2026届新高考生物冲刺复习基因工程的基本工具和基本操作程序

2026届新高考生物冲刺复习基因工程的基本工具和基本操作程序【课标要求】

1.阐明重组DNA技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.活动：(1)DNA的粗提取与鉴定。(2)DNA片段的扩增及电泳鉴定。01考点一重组DNA技术的基本工具“分子手术刀”限制酶准确切割DNA分子“分子缝合针”DNA连接酶“分子运输车”质粒将DNA片段连接起来将体外重组好的DNA分子导入受体细胞1．基因工程的概念DNA分子转基因遗传特性生物类型基因重组（1）DNA的基本组成单位相同（都是四种脱氧核苷酸）（2）都遵循碱基互补配对原则（3）DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构（1）基因是控制生物性状的结构与功能单位（2）遗传信息传递都遵循中心法则（3）生物界几乎共用一套遗传密码1.

为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？2.

为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？基因工程的理论基础2．重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶（简称限制酶）①主要来源：__________。②种类：分离的限制酶有______种。③特点(专一性)：识别双链DNA分子的________________。使每一条链中特定部位的____________断开。原核生物数千特定核苷酸序列磷酸二酯键①实例1——EcoRⅠ限制酶EcoRⅠ识别序列为5´-GAATTC-3´EcoRⅠ切割部位为GA之间的磷酸二酯键黏性末端黏性末端②实例2——SmaⅠ限制酶SmaⅠ识别序列为5´-CCCGGG-3´SmaⅠ切割部位为CG之间的磷酸二酯键平末端EcoRⅠ5’…G-A-A-T-T-C…3’3’…C-T-T-A-A-G…5’SmaⅠ5’…C-C-C-G-G-G…3’3’…G-G-G-C-C-C…5’BamHⅠ5’…G-G-A-T-C-C…3’3’…C-C-T-A-G-G…5’TaqⅠ5’……T-C-G-A……3’3’……A-G-C-T……5’[易错提醒]限制酶作用的化学键是磷酸二酯键，不是氢键；在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割2次此DNA分子，产生4个末端。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。【拓展】

限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。(2)DNA连接酶。磷酸二酯键大肠杆菌黏性末端和平末端黏性末端和平末端E.coliDNA连接酶连接平末端的DNA片段效率要远远低于T4DNA连接酶DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质不需要需要DNA的一条链作模板形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键DNA连接酶与DNA聚合酶的比较名称作用部位底物作用结果限制酶切割磷酸二酯键DNA将DNA切成两个片段DNA连接酶形成磷酸二酯键DNA片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶形成磷酸二酯键脱氧核苷酸将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA（水解）酶破坏磷酸二酯键DNA将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶断开氢键DNA将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链与DNA分子相关的几种酶的比较b根据所学知识，完成以下填空：

①限制酶

②解旋酶

③DNA连接酶

④DNA聚合酶A.切断a处的酶为_______

B.连接a处的酶为_______C.切断b处的酶为_______①③④②a：磷酸二酯键b：氢键a氨苄青霉素抗性基因目的基因插入位点复制原点(3)载体环状双链DNA分子噬菌体、动植物病毒一个至多个自我复制受体DNA标记[易错提醒]与膜载体的区别：基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。标记基因限制酶切割位点在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。1．实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备普通质粒载体的条件外，还应具有的条件是____________________________________________________________(答出2点即可)。2．限制酶EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。对靶细胞具有较高的转化效率、不能增殖、对细胞无害—G

AATTC…….......G

AATTC——CTTAA

G….......…CTTAAG—

目的基因1．限制酶的选择原则(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图可选择

。②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，防止破坏目的基因，如图不能选择

。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图可选择用

两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种限制酶的切割位点，而且这两种限制酶切割后不会完全破坏标记基因）。PstⅠSmaⅠPstⅠ和EcoRⅠ保留标记基因、启动子、终止子、复制原点等(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。(3)根据Ti质粒的T-NA片段选择限制酶，图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，丙Ti质粒宜选取（设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ）。2．标记基因的作用可用于检测目的基因是否导入受体细胞。1．(2023·高考新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(

