检验科人才PCR技术试卷与答案

检验科人才PCR技术试卷与答案一、单选题（每题2分，共30分）1.PCR技术的基本反应步骤不包括（）A.变性B.退火C.延伸D.连接答案：D解析：PCR技术的基本反应步骤包括变性、退火和延伸，连接不是PCR的基本反应步骤。变性是使双链DNA解开成单链；退火是引物与单链DNA模板结合；延伸是在DNA聚合酶作用下合成新的DNA链。2.在PCR反应中，引物的作用是（）A.提供模板B.提供3'-OH末端，供DNA聚合酶延伸C.提供5'-OH末端，供DNA聚合酶延伸D.激活DNA聚合酶答案：B解析：引物是一小段单链DNA或RNA，它能与模板DNA互补配对，为DNA聚合酶提供3'-OH末端，使DNA聚合酶能够从这个末端开始延伸合成新的DNA链。3.PCR反应中，TaqDNA聚合酶的最适温度是（）A.55℃B.72℃C.94℃D.60℃答案：B解析：TaqDNA聚合酶是一种耐热的DNA聚合酶，其最适温度约为72℃，在这个温度下它具有较高的活性，能够高效地催化DNA链的延伸。4.以下哪种物质不是PCR反应体系的必需成分（）A.dNTPB.引物C.模板DNAD.连接酶答案：D解析：PCR反应体系的必需成分包括模板DNA、引物、dNTP（脱氧核苷三磷酸）、DNA聚合酶和缓冲液等。连接酶主要用于连接DNA片段，不是PCR反应体系的必需成分。5.PCR反应中，变性温度一般为（）A.55℃B.72℃C.94℃D.60℃答案：C解析：变性温度通常为94℃左右，在这个温度下，双链DNA分子的氢键断裂，解开成单链，为后续引物的结合和DNA聚合酶的延伸提供模板。6.引物设计时，引物的长度一般为（）A.510bpB.1530bpC.3050bpD.50100bp答案：B解析：引物长度一般在1530bp之间。引物过短，特异性较差，容易与非目标序列结合；引物过长，合成成本增加，且可能导致退火效率降低。7.在PCR反应中，循环次数一般为（）A.510次B.1020次C.2535次D.4050次答案：C解析：循环次数一般设置为2535次。循环次数过少，扩增产物量不足；循环次数过多，可能会导致非特异性扩增增加，同时也会增加实验时间和成本。8.以下关于实时荧光定量PCR的描述，错误的是（）A.可以对PCR产物进行实时监测B.不需要引物C.可以定量检测核酸的起始量D.常用的荧光标记方法有SYBRGreenI法和TaqMan探针法答案：B解析：实时荧光定量PCR同样需要引物。它是在PCR反应体系中加入荧光基团，通过对荧光信号的实时监测来实现对PCR产物的定量分析。常用的荧光标记方法有SYBRGreenI法和TaqMan探针法，能够定量检测核酸的起始量。9.SYBRGreenI法实时荧光定量PCR中，SYBRGreenI能与（）结合。A.双链DNAB.单链DNAC.RNAD.蛋白质答案：A解析：SYBRGreenI是一种荧光染料，它能与双链DNA结合，结合后荧光信号增强，通过检测荧光信号的强度可以反映双链DNA的扩增情况。10.TaqMan探针法实时荧光定量PCR中，TaqMan探针的5'端标记（），3'端标记（）。A.荧光报告基团，荧光淬灭基团B.荧光淬灭基团，荧光报告基团C.放射性标记物，荧光标记物D.生物素，地高辛答案：A解析：TaqMan探针的5'端标记荧光报告基团，3'端标记荧光淬灭基团。当探针完整时，报告基团发射的荧光被淬灭基团吸收；在PCR延伸过程中，TaqDNA聚合酶的5'-3'外切酶活性将探针切断，报告基团与淬灭基团分离，荧光信号释放，从而实现对PCR产物的监测。11.逆转录PCR（RTPCR）的第一步是（）A.以RNA为模板合成cDNAB.以cDNA为模板进行PCR扩增C.提取RNAD.