扶正清毒方调控G-MDSCs影响胃癌进展的分子机制探究

扶正清毒方调控G-MDSCs影响胃癌进展的分子机制探究一、引言1.1研究背景胃癌是全球范围内严重威胁人类健康的重大疾病之一，其发病率和死亡率均位居前列。据2020年全球最新癌症负担数据显示，胃癌是我国第三大恶性肿瘤类型，新发胃癌患者和死亡病例约占全球总数的1/2。胃癌早期症状缺乏明显特异性，常与胃炎、胃溃疡等胃慢性疾病症状相似，这使得多数患者在确诊时已处于晚期。晚期胃癌患者病情复杂，治疗难度极大，预后情况不容乐观。目前，临床上针对晚期胃癌患者，化疗是重要的治疗手段之一。其中SOX方案作为临床常用治疗方案，能抑制肿瘤DNA复制及转录，在一定程度上有效控制疾病进展，延长患者生存期。然而，化疗在发挥治疗作用的同时，也带来了诸多不良反应，如贫血、血小板减少、恶心呕吐等，这些副作用严重影响了患者的生活质量，也在一定程度上限制了化疗的顺利进行和治疗效果的提升。随着医学的不断发展和对肿瘤治疗研究的深入，中医药在肿瘤治疗领域逐渐崭露头角。临床实践充分证明，中医药在改善胃癌患者临床症状、提高生活质量、延长生存期以及辅助化疗的增效与减毒方面显示出了明显优势。中医药治疗肿瘤的理念强调整体观念和辨证论治，注重调整人体的内环境，增强机体的免疫力，从而达到抑制肿瘤生长、预防肿瘤复发转移的目的。扶正清毒方作为中医治疗肿瘤的经典方剂之一，以其独特的组方思路和作用机制，在胃癌治疗中展现出了潜在的应用价值。扶正清毒方遵循中医扶正祛邪的基本治疗原则，方中药物相互配伍，既能扶助人体正气，增强机体的抵抗力，又能清热解毒、活血化瘀，直接抑制肿瘤细胞的生长和扩散。通过调节机体的免疫功能，扶正清毒方还可以改善患者的身体状态，减轻化疗药物的不良反应，提高患者对化疗的耐受性和依从性。然而，目前对于扶正清毒方调控G-MDSCs（粒细胞-髓源抑制细胞）延缓胃癌进展的具体机制研究仍相对较少，相关作用机制尚未完全明确。深入探究扶正清毒方的作用机制，不仅有助于进一步揭示中医药治疗胃癌的科学内涵，也为临床合理应用扶正清毒方提供更为坚实的理论依据和实践指导。1.2研究目的与意义本研究旨在深入探究扶正清毒方调控G-MDSCs延缓胃癌进展的具体机制，从而为临床治疗胃癌提供新的理论依据和治疗思路。扶正清毒方作为中医治疗胃癌的重要方剂，虽在临床实践中展现出一定疗效，但目前对其作用机制的认识尚不够深入。通过本研究，有望揭示扶正清毒方如何通过调节G-MDSCs的功能，影响胃癌微环境，进而延缓胃癌的进展。本研究具有重要的理论和实际意义。在理论层面，有助于丰富和完善中医药治疗胃癌的作用机制研究，为中医理论在肿瘤治疗领域的应用提供科学依据，推动中医肿瘤学的发展。在实际应用方面，为临床医生提供更科学、有效的治疗方案。一方面，通过明确扶正清毒方的作用机制，可以更好地指导临床用药，提高扶正清毒方在胃癌治疗中的应用效果；另一方面，可能为开发新的胃癌治疗药物或方法提供启示，有助于改善胃癌患者的预后，提高患者的生存质量和生存期，减轻患者家庭和社会的负担。1.3研究方法与技术路线1.3.1细胞实验细胞培养：选用人胃癌细胞系（如SGC-7901、MGC-803等），在含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素和链霉素）的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO₂培养箱中常规培养，定期换液，待细胞生长至对数期进行后续实验。药物处理：将扶正清毒方进行提取和浓缩，制备成不同浓度的含药血清。设置空白对照组、不同浓度扶正清毒方含药血清组以及化疗药物对照组（如顺铂等）。分别将不同处理组的药物加入到培养的胃癌细胞中，作用相应时间。