水产动物疾病学实验

水产动物疾病学实验

实验教学基本要求：

1、运用所学的《水产动物疾病学》等理论课中的概念和理论知识来指导实验，并通过实验获得相关的感性知识，从而更进一步地巩固所学的理论课知识。2、熟练地掌握水产动物疾病学实验的基本操作与基本技能，通过仔细观察和相互比较来熟悉水产动物常见疾病的主要症状、危害程度及流行情况；掌握水产动物疾病诊断的常规步骤与方法；了解主要疾病病原体的生物学与生态学特征及生活史等；了解水产常见药物的药理与使用方法；熟悉水产动物疾病大类的预防与治疗方法。3、按实验指导书上所述方法，在完成相关的实验操作后，通过观察、分析能认真仔细地独立撰写实验报告；并通过理论与实践知识的累积，不断提高自子解决问题的能力和实际动手操作能力。4.要求课前，弄懂进行预习实验目的和原理，熟悉内容和步骤，写出相应的预习报告。

实验项目实验一疾病常规检查方法与诊断

一、实验目的通过对本实验课的学习，了解常规的肉眼检查和显微镜检查疾病的方法，对检查结果进行分析、比较，进行疾病诊断二、实验材料、仪器活的或刚死的病鱼，显微镜、介剖镜、介剖盘、介剖剪、介剖刀、镊子、吸管、载玻片、盖玻片等。

三;疾病检查与诊断程序１基本情况２体表检查３体内检查４根据检查情况进行初步诊断５病原体确定进行确诊。四、实验方法一、基本情况调查：

水质情况、吃食情况、用药情况、发病情况等。二、肉眼检查；

（1）体表：大型寄生虫、发炎、充血、腐烂、体色变化等；（2）体内器官：大型寄生虫、发炎、充血、腐烂、器官色素变化等。三、显微检查：病灶部位和可疑部位取样制片在显微镜、介剖镜下检查。五：病原体检查1病原体分离与培养：2pcR仪器检测病原体：3酶联体检测病原体：六疾病诊断１：疾病诊断是一个复杂的．综合的分析判断过程，它是根据环境条件，发病对象，发病季节，发病症状与表现，病原体确定等因素做出的综合分析判断结果。２：疾病诊断是确定引起疾病发生的主要原因，疾病过程与发病机理。疾病诊断３：疾病诊断方法（１）根据症状诊断（２）根据病原体诊断（３）综合诊断作业一１疾病检查的一般程序？２疾病诊断的方法？正确诊断的意义？实验二：病毒疫苗土法制备一、实验目的1.了解土法疫苗免疫的原理，掌握其制备方法和注射方法（或了解细菌性灭活疫苗制备的基本过程）。2.掌握草鱼出血性病毒疫苗制备（或组织浆灭活疫苗制备）的基本过程。二、仪器设备1.解剖工具（剪刀、镊子）、台秤（天平）、组织打浆机或匀浆机（或研钵）、水浴锅、温度计、注射器、量筒、三角锥瓶、漏斗、水壶；2.剪刀、天平、蔡氏过滤器、塑料微型滤器、冰箱、液氮罐、离心机。三、实验材料1.患草鱼三大病（赤皮、肠炎、烂鳃病）的草鱼，最好是三大病并发的濒死或刚死不久的草鱼；2.患典型出血病的濒死或刚死不久的草鱼。四、实验药品1.甲醛、生理盐水、70%的酒精；2.青霉素、链霉素、生理盐水、70%的酒精、50%缓冲甘油、PBS液、Earle培养液。

五、实验内容

1.病毒材料收集与保存（1）无菌操作收集，病毒不灭活，材料标本不能在太阳下曝晒，要在阴暗低温处；（2）用发病早期的鱼（典型出血病），不用已经死亡的鱼，用水冲洗体表，再用70%的酒精消毒体表，然后才取出肌肉、内脏，随即放入50%缓冲甘油内保存，写好标签（地点、寄主、日期），野外收集最好用冰壶带回，保存在-20℃或5℃冰箱内。

