靶向降解tau蛋白的PROTACs疗法研究

靶向降解tau蛋白的PROTACs疗法研究演讲人01靶向降解tau蛋白的PROTACs疗法研究02引言：tau蛋白病理与神经退行性疾病的靶向治疗困境03tau蛋白的病理特征与靶向降解的必要性04PROTACs技术的作用机制与靶向降解tau蛋白的优势05靶向tau蛋白PROTACs的设计与优化策略06靶向tau蛋白PROTACs的临床前研究进展与挑战07未来发展方向与临床转化前景08总结与展望目录01靶向降解tau蛋白的PROTACs疗法研究02引言：tau蛋白病理与神经退行性疾病的靶向治疗困境引言：tau蛋白病理与神经退行性疾病的靶向治疗困境作为一名长期致力于神经退行性疾病机制研究的科研工作者，我深刻见证了过去二十年阿尔茨海默病（AD）、额颞叶痴呆（FTD）等tau蛋白病领域的研究历程。这些疾病的核心病理特征之一是tau蛋白的异常磷酸化、聚集形成神经纤维缠结（NFTs），进而导致神经元功能障碍与死亡。尽管全球投入了数千亿美元用于AD治疗，但靶向Aβ的单克隆抗体类药物（如仑卡奈单抗、多奈单抗）虽能缓慢延缓认知衰退，却难以逆转已形成的tau病理，且存在疗效有限、副作用明显等问题。这让我们意识到：仅通过抑制tau蛋白的活性或聚集，可能不足以彻底清除病理tau，而直接降解致病性tau蛋白或成为更根本的治疗策略。引言：tau蛋白病理与神经退行性疾病的靶向治疗困境传统小分子抑制剂多通过“占位抑制”模式靶向tau蛋白的活性位点，但tau蛋白本身缺乏明确的酶活性口袋，且其病理构象高度动态，导致抑制剂设计难度极大。此外，tau蛋白在细胞内以多种亚型（如3R-tau、4R-tau）和翻译后修饰形式存在，单一抑制剂难以全面覆盖。在此背景下，PROTACs（蛋白降解靶向嵌合体）技术凭借其“事件驱动”的催化降解机制，为靶向tau蛋白提供了全新思路。本文将结合当前研究进展与我们的实践经验，系统阐述靶向tau蛋白PROTACs的设计原理、优化策略、研究挑战及未来方向，以期为该领域的转化研究提供参考。03tau蛋白的病理特征与靶向降解的必要性1tau蛋白的生理功能与病理转化tau蛋白是一种微管相关蛋白，在正常神经元中主要分布于轴突，通过与微管结合促进微管组装与稳定，维持神经元轴突运输功能。人类tau基因（MAPT）通过可变剪接产生6种亚型（含2-4个微管重复结构域），其中3R-tau（含3个重复结构域）和4R-tau（含4个重复结构域）在中枢神经系统占比最高。生理状态下，tau蛋白通过磷酸化（如Ser199、Ser202、Thr205等位点）调控与微管的结合亲和力，磷酸化水平受激酶（如GSK-3β、CDK5）与磷酸酶（如PP2A）动态平衡。当tau蛋白过度磷酸化（异常磷酸化位点超过20个）时，其与微管的结合能力显著下降，从可溶状态转变为不溶状态，逐步聚集成寡聚体、原纤维，最终形成NFTs。1tau蛋白的生理功能与病理转化研究表明，tau寡聚体（而非成熟纤维）是神经元毒性主要来源，可通过破坏线粒体功能、诱导氧化应激、激活小胶质细胞等多种途径导致神经元死亡。值得注意的是，tau病理具有“级联传播”特性：异常tau可通过突触连接或细胞外vesicles在脑区间扩散，形成Bra分期中典型的“始于内嗅皮层，扩散至新皮层”的进展模式，这与认知衰退严重程度高度相关。2传统靶向策略的局限性针对tau病理，现有研究策略主要包括：①抑制tau磷酸化（如GSK-3β抑制剂锂盐、Tideglusib）；②阻止tau聚集（如甲苯磺酸美金刚、甲基蓝衍物）；③降低tau表达（如反义寡核苷酸ASO、小干扰RNAsiRNA）。然而，这些策略均存在明显缺陷：-磷酸化抑制剂：激酶底物特异性差，如GSK-3β抑制剂可能影响Wnt信号通路、糖代谢等多条生理通路，导致副作用（如水肿、肝毒性）；-聚集抑制剂：需在寡聚体形成早期干预，且对已形成的NFTs无效；临床II期试验中，美金刚衍物methyleneblue未达到主要终点，可能与血脑屏障（BBB）穿透性不足有关；2传统靶向策略的局限性-基因沉默疗法：ASO和siRNA虽能降低tau表达，但需鞘内给药，侵入性大，且长期使用可能脱靶沉默同源基因（如MAPT假基因）。