)A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA连接酶连接B．质粒用酶3切割，目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接C2．图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(TetR)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)。请回答下列问题：平(2)用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为______________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在______________酶作用下，形成重组质粒P3。胸腺嘧啶(T)DNA连接(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况见下表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是_____(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是________________、____________________。平板类型菌落类型ABC无抗生素＋＋＋氨苄青霉素＋＋－四环素＋－－氨苄青霉素＋四环素＋－－B

A类菌落含有P0C类菌落未导入质粒(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物，结果从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是_______________________。乙、丙目的基因反向连接3.（2023湖北卷，节选）构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是

。④4.(2025·广东广州模拟)下列有关基因工程中载体的说法，正确的是(

)A.在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒B.所有的质粒都可以作为基因工程中的载体C.质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子D.作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因D5.(2025·湖北襄阳四中联考)大肠杆菌pUC118质粒是基因工程中常用的一种载体，具有氨苄青霉素抗性基因，该质粒中某限制酶的唯一切点位于lacZ基因中。在特定的选择培养基中，若lacZ基因没有被破坏，则大肠杆菌菌落呈蓝色；若lacZ基因被破坏，则菌落呈白色。关于图中操作的叙述正确的是(

)BA.试管1中应加入限制酶和DNA连接酶B.试管2中将重组质粒导入大肠杆菌，需用Ca2＋处理大肠杆菌C.能在氨苄青霉素培养基中存在的菌落均呈现白色D.试管3应选择蓝色菌落内的大肠杆菌进行扩大培养02考点二基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取↓2.基因表达载体的构建↓3.将目的基因导入受体细胞↓4.目的基因的检测与鉴定（核心）DNA基因片段非基因片段编码区：编码蛋白质的合成非编码区非编码区启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点，开始转录编码区原核细胞基因终止子：终止转录非编码区组成：编码区上游与编码区下游功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达启动子：RNA聚合酶结合位点，转录起始的信号终止子：终止RNA的合成编码区非编码区非编码区启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点编码区真核细胞基因终止子：终止转录非编码区组成：编码区上游与编码区下游功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达启动子：RNA聚合酶结合位点，转录起始的信号终止子：终止RNA的合成12345外显子内含子外显子：内含子：能编码蛋白质的序列不能编码蛋白质的序列非编码区非编码区启动子编码区真核细胞基因终止子12345外显子内含子mRNA前体成熟mRNA转录加工

项目启动子终止子起始密码子终止密码子化学成分位置作用DNA片段mRNA上三个相邻碱基目的基因首端目的基因尾端mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出RNA决定转录的结束翻译的起始信号决定翻译过程的结束启动子和终止子

vs起始密码子和终止密码子（1）目的基因

主要是

；也可以是

；例如与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因等。（2）筛选合适的目的基因

从相关的

和

的基因中进行筛选；例如Bt抗虫蛋白基因的筛选等。（3）获取目的基因的常用方法

人工合成目的基因、利用__________________目的基因、通过构建基因文库来获取目的基因。编码蛋白质的基因具有调控作用的因子1．目的基因的筛选与获取已知结构功能清晰逆转录法、化学合成法PCR获取和扩增(2)利用PCR获取和扩增目的基因。DNA半保留复制引物脱氧核苷酸耐高温温度两种引物耐高温的DNA聚合酶指数形式琼脂糖凝胶电泳引物与单链DNA的3’端结合高温使DNA双链间氢键断裂子链延伸：5’→3’[易错提醒]变性过程双链DNA解聚为单链不需要解旋酶。在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量；引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸；真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活，故PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。脱氧核苷三磷酸（dNTP），包括：dATP、dTTP、dGTP、dCTP既作为原料又提供能量思考1：PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？目的基因3次思考2：PCR技术循环n次需要加入多少个引物？2n+1-2第3次第2次第1次PCR技术DNA复制相同点原则条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞内（主要在细胞核内）耐高温的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子PCR技术与DNA复制过程比较1．用PCR扩增下面的DNA片段：