2.活苗的制备

无菌操作取出病灶（肌肉、内脏组织），称重后剪碎，加10倍无菌生理盐水，匀浆，3000～3500转/分低温离心30分钟，取上清液，加青霉素1000IU/mL，链霉素1000μg/mL，混匀，再在4℃下过夜除菌后即为病毒悬液。

2.灭活

加入福尔马林，使成0.1%浓度，摇匀后，置于32℃恒温水浴锅灭活72小时。化学灭活：以福尔马林作为化学灭活剂。灭活前先确定福尔马林对该病原菌的安全灭活浓度，确定方法为：取7支灭菌试管，分别5ml加入预先制备病原菌菌液，其中6支装有菌液的试管分别依次加入一定量的福尔马林，使福尔马林的终浓度分别为0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，另1支试管不加入福尔马林作为对照；于4℃下放置24h后，于每支试管中分别取0.2ml菌液于2216E琼脂平板上涂布，28～30℃下培养48h，检测各试管内细菌的存活情况，只有没有细菌生长的对应福尔马林浓度才是该病原菌的灭活安全浓度。向第1步中制备的1%菌悬液内添加福尔马林，使福尔马林的最终浓度达到安全灭活浓度以上，于4℃下放置24h，制备灭活菌液。.安全和效力试验

（1）安全性检测活性检测：取0.2ml灭活菌于2216E琼脂平板上涂布，28～30℃下培养48h，只有在琼脂平板上没有出现菌落出现才说明灭活彻底，灭活菌液中确实没有活菌存在。安全检测：将所制备的灭活菌液稀释成疫苗接种所用的浓度（一般为108cfu），用注射法将稀释后的灭活菌液接种到无患病史的同种寄主动物（水产养殖动物）体内，经20d观察无发病或死亡才说明该灭活细菌是安全的

攻毒感染实验：选择无患病史的同种同龄寄主动物（水产养殖动物）作为感染对象，用注射法进行攻毒感染。用注射法将稀释后的灭活菌液接种到无患病史的同种寄主动物

（水产养殖动物）体内，连续养殖2个月，从第20d开始每隔20d取10尾以上接种生物用活的病原菌进行感染，感染方法为：。4.保存石蜡封瓶口，贴上标签，4～8℃冰箱中密封保存。5.注射腹腔注射，每尾0.1～0.2mL（2）效果检测抗体效价检测：用注射法将稀释后的灭活菌液接种到无患病史的同种寄主动物（水产养殖物）体内，连续养殖动2个月，从第10d开始每隔10d取3尾以上接种生物用微量血凝板法检测其平均凝集抗体效价。抗体效价检测方法为：抽取感染动物血液并离心分离血清，用取样器吸取0.1ml血清加入经灭菌的96孔板的A1孔内，在96孔板A行的其他孔内加入0.05ml无菌PBS，从A1孔内取0.05ml血清加入A2孔内，混匀后再从A2孔内取0.05ml液体加入A3孔内……，如此重复，使96孔板内后1个孔内的血清浓度均比前1个孔低1倍（倍释法），再在96孔板的每个孔内加入0.05ml菌液（活的或灭活的均可），37℃孵育过夜后观察（最好在96孔板下垫一张黑纸以增加反差），出现沉淀的最高血清稀释倍数即为血清中所含抗病原菌抗体的效价。比较不同时期内抗体效价的变化情况，确定最高抗体效价值。一般情况下，抗体效价越高，灭活细菌作为疫苗的效果就最好。4.免疫注射方法取土疫苗若干，加生理盐水1倍稀释摇匀后备用。将要免疫注射的鱼放在0.2%～0.25%浓度（50千克水中加入100克～125克晶体敌百虫）的敌百虫溶液中浸泡3分钟～5分钟，使鱼儿暂时处于麻醉状态。然后在其背鳍基部后端无鳞处肌肉注射或在腹鳍基部进行腹腔注射。注射剂量依鱼体大小而定，10厘米～13厘米的草鱼，每尾注射0.1毫升；14厘米～16厘米的鱼，每尾注射0.2毫升；20厘米以上的鱼每尾注射0.3毫升～0.5毫升。实验三：虾蟹类病毒病的简易诊断