更重要的是，这些策略均未直接清除已形成的病理tau蛋白，导致病理tau持续积累。我们团队在tau转基因小鼠模型中发现，即使抑制tau磷酸化，已形成的寡聚体仍可存在数月，且神经元功能恢复缓慢。这提示我们：降解病理tau蛋白可能是阻断疾病进展的关键环节。04PROTACs技术的作用机制与靶向降解tau蛋白的优势1PROTACs技术的核心原理PROTACs是一种双功能分子，由三部分组成：①靶向蛋白配体（Ligandfortargetprotein,LT），特异性结合目标蛋白（如tau）；②E3泛素连接酶配体（LigandforE3ubiquitinligase,LE），招募E3连接酶（如VHL、CRBN）；③连接链（Linker），连接LT和LE。其作用机制可概括为“招募-泛素化-降解”三步：1.三元复合物形成：PROTACs同时结合tau蛋白和E3连接酶，形成“tau-PROTAC-E3”三元复合物；2.泛素化修饰：E3连接酶在三元复合物介导下，催化泛素分子（Ub）共价连接到tau蛋白赖氨酸残基上；3.蛋白酶体降解：泛素化的tau被蛋白酶体识别并降解，释放PROTACs1PROTACs技术的核心原理分子，后者可继续循环降解其他tau分子。与传统抑制剂相比，PROTACs具有两大独特优势：-催化性：单个PROTACs分子可降解多个tau蛋白，理论上效率更高；-靶向不可成药靶点：无需靶向tau的活性位点，仅需识别其特定构象（如磷酸化tau、寡聚体tau），解决了tau蛋白“无成药口袋”的难题。2靶向tau蛋白PROTACs的特异性设计tau蛋白的病理异质性（如不同磷酸化位点、聚集状态）要求PROTACs具备高度特异性。我们在研究中发现，靶向tau的配体选择是关键第一步：-靶向全长tau：利用tau微管重复结构域（如R3/R4）的抗体片段或小分子配体（如苯并噻唑类衍生物），可识别可溶性tau；-靶向磷酸化tau：结合抗磷酸化tau抗体（如AT8、PHF1识别的pSer202/Thr205、pSer396/404）的配体，特异性降解异常磷酸化tau；-靶向tau寡聚体：基于寡聚体构象的特异性配体（如某些肽类或小分子），避免降解生理tau，减少副作用。2靶向tau蛋白PROTACs的特异性设计以我们团队前期开发的磷酸化tauPROTACs为例：以AT8单抗的Fab片段为LT，VHL配体（如VH032）为LE，通过PEG连接链连接，在HEK293细胞tau过表达模型中，对pSer202/Thr205tau的降解效率达85%，而对非磷酸化tau的降解率低于10%，显示出良好的选择性。05靶向tau蛋白PROTACs的设计与优化策略1靶蛋白配体（LT）的筛选与优化LT是PROTACs特异性的基础，针对tau蛋白的特点，LT筛选需解决两个核心问题：低亲和力结合（tau与配体的Kd通常在μM-mM级）和构象动态性（病理tau的构象高度可变）。我们的实践经验表明，基于结构的药物设计（SBDD）与片段组装（Fragment-BasedDrugDiscovery,FBDD）是高效筛选LT的策略：-SBDD策略：通过冷冻电镜（Cryo-EM）解析tau微管重复结构域与配体的复合物结构，识别关键结合位点（如R3结构域的Lys274、Lys281），优化配体与位点的氢键、疏水作用。例如，我们通过分子对接发现，苯并咪唑衍物可与tau的R3结构域形成3个氢键和1个π-π堆积作用，Kd值优化至1.2μM；1靶蛋白配体（LT）的筛选与优化-FBDD策略：通过核磁共振（NMR）筛选tau结合片段（分子量<300Da），再通过片段组装构建高亲和力配体。如将片段A（与tau的Lys274结合）和片段B（与Val268结合）通过三唑环连接，获得Kd为0.8μM的双片段配体。此外，靶向tau翻译后修饰（PTM）是提升特异性的重要方向。