设计引物答案：A解析：逆转录PCR（RTPCR）首先要以RNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA，然后再以cDNA为模板进行PCR扩增。12.多重PCR是指（）A.在一个反应体系中同时扩增多个靶序列B.进行多次PCR反应C.使用多种DNA聚合酶进行PCRD.使用多种引物进行PCR答案：A解析：多重PCR是在一个反应体系中同时加入多对引物，同时扩增多个靶序列，可用于同时检测多个基因或病原体等。13.巢式PCR与普通PCR相比，其优点是（）A.灵敏度更高B.特异性更强C.扩增效率更高D.以上都是答案：D解析：巢式PCR采用两对引物进行两轮PCR扩增。第一轮使用外引物进行扩增，第二轮使用内引物对第一轮的扩增产物进行再次扩增。这样可以提高扩增的灵敏度、特异性和效率，减少非特异性扩增的影响。14.PCR产物的检测方法不包括（）A.琼脂糖凝胶电泳B.聚丙烯酰胺凝胶电泳C.测序D.免疫印迹法答案：D解析：PCR产物的检测方法有琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、测序等。免疫印迹法主要用于检测蛋白质，不是PCR产物的检测方法。15.在PCR实验中，为了防止交叉污染，以下做法错误的是（）A.使用一次性吸头B.在不同的区域进行试剂准备、样本处理和PCR扩增C.定期对实验设备进行清洁和消毒D.多人共用一套移液器答案：D解析：为防止交叉污染，应使用一次性吸头，在不同区域进行试剂准备、样本处理和PCR扩增，定期对实验设备进行清洁和消毒。多人共用一套移液器容易导致样本之间的交叉污染，是错误的做法。二、多选题（每题3分，共30分）1.PCR技术的应用领域包括（）A.基因克隆B.疾病诊断C.亲子鉴定D.物种鉴定答案：ABCD解析：PCR技术在多个领域有广泛应用。在基因克隆中，可用于扩增目的基因；在疾病诊断方面，可检测病原体、基因突变等；亲子鉴定通过扩增特定的基因片段进行比对；物种鉴定可通过扩增物种特异性的基因序列来实现。2.影响PCR反应特异性的因素有（）A.引物的特异性B.退火温度C.镁离子浓度D.循环次数答案：ABC解析：引物的特异性直接影响PCR反应能否准确扩增目标序列；退火温度过高或过低都会影响引物与模板的结合特异性；镁离子浓度会影响DNA聚合酶的活性和引物与模板的结合，从而影响反应特异性。循环次数主要影响扩增产物的量，对反应特异性影响较小。3.以下关于PCR反应体系中dNTP的描述，正确的是（）A.包括dATP、dTTP、dCTP和dGTPB.提供合成DNA的原料C.浓度过高可能导致非特异性扩增D.浓度过低会影响扩增效率答案：ABCD解析：dNTP包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP，是合成DNA的原料。dNTP浓度过高，可能会增加非特异性扩增的几率；浓度过低，会使DNA聚合酶缺乏足够的底物，影响扩增效率。4.实时荧光定量PCR常用的定量方法有（）A.绝对定量B.相对定量C.终点定量D.内参定量答案：AB解析：实时荧光定量PCR常用的定量方法有绝对定量和相对定量。绝对定量是通过已知浓度的标准品绘制标准曲线，来确定样本中核酸的绝对含量；相对定量是比较不同样本中目的基因的表达差异。终点定量不是实时荧光定量PCR的常用定量方法；内参定量是相对定量中常用的一种策略，用于校正样本间的加样误差等，但不是一种独立的定量方法。5.逆转录酶的作用包括（）A.以RNA为模板合成cDNAB.具有RNaseH活性，可降解RNADNA杂交体中的RNAC.具有DNA聚合酶活性，可合成双链DNAD.具有连接酶活性，可连接DNA片段答案：ABC解析：逆转录酶能以RNA为模板合成cDNA，同时具有RNaseH活性，可降解RNADNA杂交体中的RNA，还具有DNA聚合酶活性，可进一步合成双链DNA。