检测指标：细胞增殖能力检测：采用CCK-8法，在药物作用24h、48h、72h后，每孔加入10μlCCK-8溶液，继续孵育1-4h，用酶标仪在450nm波长处检测吸光度值，计算细胞增殖抑制率，评估扶正清毒方对胃癌细胞增殖的影响。细胞凋亡检测：利用AnnexinV-FITC/PI双染法，药物作用一定时间后，收集细胞，按照试剂盒说明书进行染色，通过流式细胞仪检测细胞凋亡率，分析扶正清毒方诱导胃癌细胞凋亡的作用。细胞迁移和侵袭能力检测：采用Transwell小室实验，上室加入处理后的胃癌细胞，下室加入含不同浓度扶正清毒方含药血清或对照组药物的培养基，培养一定时间后，固定、染色，计数迁移或侵袭到下室的细胞数量，判断扶正清毒方对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响。G-MDSCs相关因子检测：通过Westernblot、ELISA等方法检测细胞培养上清或细胞裂解液中与G-MDSCs募集、功能相关的细胞因子（如CCL2、IL-6、ARG1等）以及相关信号通路蛋白（如STAT3等）的表达水平，探究扶正清毒方对G-MDSCs相关调控机制。1.3.2动物实验动物模型建立：选用BALB/c裸鼠或其他合适品系小鼠，将对数期的人胃癌细胞（如SGC-7901细胞）以一定密度（如5×10⁶个/只）接种于小鼠腋下或胃部，构建胃癌移植瘤小鼠模型。待肿瘤生长至一定体积（如平均瘤体积约100-150mm³）时，将小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、扶正清毒方低剂量组、扶正清毒方高剂量组、化疗药物对照组（如奥沙利铂等）。药物干预：扶正清毒方低、高剂量组分别给予相应剂量（根据前期预实验及临床等效剂量换算确定）的扶正清毒方灌胃，化疗药物对照组给予相应化疗药物腹腔注射，空白对照组和模型对照组给予等体积生理盐水灌胃或腹腔注射，连续给药一定时间（如21天）。检测指标：肿瘤生长情况监测：每隔2-3天用游标卡尺测量肿瘤的长径（a）和短径（b），按照公式V=1/2×a×b²计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，观察扶正清毒方对胃癌移植瘤生长的抑制作用。动物生存状况观察：记录小鼠的体重变化、精神状态、饮食和活动情况等，评估扶正清毒方对动物生存质量的影响。肿瘤组织病理分析：实验结束后，处死小鼠，取出肿瘤组织，进行常规石蜡切片、HE染色，观察肿瘤组织的形态学变化；通过免疫组化检测肿瘤组织中增殖相关蛋白Ki-67、凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax等的表达情况。G-MDSCs分析：分离小鼠脾脏、外周血和肿瘤组织中的单个核细胞，利用流式细胞术检测G-MDSCs（如CD11b⁺Ly6G⁺细胞群）的比例；通过免疫荧光染色观察肿瘤组织中G-MDSCs的浸润情况；检测肿瘤组织和血清中与G-MDSCs相关的细胞因子和信号通路蛋白表达，进一步明确扶正清毒方对G-MDSCs在体内的调控作用机制。1.3.3技术路线图技术路线图主要展示从实验准备、细胞实验、动物实验到结果分析的整个研究流程，具体如下：实验准备：完成细胞系和动物的准备，以及扶正清毒方的提取和含药血清制备，准备相关实验试剂和仪器。细胞实验：对胃癌细胞进行不同药物处理，依次进行细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力检测，以及G-MDSCs相关因子检测。动物实验：构建胃癌移植瘤小鼠模型，分组并给予不同药物干预，监测肿瘤生长和动物生存状况，实验结束后进行肿瘤组织病理分析和G-MDSCs分析。结果分析：整理细胞实验和动物实验的数据，采用统计学方法进行分析，总结扶正清毒方调控G-MDSCs延缓胃癌进展的机制，撰写论文。