重量的乙醇中，再将溶液冷却至0℃,保持温度不变，静置10小时，精细过滤去除杂质，蒸干溶剂后备用；[0078]S3、在层析柱中装入已经预先处理好的DA201大孔吸附树脂，先用1BV的磷酸缓冲液柱平衡，再用2BV的15%(v/v)乙醇溶液进行柱平衡；将步骤S2中精细过滤所得的大麻花叶初提物用乙醇溶解，按上样量为10wt%上样于层析柱中；[0079]S4、用不同浓度的乙醇溶液按如下步骤进行洗脱：[0080]1)用3BV的25%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液I;[0081]2)用2BV的35%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液Ⅱ;[0082]3)用2BV的45%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液Ⅲ;[0083]4)用3BV的55%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液IV;[0084]5)用3BV的65%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液V;[0085]6)用2BV的75%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液VI;[0086]7)用3BV的85%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液VⅡ;[0087]8)用3BV的95%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液VⅢ;8[0088]收集洗出液IV、V和VI;将洗出液IV和VI合并，浓缩至相对密度为1.6,上样于层析硅胶柱进行层析，用2BV的65%(v/v)的乙醇溶液进行洗脱，得洗出液IX,将洗出液IX与洗出[0089]S5、将大麻二酚粗品按上样量5wt%,向装填大孔吸附树脂并预处理后的层析柱上样，上样结束后用超纯水洗脱4BV;再用水：乙醇：二甲基亚砜=25:74:1(v/v)洗脱3BV,收集[0091]本实施例提供了一种富集大麻二酚的方法，包括如下步骤：氧化碳超临界萃取8小时，回收二氧化碳，得大麻花叶初提物；[0093]S2、将大麻花叶初提物溶解于9倍重量的甲醇中，将溶液冷却至0℃,保持温度不[0094]S3、在层析柱中装入已经预先处理好的AB-8大孔吸附树脂，先用1BV的磷酸缓冲液柱平衡，再用2BV的甲醇：水=10:90(v/v)的溶液进行柱平衡；将步骤S2中精细过滤所得的大麻花叶初提物用甲醇溶解，按上样量为5wt%上样于层析柱中；[0095]S4、用不同浓度的甲醇溶液按如下步骤进行洗脱：[0096]1)用3BV的甲醇：水=30:70(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液I;[0097]2)用2BV的甲醇：水=50:50(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液Ⅱ;[0098]3)用5BV的甲醇：水=60:40(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液Ⅲ;[0099]4)用3BV的甲醇：水=70:30(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液IV;[0100]5)用3BV的甲醇：水=80:20(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液V;[0101]6)用4BV的甲醇：水=90:10(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液VI;[0102]7)用3BV的100%(v/v)甲醇溶液进行洗柱；[0103]收集洗出液Ⅲ、IV和V;将洗出液Ⅲ和V合并后浓缩至相对密度1.8,上样于层析硅胶柱进行层析，用2BV的甲醇：水=80:20(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液VⅡ,将洗出液VⅡ[0104]S5、将大麻二酚粗品按上样量6wt%,向装填大孔吸附树脂并预处理后的层析柱上样，上样结束后用超纯水洗脱2BV;再用水：乙醇：二甲基亚砜=25:74:1(v/v)洗脱5BV,收集[0106]本实施例提供了一种富集大麻二酚的方法，包括如下步骤：氧化碳超临界萃取8小时，回收二氧化碳，得大麻花叶初提物；[0108]S2、将大麻花叶初提物溶解于8倍重量的乙醇中，再将溶液冷却至0℃,保持温度不[0109]S3、在层析柱中装入已经预先处理好的DA201大孔吸附树脂，先用1BV的磷酸缓冲液柱平衡，再用2BV的15%(v/v)乙醇溶液进行柱平衡；将步骤S2中精细过滤所得的大麻花叶初提物用乙醇溶解，按上样量为6wt%上样于层析柱中；[0110]S4、用不同浓度的乙醇溶液按如下步骤进行洗脱：9[0111]1)用3BV的25%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液I;[0112]2)用2BV的35%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液Ⅱ;[0113]3)用2BV的45%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液Ⅲ;[0114]4)用3BV的55%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液IV;[0115]5)用3BV的65%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液V;[0116]6)用2BV的75%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液VI;[0117]7)用3BV的85%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液VI;[0118]8)用3BV的95%(v/v)乙醇溶液进行洗脱，得洗出液VⅢ;[0119]收集洗出液IV、V和VI;将洗出液IV和VI合并，浓缩至相对密度为1.2,上样于层析硅胶柱进行层析，用2BV的65%(v/v)的乙醇溶液进行洗脱，得洗出液IX,将洗出液IX与洗出液V合并，旋转蒸干，得大麻二酚粗品。[0120]S5、将大麻二酚粗品按上样量5wt%,向装填大孔吸附树脂并预处理后的层析柱上样，上样结束后用超纯水洗脱4BV;再用水：乙醇=25:75(v/v)洗脱3BV,收集洗脱液，将洗脱液旋转蒸干，得大麻二酚。[0121]实施例7[0122]本实施例提供了一种富集大麻二酚的方法，包括如下步骤：[0123]S1、将大麻花叶在120℃条件下干燥2小时，粉碎至65目，在46℃、25MPa的条件下二氧化碳超临界萃取8小时，回收二氧化碳，得大麻花叶初提物；[0124]S2、将大麻花叶初提物溶解于9倍重量的甲醇中，将溶液冷却至0℃,保持温度不[0125]S3、在层析柱中装入已经预先处理好的AB-8大孔吸附树脂，先用1BV的磷酸缓冲液柱平衡，再用2BV的甲醇：水=10:90(v/v)的溶液进行柱平衡；将步骤S2中精细过滤所得的大麻花叶初提物用甲醇溶解，按上样量为5wt%上样于层析柱中；[0126]S4、用不同浓度的甲醇溶液按如下步骤进行洗脱：[0127]1)用3BV的甲醇：水=30:70(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液I;[0128]2)用2BV的甲醇：水=50:50(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液Ⅱ;[0129]3)用5BV的甲醇：水=60:40(v/v)的溶液进行洗脱，得洗出液Ⅲ;[013