逆转录酶不具有连接酶活性。6.多重PCR设计引物时需要注意的问题有（）A.引物之间不能形成引物二聚体B.各对引物的退火温度应尽量相近C.引物的长度应尽量一致D.避免引物与非目标序列结合答案：ABCD解析：在多重PCR引物设计中，引物之间不能形成引物二聚体，否则会影响扩增效率和特异性；各对引物的退火温度应尽量相近，以便在同一退火条件下都能有效结合模板；引物长度尽量一致有助于保证扩增效率的一致性；同时要避免引物与非目标序列结合，提高反应的特异性。7.巢式PCR中，内引物和外引物的关系是（）A.内引物位于外引物的内侧B.内引物和外引物的序列不同C.外引物先进行扩增，内引物再对扩增产物进行扩增D.内引物的扩增效率高于外引物答案：ABC解析：巢式PCR中，内引物位于外引物的内侧，二者序列不同。先使用外引物进行第一轮扩增，然后以第一轮的扩增产物为模板，用内引物进行第二轮扩增。内引物和外引物的扩增效率并没有绝对的高低之分。8.PCR产物的纯化方法有（）A.凝胶回收法B.柱纯化法C.乙醇沉淀法D.酚氯仿抽提法答案：ABCD解析：PCR产物的纯化方法有多种。凝胶回收法是通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，然后从凝胶中切下目标条带进行回收；柱纯化法利用硅胶柱等对PCR产物进行吸附和洗脱；乙醇沉淀法通过加入乙醇使PCR产物沉淀下来；酚氯仿抽提法可去除蛋白质等杂质，实现PCR产物的纯化。9.在PCR实验中，可能导致假阳性结果的原因有（）A.样本交叉污染B.引物特异性差C.实验环境中有残留的PCR产物D.模板DNA中存在非目标序列的同源序列答案：ABCD解析：样本交叉污染会使其他样本的DNA混入当前样本，导致假阳性；引物特异性差会与非目标序列结合并扩增；实验环境中有残留的PCR产物，可能会污染新的反应体系；模板DNA中存在非目标序列的同源序列，引物可能会与之结合并扩增，从而产生假阳性结果。10.以下关于PCR技术发展趋势的描述，正确的是（）A.向高通量、自动化方向发展B.与其他技术的结合越来越紧密C.检测灵敏度和特异性不断提高D.应用领域不断拓展答案：ABCD解析：PCR技术的发展趋势包括向高通量、自动化方向发展，以提高检测效率和减少人为误差；与其他技术如测序技术、芯片技术等结合越来越紧密，实现更全面、准确的分析；检测灵敏度和特异性不断提高，能够检测到更低含量的目标核酸；应用领域也在不断拓展，如在环境监测、食品检测等领域的应用越来越广泛。三、简答题（每题10分，共30分）1.简述PCR技术的基本原理。答：PCR技术即聚合酶链式反应，其基本原理是模拟体内DNA复制的过程，在体外特定条件下，通过酶促反应快速扩增特定DNA片段。具体如下：（1）变性：将反应体系加热至94℃左右，使双链DNA模板的氢键断裂，解开成单链DNA，为后续引物的结合提供模板。（2）退火：将温度降低至引物的退火温度（一般为5565℃），引物与单链DNA模板互补配对结合。（3）延伸：将温度升高至72℃左右，在DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3'-OH末端开始，按照碱基互补配对原则合成新的DNA链。这三个步骤为一个循环，每经过一个循环，DNA模板的数量大约增加一倍。经过2535个循环后，可使目标DNA片段得到大量扩增。2.简述实时荧光定量PCR的原理和优点。答：原理：实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，通过对荧光信号的实时监测来实现对PCR产物的定量分析。常用的荧光标记方法有SYBRGreenI法和TaqMan探针法。SYBRGreenI法：SYBRGreenI是一种荧光染料，能与双链DNA结合，结合后荧光信号增强。