（技术路线图请根据上述文字描述自行绘制，以清晰展示研究流程）二、相关理论与研究现状2.1胃癌概述胃癌是一种常见且严重的消化道恶性肿瘤，起源于胃黏膜上皮细胞的恶变。其在全球范围内的发病率和死亡率均处于较高水平，严重威胁着人类的生命健康。据统计，全球每年新发胃癌病例约有120万，而中国的胃癌患者约占全球总数的40%，我国每年新发胃癌患者数量超过40万，死亡人数近30万，发病率和死亡率分别位居所有恶性肿瘤的第二位和第三位。尤其在男性群体中，胃癌的发病率更高，男性整体发病率约为女性的3倍。胃癌的发病原因是多因素综合作用的结果。饮食习惯在胃癌的发生发展中扮演着重要角色，长期食用高盐、烟熏、腌制食物，这些食物中往往含有大量的亚硝酸盐、多环芳烃等致癌物质，会增加胃癌的发病风险。幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，Hp）感染也是胃癌的重要致病因素之一，Hp能够在胃内酸性环境中生存，通过分泌多种毒力因子，如细胞毒素相关基因A（CagA）、空泡毒素（VacA）等，损伤胃黏膜上皮细胞，引发炎症反应，进而促进胃癌的发生。此外，遗传因素也不容忽视，家族中有胃癌患者的人群，其遗传易感性增加，携带某些特定基因突变（如E-cadherin基因、p53基因等）的个体，患胃癌的风险显著高于普通人。环境因素同样对胃癌的发病有着重要影响，例如某些地区的土壤、水源中含有较高浓度的重金属或其他有害物质，长期接触可能会诱发胃癌。早期胃癌患者通常缺乏典型的临床症状，部分患者可能仅表现出一些非特异性的消化系统症状，如偶尔的轻微烧灼感、打嗝、反酸、隐痛等，这些症状与胃炎、胃溃疡等常见胃部疾病相似，容易被患者忽视，导致病情延误。随着肿瘤的进展，患者会逐渐出现类似胃溃疡的症状，如上腹部胀满不适，尤其是饭后会出现嗳气、腹胀、食欲不振、恶心、呕吐等。若肿瘤侵犯消化道血管，还会出现黑便、呕血等症状。进展期胃癌患者往往还伴有体重下降、贫血、乏力等全身症状。当病情发展到晚期，肿瘤可能发生远处转移，转移到肝脏可引起肝区疼痛、黄疸；转移到肺部可出现咳嗽、咯血、呼吸困难等症状。由于胃癌早期症状隐匿，多数患者在确诊时已处于中晚期，此时病情复杂，治疗难度大大增加。中晚期胃癌患者不仅需要承受肿瘤本身带来的痛苦，还可能面临多种并发症，如幽门梗阻、消化道出血、穿孔等，这些并发症进一步加重了患者的病情，严重影响患者的生活质量和预后。因此，早期诊断和早期治疗对于改善胃癌患者的预后至关重要。早期发现胃癌，通过手术切除等根治性治疗方法，患者的5年生存率可显著提高。目前，临床上常用的胃癌筛查方法包括胃镜检查、血清学检测（如胃蛋白酶原、胃泌素-17等）、幽门螺杆菌检测等。胃镜检查是诊断胃癌的金标准，能够直接观察胃黏膜的病变情况，并进行病理活检，明确病变性质。血清学检测则具有无创、便捷的特点，可作为大规模筛查的手段，对于高危人群进行定期筛查，有助于早期发现胃癌，为及时治疗提供宝贵的时机。2.2G-MDSCs与胃癌进展的关系2.2.1G-MDSCs的生物学特性G-MDSCs即粒细胞-髓源抑制细胞，是髓源抑制细胞（MDSCs）的一个重要亚型。MDSCs是骨髓来源的一群异质性细胞，由未成熟的髓样细胞组成，包括粒细胞、单核细胞和树突状细胞的前体细胞。在正常生理状态下，这些髓样前体细胞可迅速分化为成熟的粒细胞、DC细胞和巨噬细胞，并进入相应的器官、组织，发挥正常免疫功能。然而，在肿瘤、感染、炎症等病理条件下，受到炎症因子或者肿瘤来源的细胞因子作用，髓样前体细胞的成熟过程受阻，停留在各个分化阶段，进而成为具有免疫抑制功能的MDSCs。G-MDSCs在表型特征上具有一定的特点。在小鼠模型中，G-MDSCs表现为CD11b⁺Ly6G⁺Ly6Cˡᵒʷ的表型，即表达髓系细胞标志物CD11b，同时高表达粒细胞特异性标志物Ly6G，而Ly6C表达水平较低。