5'-GACCTGTGGAAGC……

CATACGGGATTG-3'

3'-CTGGACACCTTCG…..…GTATGCCCTAAC-5'供选择的引物有：

①5'-GACCTGTGGAAGC-3'

②5'-CATACGGGATTG-3'

③5'-GTATGCCCTAAC-3'

④5'-CAATCCCGTATG-3'

共四种，应选择（

）

A．①②

B．②③

C．③④

D．①④练习D2.(2025·湖南岳阳模拟)“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。下列叙述错误的是(

)A.第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各一个B.第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各一个C.第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因D.经五轮循环后产物中有五种不同的DNA分子Cn代后，完整的目的基因有2n－2n个2．基因表达载体的构建——基因工程的核心（1）

在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代（2）

基因表达载体的组成（载体≠表达载体）目的基因：能控制表达所需要的特殊性状启动子：位置：基因的上游功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。复制原点：DNA复制的起始位点终止子：位置：基因的下游功能：终止转录标记基因：便于重组DNA分子的筛选和鉴定。1.目的基因2.启动子3.终止子4.标记基因5.复制原点目的基因相同[易错提醒]若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况：1.目的基因与目的基因连接；2.目的基因与质粒连接（正向连接、反向连接）；3.质粒与质粒的连接。载体自身环化片段间的连接目的基因自身环化质粒自身环化目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接正向连接

反向连接目的基因11’22’122’1’22’1’1①质粒、目的基因自身环化；

②质粒与目的基因反向连接。单酶切法缺点如何防止目的基因和质粒自身环化以及目的基因反向连接？abab双酶切的优点:防止质粒、目的基因自身环化防止质粒与目的基因反向连接选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，使基因两端产生两个不同的粘性末端双酶切a酶：b酶：思考：若目的基因两端无合适的限制酶切割位点怎么办？5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'5'3'5'5'3'3'3'3'引物1引物2引入限制酶识别序列引入限制酶识别序列5'3'3'5'3'3'5'3'3'3'5'3'3'5'3'5'3'5'3'3'5'3'5'3'3'5'3'3'使用引物设计引入酶切位点，通过PCR扩增实现突变。引物与单链DNA的3'端结合引入的限制酶识别序列在引物的5'端考向1

PCR及应用1．PCR引物的3′端为结合模板DNA的关键，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列，dNTP(四种脱氧核苷三磷酸)是DNA合成的原料。下列相关说法错误的是(

)A．图示环节所需的温度比上一个环节的低B．dNTP作为扩增的原料会依次连接到3′端C．TaqDNA聚合酶催化磷酸二酯键的形成D．经过1个循环后，获得的子代DNA的双链中脱氧核苷酸数量相同D2．重叠延伸PCR是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，经过多次PCR扩增，获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景，下图表示利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。下列叙述错误的是(

)A．引物中G＋C的含量越高，引物与模板DNA结合的稳定性越高B．在第一阶段由于引物2和引物3发生碱基互补配对，因此两者置于不同反应系统中C．引物1、2组成的反应系统和引物3、4组成的反应系统中均进行一次复制后，共产生4种双链DNA分子D．在引物1、2组成的反应系统中，经第一阶段要形成图示双链DNA，至少要经过2次复制C3.以下关于基因表达载体的构建的说法正确的是(

)A.基因表达载体的构建是在生物体的细胞内完成的B.基因表达载体中只有启动子才能驱动目的基因转录出mRNAC.基因表达载体的组成应包括启动子、终止密码子、目的基因、标记基因等D.基因表达载体通常采用抗生素合成基因作为标记基因B4.(2023·重庆卷，12)某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基，短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（如图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(