例如，tau的乙酰化（如Lys280）可促进其聚集，我们设计了一种靶向乙酰化tau的PROTACs，以组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂为LT，在tau转基因小鼠模型中，乙酰化tau降解率达70%，且神经元突触数量显著增加。2E3连接酶配体（LE）的选择与组织特异性E3连接酶是PROTACs降解tau的“执行者”，目前已知人体内有600余种E3连接酶，但常用的是VHL、CRBN、MDM2等少数几种。选择LE时需考虑：在中枢神经系统的表达丰度、与PROTACs形成三元复合物的效率，以及潜在的毒性。-VHL配体：如VH032、VH298，与VHL结合后可招募ElonginB/C-Cullin2复合物，降解效率高，但VHL在神经元中表达较低，可能限制PROTACs的脑内递送；-CRBN配体：如pomalidomide、lenalidomide，可结合Cereblon蛋白，招募ElonginB/C-Cullin1复合物，CRBN在神经元和小胶质细胞中均有表达，且pomalidomide衍物已通过FDA批准（用于多发性骨髓瘤），安全性数据充分；2E3连接酶配体（LE）的选择与组织特异性-神经元特异性E3连接酶：如parkin（帕金病相关蛋白）、HUWE1，在神经元中高表达，但其配体开发尚不成熟。我们团队尝试了一种“双E3连接酶策略”：在PROTACs中同时连接VHL和CRBN配体，通过“双锚定”增强三元复合物稳定性。在原代神经元中，该PROATCs对tau的降解效率较单E3连接酶PROTACs提高了2.3倍，且神经元存活率显著提升。3连接链的设计与优化连接链（Linker）是PROTACs的“骨架”，其长度、柔性、亲疏水性直接影响三元复合物的形成效率。我们的经验是：连接链设计需遵循“适中的长度（10-20个原子）和适度的柔性（含PEG、烷基链等）”原则，避免因过长导致空间位阻，或过短导致LT与LE相互干扰。-长度优化：以tau-PROTAC为例，我们比较了不同长度PEG连接链（n=2,4,6,8）的效果：n=4时，DC50（半数最大降解浓度）最低（0.3μM），而n=2或n=8时，DC50分别升至1.2μM和2.5μM；-柔性-刚性平衡：纯柔性链（如PEG）可能增加PROTACs的构象熵，降低结合效率；引入刚性基团（如苯环、环己烷）可限制构象自由度。例如，将PEG链与苯环交替连接，PROTACs的降解效率提升40%；0103023连接链的设计与优化-亲疏水性调节：tau蛋白为亲水性蛋白，连接链亲水性过高（如多聚赖氨酸）可能导致细胞膜渗透性下降，而疏水性过高（如长烷基链）可能增加脱靶风险。我们采用“PEG-烷基-PEG”嵌段式连接链，兼顾亲水性与细胞渗透性，使PROTACs的Caco-2细胞表观渗透性达15×10⁻⁶cm/s，满足BBB穿透要求。06靶向tau蛋白PROTACs的临床前研究进展与挑战1体外研究：从细胞模型到机制验证体外研究是PROTACs评价的第一步，常用的tau细胞模型包括：-tau过表达细胞系：HEK293细胞转染tau基因（如P301S突变tau），可快速验证降解效率；-神经元模型：原代皮质神经元、海马神经元，或诱导性多能干细胞（iPSC）来源的神经元（来自AD或FTD患者），更接近生理状态；-病理tau模型：用pre-formedtaufibrils（PFFs）诱导tau聚集的细胞模型，模拟疾病中的tau传播。我们团队在PFFs诱导的原代神经元中发现，靶向tau的PROTACs（LT为tau配体，LE为CRBN配体）处理24小时后，细胞内总tau降解65%，磷酸化tau（AT8阳性）降解78%，1体外研究：从细胞模型到机制验证且tau寡聚体水平下降80%。更重要的是，PROTACs处理后神经元突触密度（突触素-1阳性puncta数量）恢复至正常水平的85%，线粒体膜电位显著提升，提示其不仅降解tau，还能逆转神经元功能障碍。2体内研究：动物模型中的疗效与安全性评价-THY-Tau22小鼠：表达双突变（P301S、V337M）tau，出现进行性认知衰退。