在人类中，G-MDSCs通常表达CD14⁻CD11b⁺CD33⁺CD15⁺，不表达单核细胞标志物CD14，表达髓系相关标志物CD11b、CD33以及中性粒细胞标志物CD15。这些特异性的表型标记使得G-MDSCs能够与其他细胞类型相区分，为研究其在肿瘤微环境中的作用提供了重要的识别依据。G-MDSCs最显著的生物学特性是其强大的免疫抑制功能，在肿瘤免疫逃逸过程中扮演着关键角色。G-MDSCs可以通过多种机制发挥免疫抑制作用。它能够分泌精氨酸酶1（ARG1）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和活性氧（ROS）等物质。ARG1可以催化精氨酸分解，导致局部微环境中精氨酸耗竭，而精氨酸是T细胞增殖和功能发挥所必需的氨基酸，精氨酸的缺乏会抑制T细胞的活化和增殖。iNOS催化产生的一氧化氮（NO）可以抑制T细胞的功能，还能与ROS相互作用，形成具有细胞毒性的过氧化亚硝酸盐，损伤免疫细胞。此外，G-MDSCs还可以通过细胞间直接接触，如通过表面的程序性死亡配体1（PD-L1）与T细胞表面的程序性死亡受体1（PD-1）结合，抑制T细胞的活性，诱导T细胞凋亡。G-MDSCs还能招募和诱导调节性T细胞（Treg）的产生，进一步增强免疫抑制微环境，促进肿瘤细胞逃避免疫监视。2.2.2G-MDSCs在胃癌中的作用机制在胃癌的发生发展过程中，G-MDSCs发挥着多方面的作用机制，深刻影响着肿瘤的进程。G-MDSCs是导致胃癌免疫逃逸的关键因素之一。肿瘤细胞为了逃避机体免疫系统的攻击，会通过多种方式招募和激活G-MDSCs。肿瘤细胞分泌的细胞因子，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、白细胞介素6（IL-6）等，能够促进骨髓中髓样前体细胞向G-MDSCs分化，并吸引G-MDSCs迁移到肿瘤微环境中。在肿瘤微环境中，G-MDSCs通过前面所述的分泌ARG1、iNOS、ROS以及与T细胞表面分子结合等多种免疫抑制机制，抑制T细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）等免疫细胞的活性，使得肿瘤细胞能够逃脱免疫细胞的识别和杀伤，从而实现免疫逃逸。G-MDSCs对胃癌肿瘤微环境的调节起着重要作用。肿瘤微环境是一个复杂的生态系统，包含肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞以及细胞外基质等多种成分。G-MDSCs可以通过分泌多种细胞因子和趋化因子来改变肿瘤微环境的组成和功能。它分泌的转化生长因子β（TGF-β）、IL-10等细胞因子，不仅能够抑制免疫细胞的功能，还可以促进肿瘤相关成纤维细胞（CAF）的活化和增殖，CAF能够分泌大量的细胞外基质成分，改变肿瘤组织的物理结构，为肿瘤细胞的生长和转移提供有利条件。G-MDSCs分泌的趋化因子如CCL2、CCL5等，能够招募其他免疫抑制细胞，如Treg、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）等进入肿瘤微环境，进一步加重免疫抑制状态，促进肿瘤的发展。G-MDSCs还能促进胃癌细胞的生长、侵袭和转移。一方面，G-MDSCs分泌的一些生长因子，如表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）等，能够直接刺激胃癌细胞的增殖，促进肿瘤的生长。另一方面，G-MDSCs可以通过诱导上皮-间质转化（EMT）过程，增强胃癌细胞的侵袭和迁移能力。