一、实验目的通过对虾蟹病毒病的病变标本观察，掌握虾蟹病毒病的主要可见症状，了解虾蟹病毒病流行情况和危害性，掌握虾蟹类病毒病的简易诊断方法。二、实验用具解剖工具（小镊子、小剪刀、解剖针）、显微镜、载玻片、盖玻片、、擦镜纸等。三、实验材料药品患病毒病虾类的活体标本和固定标本，0.1%孔雀绿溶液。

四、实验内容：

1、患病毒病虾的活体标本和固定标本的可见症状观察：（1）先将活体虾小型透明容器内，加水观察虾的附肢、甲壳变红，有无粘附物，有无黑色、白色、黄色褐色等斑块；肝胰脏是否肿胀或变浊发白；腹部肌肉是否变浊。并做好纪录。（2）再在解剖盘中观察活体虾、固定标本（1）的内容。做好两种标本的观察纪录并作比较。2、患病毒病虾的活体标本的光学显微观察：（1）虾类肝胰脏的获取：去掉虾的头胸甲，用解剖针小心拨开虾体头顶部的肝胰脏团（黄褐色），再用镊子取一小块肝胰脏。（2）在载玻片滴一滴0.1%孔雀绿溶液，用盖玻片压成薄片，几分钟后在高倍镜观察有无蓝绿色的核内较大的包函体，每人观察3-5个压片。做好纪录。3、根据1、2观察结果，作出虾病的初步诊断。五、思考题

1.对虾白斑杆状病毒病与对虾中肠腺坏死病毒病症状有何区别？2.虾类细菌性疾病是否用此方法看到核内较大的包函体，为什么？

实验四鱼类细菌性疾病

一、实验目的通过对患细菌性病病鱼活体和固定标本及病原体的观察，掌握鱼类细菌性体表疾病的主要症状和病原体的形态特征，了解常见鱼类细菌性体表疾病流行情况和危害性，掌握其诊断方法和防治方法；为今后诊断传染性疾病打下基础。二、实验用具解剖工具（小镊子、小剪刀、解剖针）、解剖镜、显微镜、载玻片、盖玻片、纱布、擦镜纸、酒精灯、皮管、火柴等。三、实验材料药品草酸铵结晶紫液或品兰、革兰氏碘液、番红液或曙红、95%酒精、0.85%生理盐水、蒸馏水。.烂鳃、赤皮病、疖疮病等鱼类患病活体标本和固定标本四、实验内容

（一）病变标本观察1.烂鳃病观察：肉眼观察病鱼头部颜色特别暗黑，鳃丝腐烂发白，常粘有许多污泥，严重时鳃丝尖端软骨外露，鳃盖骨内表皮充血，中间部分表皮被腐蚀成一个小洞，从外表看像透明天窗。2.赤皮病的观察：主要病变是病鱼体表部分或大部分出血，发炎、鳞片脱落，特别在鱼体俩侧，更为明显，鳍基部充血，鳍条腐烂。3.疖疮病的观察：主要病变是病鱼鳍条腐烂，体表、鳍基充血，体色变黑，特别在鱼体俩侧上部有疖状隆起，隆起处内部肌肉腐烂，但鳞片不脱落（疾病中期前）4.上述观察做好纪录。（二）病原体的观察

1.活体观察烂鳃病的病原体柱状嗜纤维菌，用载玻片进行高倍镜或油镜观察细菌活体的运动和菌体形态特征。2.固定染色观察：细菌可用镜检作活体检查，但由于体积很小，胞质透明，细胞结构不易辨别，用革兰氏染色根据细菌对染料的不同反应，可区分细菌为两大类，即阴性和阳性。

六、思考题1.鱼类细菌性体表疾病有哪些共同症状？2.烂鳃、疖疮病、赤皮病病变的主要特征是什么？实验五：虾蟹类细菌性体表疾病

一、实验目的通过对蟹类细菌病的疾病活体标本观察，掌握虾蟹细菌性疾病的主要可见症状，了解流行情况和危害性，掌握虾蟹类细菌病的防治方法。二、实验用具解剖工具（小镊子、小剪刀、解剖针）、解剖镜、显微镜、载玻片、盖玻片、、擦镜纸等。三、实验材料药品患细菌性疾病蟹的活体标本和固定标本，染色液。四、实验内容：