)BA.实验所用引物，其中一个序列为5′－TGCGCAGT－3′B.步骤①所用酶是SpeⅠ和CfoⅠC.用步骤①的酶对载体进行酶切至少获得了2个片段D.酶切片段和载体连接时可使用E.coliDNA连接酶或T4DNA连接酶5.pET-28b质粒（图3）中a区段表示的是

结构，a区段的作用是

。构建重组质粒时最好选用限制酶

。将构建重组质粒导入BL-21中后，培养在含有

的LB固体培养基上，以达到筛选的目的。限制酶识别序列NcoⅠC↓CATGGXhoⅠC↓TCGAGEcoRⅠG↓AATTCNcoⅠ和XhoⅠ启动子RNA聚合酶识别和结合位点，启动基因转录卡那霉素6．图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是(

)A．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNAB．在酶切过程中，不能将质粒中的全部标记基因破坏C．若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接D．导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长D受体生物植物动物微生物导入方法受体细胞受精卵体细胞受精卵细胞/个体花粉管通道法农杆菌转化法基因枪法显微注射法Ca2+处理法（形成感受态细胞）3.将目的基因导入受体细胞3．将目的基因导入受体细胞(1)植物细胞。花粉管通道Ti质粒T­DNA染色体DNA转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。[易错提醒]农杆菌转化法两次拼接：第一次拼接是指将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指将插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；两次导入：第一次导入是指将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。Ca2+处理法农杆菌转化法第一次拼接第二次拼接第一次导入第二次导入(2)动物细胞：______________法，将目的基因注入动物的____________中。(3)原核生物：先用________处理大肠杆菌细胞，使之处于一种能吸收周围环境中____________的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。显微注射受精卵Ca2＋DNA分子4．目的基因的检测与鉴定染色体DNA目的基因mRNA抗原—抗体转基因[易错提醒]分子水平检测是否插入了目的基因和是否转录出了mRNA时，都遵循碱基互补配对原则；都使用基因探针，探针是放射性同位素或荧光标记的含目的基因的单链DNA片段。转基因生物提取DNAPCR操作是否扩增出目的基因①PCR扩增——基因是否插入染色体DNA（存在）电泳操作（1）分子水平检测M：marker；

1：阳性质粒；2：原始品系；3-9：转Bt品系；转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果4．目的基因的检测与鉴定①PCR扩增——基因是否转录BtM3C0T-9T-2T-51T-5T-23T-11T-20T-21T-34T-1010个PCR阳性棉花植株中，有四株Bt基因发生转录转基因生物提取mRNAPCR操作是否扩增出目的基因电泳操作逆转录为cDNA，以cDNA为模板PCR（1）分子水平检测4．目的基因的检测与鉴定②DNA分子杂交技术——基因是否插入染色体DNA（存在）或基因是否转录原因：带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。（1）分子水平检测4．目的基因的检测与鉴定提取蛋白电泳分离③抗原—抗体杂交——检测目的基因是否翻译成蛋白质苏云金芽孢杆菌注射小鼠体内提取抗体标记抗体抗原抗体杂交（1）分子水平检测4．目的基因的检测与鉴定提取Bt毒蛋白检测水平检测目的检测方法分子水平目的基因是否导入受体细胞目的基因是否转录出了mRNA目的基因是否翻译出蛋白质个体水平转基因生物是否表现出相应的特性