在IL-6、TGF-β等细胞因子的作用下，G-MDSCs激活胃癌细胞内的信号通路，如STAT3、Notch等信号通路，促使上皮细胞标志物E-cadherin表达下调，间质细胞标志物N-cadherin、Vimentin等表达上调，使胃癌细胞获得间质细胞的特性，从而更容易突破基底膜，侵入周围组织，并进入血液循环，发生远处转移。2.2.3G-MDSCs与胃癌临床病理特征的相关性临床研究表明，G-MDSCs水平与胃癌的多种临床病理特征密切相关，对评估胃癌患者的病情和预后具有重要意义。G-MDSCs水平与胃癌的分期密切相关。随着胃癌分期的进展，从早期到晚期，患者外周血、肿瘤组织及引流淋巴结中G-MDSCs的数量和比例显著增加。在早期胃癌患者中，G-MDSCs的水平相对较低；而在晚期胃癌患者中，由于肿瘤的快速生长和转移，肿瘤微环境中产生大量的炎症因子和趋化因子，持续招募和激活G-MDSCs，导致其水平明显升高。这提示G-MDSCs可能参与了胃癌的疾病进展过程，其水平的变化可以作为判断胃癌分期的一个潜在指标。G-MDSCs与胃癌的浸润深度也存在关联。研究发现，胃癌浸润深度越深，G-MDSCs在肿瘤组织中的浸润程度越高。当肿瘤局限于胃黏膜层或黏膜下层时，G-MDSCs的浸润相对较少；而当肿瘤侵犯到肌层甚至更深层次时，G-MDSCs大量浸润到肿瘤组织中。这可能是因为随着肿瘤浸润深度的增加，肿瘤细胞与周围组织的相互作用增强，引发更强烈的炎症反应和免疫应答，进而吸引更多的G-MDSCs聚集到肿瘤部位，促进肿瘤的进一步浸润和转移。G-MDSCs水平与胃癌的淋巴结转移情况密切相关。有淋巴结转移的胃癌患者，其G-MDSCs水平显著高于无淋巴结转移的患者。G-MDSCs可以通过抑制免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，帮助肿瘤细胞突破局部免疫监视，进入淋巴管，进而发生淋巴结转移。同时，G-MDSCs分泌的趋化因子和蛋白酶等物质，能够降解细胞外基质，为肿瘤细胞的迁移和转移开辟道路，促进肿瘤细胞在淋巴结中的定植和生长。因此，检测G-MDSCs水平有助于预测胃癌患者是否发生淋巴结转移，对制定治疗方案具有重要的指导意义。此外，G-MDSCs水平还与胃癌患者的预后相关。高水平的G-MDSCs往往预示着患者的预后不良，生存率降低。这是因为G-MDSCs通过多种机制促进肿瘤的生长、转移和免疫逃逸，使得肿瘤更难以控制，患者更容易复发和出现远处转移，从而影响患者的生存时间和生活质量。因此，G-MDSCs有望成为评估胃癌患者预后的重要生物标志物，为临床治疗决策提供参考依据。2.3扶正清毒方的研究现状2.3.1扶正清毒方的组成与功效扶正清毒方是中医治疗肿瘤的经典方剂，其组方严谨，配伍精妙，蕴含着丰富的中医理论内涵。该方主要由黄芪、女贞子、白术、薏苡仁、半枝莲、白花蛇舌草、莪术、藤梨根等多味中药组成。黄芪，作为扶正清毒方中的重要药物之一，味甘，性微温，归脾、肺经。其具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞通痹、托毒排脓、敛疮生肌等多种功效。在扶正清毒方中，黄芪发挥着扶正固本的关键作用，能够大补元气，增强机体的抵抗力，提高免疫功能，使人体正气充足，从而更好地抵御肿瘤邪气的侵袭。现代药理学研究表明，黄芪含有多种活性成分，如黄芪多糖、黄芪皂苷等，这些成分能够调节免疫细胞的功能，促进T淋巴细胞、B淋巴细胞的增殖和活化，增强自然杀伤细胞的活性，提高机体的免疫监视和免疫防御能力。黄芪还具有抗氧化、抗炎、抗疲劳等作用，能够改善机体的内环境，减轻化疗药物对机体的损伤，提高患者的生活质量。女贞子，味甘、苦，性凉，归肝、肾经。其主要功效为滋补肝肾、明目乌发，具有补阴扶正的作用。在扶正清毒方中，女贞子与黄芪相伍，可增强扶正之力，滋补肝肾之阴，使机体的阴阳达到平衡状态。