1、患细菌性疾病蟹的活体标本和固定标本的可见症状观察：（1）再在解剖盘中观察患细菌性疾病病蟹活体，观察蟹的附肢及甲壳，有无粘附物，有无黑色、黄色、黄褐色等斑块；鳃是否肿胀或发白、发黄、变黑色；肠道是否变黑。并做好纪录。（2）、固定标本（1）的内容。做好两种标本的观察纪录并作比较。2、病原体显微观察：取病蟹鳃或肠道病变组织小片，在载玻片滴一滴染料溶液，用盖玻片压成薄片，几分钟后在高倍镜观察有无活动的菌体，每人观察3-5个压片。做好纪录。3、根据1、2观察结果，作出蟹病的初步诊断。五、思考题1.蟹细菌性鳃病有哪些主要症状？2.蟹类细菌性疾病如何防治？

实验六：藻类和真菌性疾病的诊断

一、实验目的通过对水产动物真菌和藻类疾病活体和固定标本及病原体的观察，掌握真菌和藻类疾病的主要症状，了解真菌和藻类病原体的形态特征、疾病的流行情况和危害性，掌握真菌和藻类疾病的防治方法。二、实验用具解剖工具（小镊子、小剪刀、解剖针）、解剖镜、显微镜、载玻片、盖玻片、、擦镜纸等。三、实验材料药品患真菌和藻类疾病的鱼类、虾蟹类活体标本和固定标本。四、实验内容：

1、患真菌和藻类疾病的活体标本和固定标本的可见症状观察：（1）再在解剖盘中观察患真菌和藻类疾病鱼类、虾蟹类活体，观察它们的受精卵、胚胎、幼体及成体，看有无粘附物；有无黑色、黄色、黄褐色等斑块；有无白色真菌丝状体（外菌丝）；受精卵、胚胎是否变浊发白。并做好纪录。（2）、固定标本（1）的内容。做好两种标本的观察纪录并作比较。2、病原体显微观察：

取活体病变组织小片，置于载玻片上，用盖玻片压成薄片，在低倍镜观察有无白色真菌丝状体或藻类，每人观察3-5个压片。做好纪录。3、根据1、2观察结果，作出疾病的初步诊断。

五、思考题：1.鱼类卵甲藻病的主要症状？2.鱼类真菌性疾病如何防治

实验七：鞭毛虫病的观察

一、实验目的识别寄生于鱼类的常见纤毛虫、鞭毛虫：车轮虫、小瓜子虫、斜管虫、半眉虫、肠袋虫、鳃隐鞭虫、锥体虫、鱼波豆虫等；了解常见纤毛虫、鞭毛虫病的症状、危害情况、流行范围，掌握各种病原的特征、诊断和防治方法。二、实验仪器设备解剖盘、解剖刀、解剖剪、镊子、解剖针、显微镜、培养皿、擦镜纸、载玻片、盖玻片、胶头吸管、纱布或卷纸三、实验药品生理盐水四、实验材料各种水产动物纤毛虫、鞭毛虫病病原的活体标本或染色固定标本五、实验内容和观察步骤

1.锥体虫的观察：这种病原体是寄生在血液里的寄生虫，因肉眼看不见，，外表症状不明显，要诊断此病，只有通过血液镜检，寄生在青鱼和鳙鱼血里的锥体虫活体，身体透明，狭长，行动活泼，但位置不大移动，很像泥鳅活动状。

2.隐鞭虫：寄生在鳃丝，检查方法是从鳃上取黏液或剪下鳃丝进行检查，在鳃上活的鳃隐鞭虫，用后鞭毛固着在鳃丝表皮上，大量寄生时，成群地聚集在鳃丝两侧，波动膜不断地作波浪颤动，因此虫体不断地摆动。细胞质活体时呈淡绿色或无色，常含有少量的食物粒。4.漂游鱼波豆虫：此种寄生虫的寄生状态是以两条鞭毛插入鱼的鳃丝或皮肤的表皮细胞内。活的虫体，细胞质一般呈无色透明，有时可见到几个发亮的食物粒，虫体的侧面观呈梨形或卵形，侧腹面观略似汤匙，并有一条纵的口沟，口沟的前端，有一个由基粒组成的生毛体，从此长出两根等长的向后伸的鞭毛，胞核圆形，位于身体中央或稍前