检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性4.目的基因的检测与鉴定PCR技术、DNA分子杂交技术PCR技术、RNA—DNA分子杂交技术抗原—抗体杂交技术如抗虫、抗病的接种实验2．以mRNA为材料可以获得DNA，其原理是________________________________________________________________________________。3．从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，该蛋白作为抗原注入机体后，刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是________，该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV，检测的原理是___________________________。4．为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，既要用______________检测目的基因是否已插入，又要在个体水平上鉴定，后者的具体过程是______________________________________________________________________________。在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成DNA抗体抗原、抗体特异性结合PCR技术将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土壤中，观察该烟草植株的生长状态[模型命题点思考]5．据图回答下列问题。(1)从图中可以看出，目的基因是_____________________________，使用的载体是________，将目的基因导入受体细胞的方法是__________________。(2)若进行个体生物学水平的鉴定，则采用的方法是_______________________。用棉叶饲喂棉铃虫Bt抗虫蛋白基因Ti质粒农杆菌转化法2．筛选出含有目的基因的受体细胞(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如下图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。(2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。(3)筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如下图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如下图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如下图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取

菌落进行培养。1、5被限制酶切割考向2基因工程的操作程序3．某质粒上有Sal

Ⅰ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如下图所示。请回答下列问题：(1)将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是________；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为________。该方法中农杆菌的作用是_______________________________________________________________________________________________。Ti质粒T-DNA感染烟草细胞，把目的基因插入烟草细胞的染色体DNA上(2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用HindⅢ和Sal

Ⅰ两种酶的好处是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已有目的基因？________(填“是”或“否”)。为什么？_________________________________________________________。防止目的基因自连和质粒自连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率，防止目的基因与质粒反向连接否含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏(4)将已经转化的农杆菌进行如下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B(含氨苄青霉素)和C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如下图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出来。答案：4．(2023·广东选择考)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n＝10)进行诱变，筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。回答下列问题：(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与__________植株的种子大小相近。(2)用PCR反应扩增DA1基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达，其上下游序列需具备______________________________________。野生型Ti质粒启动子和终止子(3)转化后，T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入，也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如下图所示)，用于后续验证突变基因与表型的关系。①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了____________________________________。②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约____%的培养基中幼苗继续培养。DA1基因(和卡那霉素抗性基因)③将②中选出的T2代阳性植株__________(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到______%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。自交10075为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性内切核酸酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下图，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。答案：如图所示：03考点三DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定1．DNA的粗提取与鉴定(1)实验原理。蛋白质2mol/L二苯胺蓝(2)方法步骤(以洋葱为例)。4℃离心预冷的酒精二苯胺蓝色[易错提醒]加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状物。本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)，可选用鸡血细胞作为材料。2．DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)原理。①PCR原理：DNA的热变性原理，即通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。变性

→

复性

→

延伸②电泳。带电分子大小和构象在相同电泳条件下，DNA分子量越小，电泳迁移速度越快。(2)方法步骤。①PCR扩增。准备→移液→混合→______→反应。②鉴定PCR产物：琼脂糖凝胶电泳法。配制琼脂糖溶液→制备琼脂糖凝胶→将电泳缓冲液加入电泳槽中→加样→电泳→取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。离心[易错提醒]为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理；在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染；离心的目的是使挂在管壁上的液体全部甩下。考向1

DNA的粗提取与鉴定1．下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是(

)A．新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于DNA的粗提取B．DNA不溶于体积分数为95%的冷酒精而溶于2mol/L的NaCl溶液C．在研磨植物细胞时加入研磨液是为了溶解细胞壁D．溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂后即呈蓝色B2.（2024·安徽选择考）下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（

）A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNAC．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质DC考向2

DNA片段的扩增及电泳鉴定3．下列关于PCR操作过程的叙述，错误的是(

)A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理B．PCR利用了DNA的热变性原理C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换4．在基因工程操作过程中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如下图所示。以下相关叙述中，错误的是(

)A．该载体最可能为链状DNA分子B．两种限制酶在载体上各有一个酶切位点C．限制酶R1与R2的切点最短相距约200bpD．限制酶作用位点会导致磷酸二酯键断裂A高考真题体验1．(2024·高考全国卷甲)某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。(1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是__________，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是______________________。(2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在__________________________________________________________________(答出两点即可)；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是__________________。变性氢键避免目的基因或质粒自身连接、防止目的基因与质粒反向连接T4DNA连接酶(3)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是_________________________________；