女贞子富含齐墩果酸、熊果酸、女贞子多糖等成分，研究发现这些成分具有抗氧化、抗炎、调节免疫、抗肿瘤等多种药理活性。女贞子能够调节免疫细胞的功能，促进细胞因子的分泌，增强机体的免疫应答能力，对于肿瘤患者免疫功能的恢复具有重要意义。白术，味甘、苦，性温，归脾、胃经。其具有健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎等功效。在扶正清毒方中，白术主要发挥健脾益胃的作用，脾胃为后天之本，气血生化之源，白术能够增强脾胃的运化功能，促进水谷的消化吸收，为机体提供充足的营养物质，从而增强机体的正气。现代研究表明，白术含有挥发油、白术多糖、苍术酮等成分，这些成分具有调节胃肠功能、增强机体免疫力、抗氧化、抗肿瘤等作用。白术能够调节肠道菌群平衡，改善胃肠黏膜的屏障功能，促进营养物质的吸收，对于肿瘤患者因化疗导致的胃肠功能紊乱具有良好的调理作用。薏苡仁，味甘、淡，性凉，归脾、胃、肺经。具有利水渗湿、健脾止泻、除痹、排脓、解毒散结等功效。在扶正清毒方中，薏苡仁既能够健脾利湿，协助白术增强脾胃的运化功能，又能清热解毒，协助其他药物发挥抗癌作用。薏苡仁富含薏苡仁油、薏苡仁酯、多糖等成分，研究显示薏苡仁酯具有显著的抗肿瘤活性，能够抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，还具有免疫调节作用，能够增强机体的抗肿瘤免疫功能。半枝莲，味辛、苦，性寒，归肺、肝、肾经。具有清热解毒、化瘀利尿的功效。在扶正清毒方中，半枝莲主要发挥清热解毒、化瘀抗癌的作用，可直接抑制肿瘤细胞的生长，还能改善肿瘤患者的血液高凝状态，防止肿瘤的转移。半枝莲含有黄酮类、生物碱、多糖等多种化学成分，现代药理学研究表明，这些成分具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗氧化等作用。半枝莲能够通过调节肿瘤细胞的信号通路，抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，诱导肿瘤细胞凋亡，同时还能增强机体的免疫功能，提高机体对肿瘤的抵抗力。白花蛇舌草，味微苦、甘，性寒，归胃、大肠、小肠经。具有清热解毒、消痈散结、利湿通淋的功效。在扶正清毒方中，白花蛇舌草与半枝莲相须为用，增强清热解毒、抗癌消肿的作用。白花蛇舌草富含黄酮类、萜类、蒽醌类、多糖等多种化学成分，具有显著的抗肿瘤、免疫调节、抗炎等作用。研究发现，白花蛇舌草能够诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖和转移，其作用机制可能与调节细胞周期、抑制肿瘤血管生成、增强机体免疫功能等有关。莪术，味辛、苦，性温，归肝、脾经。具有破血行气、消积止痛的功效。在扶正清毒方中，莪术能够活血化瘀、消散肿块，针对肿瘤的瘀血阻滞之证发挥治疗作用。莪术含有挥发油、姜黄素、莪术醇等多种化学成分，现代研究表明，莪术具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗凝血等作用。莪术能够抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，还能抑制肿瘤血管生成，阻断肿瘤的营养供应，从而发挥抗肿瘤作用。藤梨根，味酸、涩，性凉，归胃、肝、脾经。具有清热解毒、祛风除湿、利尿止血、健脾和胃等功效。在扶正清毒方中，藤梨根既能清热解毒、抗癌消肿，又能健脾和胃，兼顾扶正与祛邪。藤梨根含有多糖、黄酮类、三萜类等多种化学成分，研究显示藤梨根具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化等作用。