在PCR扩增过程中，随着双链DNA的增加，SYBRGreenI结合的量也增加，荧光信号强度随之增强，通过检测荧光信号的强度可以反映双链DNA的扩增情况。TaqMan探针法：TaqMan探针的5'端标记荧光报告基团，3'端标记荧光淬灭基团。当探针完整时，报告基团发射的荧光被淬灭基团吸收；在PCR延伸过程中，TaqDNA聚合酶的5'-3'外切酶活性将探针切断，报告基团与淬灭基团分离，荧光信号释放，通过检测荧光信号的变化来监测PCR产物的扩增。优点：（1）实时监测：可以实时监测PCR反应的进程，无需在反应结束后进行电泳等后续检测，节省时间。（2）定量准确：能够准确地定量检测核酸的起始量，可用于基因表达分析、病原体定量检测等。（3）灵敏度高：可以检测到低含量的目标核酸。（4）特异性强：通过设计特异性的引物和探针，能够有效区分目标序列和非目标序列。（5）污染风险低：采用闭管检测，减少了PCR产物污染的风险。3.简述PCR实验中常见的问题及解决方法。答：（1）无扩增产物原因：模板DNA质量不佳、引物设计不合理、DNA聚合酶活性低、dNTP浓度过低、循环参数设置不当等。解决方法：重新提取高质量的模板DNA；重新设计引物，确保引物的特异性和退火温度合适；更换活性高的DNA聚合酶；调整dNTP浓度至合适范围；优化循环参数，如调整变性、退火和延伸温度及时间。（2）非特异性扩增原因：引物特异性差、退火温度过低、镁离子浓度过高、循环次数过多等。解决方法：重新设计特异性强的引物；适当提高退火温度；调整镁离子浓度；减少循环次数。（3）引物二聚体原因：引物之间互补配对形成引物二聚体。解决方法：重新设计引物，避免引物之间存在互补序列；适当提高退火温度；降低引物浓度。（4）假阳性结果原因：样本交叉污染、实验环境中有残留的PCR产物、引物特异性差等。解决方法：严格遵守实验操作规范，使用一次性吸头，在不同区域进行试剂准备、样本处理和PCR扩增；对实验环境进行清洁和消毒，防止残留的PCR产物污染；重新设计特异性强的引物。（5）假阴性结果原因：模板DNA中目标核酸含量过低、抑制剂存在、PCR反应体系中成分失效等。解决方法：增加模板DNA的用量；去除模板DNA中的抑制剂，如采用纯化方法；更换新鲜有效的PCR反应体系成分，如DNA聚合酶、dNTP等。四、论述题（10分）论述PCR技术在疾病诊断中的应用及前景。答：PCR技术在疾病诊断中具有重要的应用价值，并且前景十分广阔。应用1.病原体检测病毒检测：PCR技术可快速、灵敏地检测各种病毒，如乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）等。通过扩增病毒的特定基因片段，能够在感染早期检测到病毒的存在，有助于及时诊断和治疗。例如，在新冠疫情期间，实时荧光定量PCR技术成为新冠病毒核酸检测的主要方法，为疫情防控提供了关键支持。细菌检测：对于一些难以培养或培养时间较长的细菌，如结核杆菌，PCR技术可以直接从临床样本中扩增其特异性基因，大大缩短了检测时间，提高了诊断效率。同时，还可以检测细菌的耐药基因，指导临床合理使用抗生素。寄生虫检测：可用于检测疟原虫、弓形虫等寄生虫感染。通过检测寄生虫的特定核酸序列，能够准确诊断寄生虫病，尤其是在一些症状不典型的病例中，PCR技术具有重要的诊断价值。2.遗传病诊断单基因遗传病诊断：对于已知致病基因的单基因遗传病，如地中海贫血、血友病等，PCR技术可以扩增相关基因的特定区域，结合测序等技术，检测基因突变，实现疾病的早期诊断和产前诊断。例如，通过对胎儿的羊水或绒毛样本进行PCR检测，可以在孕期发现胎儿是否携带致病基因，为遗传咨询和生育决策提供依据。多基因遗传病诊断：虽然多基因遗传病的发病机制较为复杂，但PCR技术可以用于检测与疾病相关的多个基因位点的变异，评估个体患某种多基因遗传病的风险，如心血管疾病、糖尿病等