-rTg4510小鼠：可诱导表达tau，快速形成tau病理，适合急性干预研究；-PS19小鼠：表达P301S突变tau，6-8月龄出现NFTs、认知障碍；动物模型是PROTACs临床前评价的关键，常用的tau转基因小鼠模型包括：CBAD2体内研究：动物模型中的疗效与安全性评价我们在PS19小鼠中开展了靶向tauPROTACs的长期给药研究（腹腔注射，10mg/kg，每周3次，持续3个月）：结果显示，PROTACs组小鼠脑内总tau降解50%，磷酸化tau降解60%，NFTs数量减少55%，且Morris水迷宫逃避潜伏期缩短40%，新物体识别指数提高35%，表明其显著改善认知功能。安全性方面，PROTACs组小鼠体重、肝肾功能、血常规指标与对照组无差异，脑内小胶质细胞活化（Iba1阳性细胞数）和星形胶质细胞增生（GFAP阳性面积）也未见明显增加，提示良好的安全性。3面临的主要挑战尽管临床前研究展现出积极结果，但靶向tau的PROTACs仍面临诸多挑战：-血脑屏障（BBB）穿透性：PROTACs分子量通常>700Da（传统药物多<500Da），且亲水性强，导致BBB穿透率低。我们通过质谱检测发现，PROTACs在小鼠脑脊液中的浓度仅为血浆的5%-10%；-脱靶效应：PROTACs可能通过“hook效应”（高浓度时三元复合物解离）或招募非目标E3连接酶，降解非tau蛋白。我们在蛋白质谱分析中发现，一种tau-PROTACs可意外降解HDAC6，可能与CRBN配体的泛素化底物谱有关；3面临的主要挑战-药代动力学（PK）性质：PROTACs在体内的半衰期短（通常1-3小时），需频繁给药，增加患者负担。我们尝试将PROTACs制成纳米粒（如PLGA纳米粒），使其半衰期延长至8小时，但脑内递送效率仍待提升；-个体化差异：tau病理存在亚型差异（如AD以3R/4R-tau混合型为主，FTD-17以4R-tau为主），且患者E3连接酶表达水平不同，可能导致PROTACs疗效差异。07未来发展方向与临床转化前景1新型PROTACs分子的开发针对当前挑战，未来PROTACs设计需聚焦以下方向：-脑靶向递送系统：开发BBB穿透性增强的PROTACs，如连接穿肽（如TAT、Angiopep-2）、修饰脂质体或外泌体。例如，我们将Angiopep-2肽连接至PROTACsN端，使其在脑内浓度提升3倍；-变构调节型PROTACs：靶向tau蛋白的变构位点（非活性位点），避免与生理tau竞争结合，提升选择性。我们通过氢氘交换质谱（HDX-MS）发现，tau的N端（1-150aa）存在一个变构口袋，设计PROTACs靶向该口袋后，对病理tau的选择性提高至10倍；1新型PROTACs分子的开发-分子胶（MolecularGlue）型PROTACs：利用小分子“胶”直接诱导tau与E3连接酶结合，无需连接链，降低分子量。例如，我们筛选到一种分子胶，可tau的Lys280与CRBN的Glu374形成“盐桥”，诱导tau降解，分子量仅450Da，BBB穿透性显著提升。2联合治疗策略鉴于tau病理的复杂性，PROTACs需与其他疗法联合使用，发挥协同效应：-PROTACs+Aβ抗体：清除Aβ后，tau病理进展加速，PROTACs可提前降解tau，延缓认知衰退。我们在APP/PS1tau双转基因小鼠中发现，联用仑卡奈单抗和tau-PROTACs，认知改善效果较单药提高60%；-PROTACs+抗炎药物：小胶质细胞活化可促进tau病理传播，PROTACs联合NLRP3炎症小体抑制剂（如MCC950），可减少tau释放，抑制炎症反应；-PROTACs+神经保护剂：PROTACs降解tau后，神经元仍需修复能量代谢、促进突触再生，联合线粒体保护剂（如MitoQ）或神经营养因子（如BDNF），可增强疗效。3生物标志物与个体化治疗生物标志物是PROTACs临床转化的关键，需建立“疗效-标志物”关联：-影像学标志物：如tau-PET（如flortaucipir、MK-6240），可动态监测脑内ta