思考题

1.如何区分鱼波豆虫和隐鞭虫？参阅鞭毛2.危害最大的是哪一类鞭毛虫？为什么？隐鞭虫，参阅流行情况实验八：孢子虫病的观察

一、实验目的观察孢子虫、吸虫的病变标本及常见属的形态；了解各种孢子虫的危害对象、流行范围、传播途径；掌握其病原体特征、诊断方法和防治方法。二、实验仪器设备解剖盘、解剖刀、解剖剪、镊子、解剖针、显微镜、擦镜纸、载玻片、盖玻片、胶头吸管、纱布或卷纸三、实验药品生理盐水、碘液、香柏油、二甲苯、甘油、酒精四、实验材料患孢子虫病的病变标本，各种孢子虫的活体和固定标本。

五、实验内容和观察步骤

11.粘孢子虫病：粘孢子虫寄生在海、淡水鱼中鳃、体表、肾、胆等部位，甚为普遍，种类很多。12.粘体虫（Myxosoma）和磺泡虫（Myxobolus）：孢子呈卵形或椭圆形，侧面观察像两块凸透镜，前端有2个披束。前者没有嗜碘泡。都寄生在肠、胆束、心、骨、鳔、膀胱和脊髓等部位。13.四极虫（Chloromyxum）：孢子椭圆形，顶面观为圆形，四个大小相似的梨形极内，位于孢子前方，寄生于鱼类的胆内。14.单极虫（Thelohanellus）：孢子瓜子形或长卵形，极内呈瓶状或梨形，嗜碘泡明显。15.尾泡虫2常见种类壳片极囊嗜碘泡缝线四极虫24,位前端无直两极虫22,位两端无直楚克拉虫22,位两端无S形粘体虫22,位一端无直碘泡虫属22,位一端有直尾孢虫2,每片向后延伸成尾状2,位一端有直单极虫21有直鲢碘泡虫孢子形态病鲫头部胞囊分布鳃上胞囊分布状况思考题

1.如何对孢子虫病进行防治？2.孢子虫有哪些类型和主要种类？

实验九：纤毛虫病的观察

一、实验目的识别寄生于鱼类的常见纤毛虫：车轮虫、小瓜子虫、斜管虫、半眉虫等；了解常见纤毛虫病的症状、危害情况、流行范围，掌握各种病原的特征、诊断和防治方法。二、实验仪器设备解剖盘、解剖刀、解剖剪、镊子、解剖针、显微镜、培养皿、擦镜纸、载玻片、盖玻片、胶头吸管、纱布或卷纸三、实验药品生理盐水四、实验材料各种水产动物纤毛虫、鞭毛虫病病原的活体标本或染色固定标本五、实验内容和观察步骤

1.多子小瓜虫寄生在鱼的体表与鳃上，尤以体表为普遍，在皮肤和鳍上，形成许多白点状的泡和盖着白色的粘液层。检查方法，用镊子刮下一些白点或粘液，放在加有一滴清水的玻片上，静置1～2分钟后，在光亮的地方观察，如果是小瓜子虫，可见到一个个的白色小圆球在慢慢地游动，而且大多数是集中在水滴的边缘。还有一种情况，被小瓜子虫寄生的鱼，死后经约2～3小时，小瓜子虫会有自行脱离鱼体。镜检成虫为圆形或卵形，最大达700～800微米，活体很柔软，可变形，全身长满均匀细短的纤毛，当虫体运动变慢时，可见外质有许多细小的伸缩泡，内质有许多的食物粒，前端有一个很小的胞口，呈“6”字形，但要在位置适当时才易看见。大核呈香肠状或马蹄状，小核球形。3.车轮虫（Trichodina）：寄生在鱼鳃瓣和皮肤上。虫体较大，侧面观像帽子，隆起的一面叫口面，相反一面叫反口面。反口面圆形像盘子，其他边缘生有一圈纤毛带，借这纤毛带可静止不动地附着在鱼的鳃瓣或皮肤上，也可以不断地来回滑动。同时也借助纤毛游泳前进。游泳时十分活泼，常用反口面向前或向上，像车轮转动的样子前进。思考题

1.治疗小瓜虫病有何注意事项？

2.如何治疗车轮虫病？

实验十：吸虫病的观察

一、实验目的观察吸虫的病变标本及常见属的形态；了解各种吸虫病的危害对象、流行范围、传播途径；掌握其病原体特征、诊断方法和防治方法。二、实验仪器设备解剖盘、解剖刀、解剖剪、镊子、解剖针、显微镜、擦镜纸、载玻片、盖玻片、胶头吸管、纱布或卷纸三、实验药品生理盐水、碘液、香柏油、二甲苯、甘油、酒精四、实验材料患吸虫虫病的病变标本，各种吸虫的活体和固定标本。五、实验内容和观察步骤

1.指环虫：指环虫主要特征在头部背面，有四个黑色眼点，呈方形排列，口位于前端腹面眼点附近，呈管状或漏斗状，能伸缩，口接咽，咽下接一短食道，食道下接一分叉的管环形肠，无肛门，虫体后端可见一圆盘状的后吸盘，盘的中央有一对大锚钩，两钩中间有起支持作用的两根横棒相联，在后吸盘边缘由七对边缘小钩。制片观察：除了能看见眼点，后吸盘等上述构造外，还可看到在身体中部或后部有一卵巢，卵巢之后又一精巢等构造，卵巢腺发达分布于身体两侧和肠管的周围。.双穴吸虫属（Diplostomun）：所致的病，又名白内障病。观察双穴吸虫的病变标本时，注意鱼的眼、头部皮肤有无变化，然后将寄生有双穴吸虫的鱼眼珠取出，放在玻片上，在显微镜下观察，就能看见眼珠有活动，用解剖针刺破眼珠（水晶体）或刮下水晶体表面一层，则肉眼可见有些微小的白色点状物随眼珠里的液体流出。此微小白点即为囊蚴。然后置于显微镜下观察，可见囊蚴身体透明扁平，卵圆形，在虫体前端有一个口吸盘，体腹面中央稍后有一腹吸盘，口在吸盘中，下接通过咽的食道，食道后分为盲管状的肠直达体后。侧殖吸虫属：虫体较小近纺锤形，体披小棘，口吸盘圆形，位于亚前端，咽肌肉质，肠在腹吸盘前分叉，精巢一个，卵巢位于精巢前；具阴茎袋，阴茎末端具棘2.三代虫（Gyroclactylus）：在显微镜下观察三代虫，并注意观察其形态构造与指环虫有何明显区别。病鱼鳃上指环虫大量寄生状况鳗鳃上寄生伪指环虫思考题

1.如何对指环虫病进行防治2.简介复殖吸虫的生活史。实验十一：蠕虫病的观察

一、实验目的观察蠕虫寄生在水产动物体的情况，并掌握其形态结构与生活史；了解绦虫、线虫病的流行及危害情况；掌握其诊断和防治方法。二、实验仪器解剖盘、解剖刀、解剖剪、镊子、解剖针、解剖镜、显微镜、培养皿、擦镜纸、载玻片、盖玻片、胶头吸管、纱布或卷纸三、实验药品生理盐水、酒精、乙醚四、实验材料蠕虫虫体的活体或固定标本、五、实验内容

1.舌状绦虫（舌型绦虫）：观察舌状绦虫在鱼体内的寄生情况，肉眼可见病鱼腹部膨大，虫体充满腹腔。2.九江头槽绦虫：虫体扁平带状。头节略呈心脏形，顶端凹入为顶盘，后端节片可见到生殖器官。3.许氏绦虫：许氏绦虫与鲤蠢相似，头部有不规则的皱折，较宽，下接较狭小的颈部。病异育银鲫外观,示腹部膨大严重发病的异育银鲫体腔内绦虫寄生情况,内脏极度萎缩,肠支细线状头槽绦虫剖开肠道,内充满白色绦虫,脓状