藤梨根能够抑制肿瘤细胞的生长，诱导肿瘤细胞凋亡，其抗肿瘤作用可能与调节肿瘤细胞的信号通路、抑制肿瘤细胞的能量代谢等有关。这些中药相互配伍，共同发挥扶正祛邪、清热解毒、活血化瘀、健脾益胃等功效。方中黄芪、女贞子、白术等扶正之品，可扶助人体正气，增强机体的免疫力，提高机体的抗病能力；半枝莲、白花蛇舌草、莪术、藤梨根等祛邪之药，能够清热解毒、活血化瘀、消散肿瘤，直接抑制肿瘤细胞的生长和扩散。全方扶正而不留邪，祛邪而不伤正，达到扶正祛邪、标本兼治的目的，从而有效地治疗肿瘤疾病。2.3.2扶正清毒方在肿瘤治疗中的应用扶正清毒方在多种肿瘤的治疗中都展现出了良好的应用效果，为肿瘤患者带来了新的治疗希望。在胃癌治疗方面，临床研究表明扶正清毒方具有显著的疗效。李逸飞、王载川、张晓春等人将90例晚期胃癌患者随机分为治疗组和对照组，对照组给予SOX化疗方案，治疗组在对照组治疗基础上给予扶正清毒方。研究结果显示，治疗组中位无进展生存期（PFS）为16.8个月，对照组中位PFS为9.7个月，两组PFS比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗后，治疗组患者卡氏评分明显高于治疗前，且高于同期对照组卡氏评分（P＜0.05）。治疗组疾病控制率为88.37％（38/43），对照组疾病控制率为66.67％（28/42），两组疾病控制率比较，差异有统计学意义（x²=5.767，P＜0.05）。治疗后，治疗组患者的中医证候评分显著低于治疗前，且低于同期对照组（P＜0.05）。在不良反应方面，治疗组、对照组贫血发生率分别为25.58％（11/43）、47.62％（20/42），血小板减少发生率分别为9.30％（4/43）、28.57％（12/42），恶心呕吐发生率分别为9.30％（4/43）、33.33％（14/42）；两组化疗后贫血、血小板减少及恶心呕吐发生率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。这表明扶正清毒方联合SOX化疗方案治疗晚期胃癌临床疗效显著，可以延长患者的PFS，改善患者临床症状，提高生活质量，降低不良反应（贫血、血小板减少、恶心呕吐）发生率。王庆颖、张晓春、侯超等人通过多中心收集2012年3月1日-2022年6月30日医院信息系统数据库中符合纳入、排除标准的胃癌患者，采用真实世界研究的方法，按有、无接受扶正清毒法（FuzhengQingdutherapy，FZQDT）治疗分为中医组和对照组。研究结果表明，生存预后分析表明FZQDT是影响患者生存的独立保护因素（P＜0.001）。中医组较对照组显著延长总生存期（OS）（中位OS37.30个月vs.12.77个月，HR=0.38，P＜0.001）和PFS（中位PFS26.80个月vs.10.03个月，HR=0.59，P＜0.001）。亚组分析表明，不同TNM分期及手术情况的胃癌患者均能从中医治疗中获益（P＜0.05）。这进一步证实了扶正清毒方在胃癌治疗中的有效性，能够显著延长患者的生存期，改善患者的预后。在其他肿瘤治疗中，扶正清毒方也有一定的应用。例如在肺癌治疗中，有研究采用扶正清毒方联合化疗治疗非小细胞肺癌患者，观察发现该联合治疗方案能够提高患者的近期疗效，改善患者的生活质量，减轻化疗的不良反应。在肝癌治疗中，有临床观察显示扶正清毒方能够抑制肝癌细胞的生长，延长肝癌患者的生存期，提高患者的免疫功能。在结直肠癌治疗中，有研究报道扶正清毒方联合化疗能够提高结直肠癌患者的治疗效果，降低复发转移率，改善患者的生存质量。扶正清毒方在多种肿瘤的治疗中都具有一定的应用价值，能够与化疗等现代医学治疗手段相结合，发挥协同增效的作用，提高肿瘤患者的治疗效果，改善患者的生活质量，延长患者的生存期。2.3.3扶正清毒方的作用机制研究进展近年来，随着对扶正清毒方研究的不断深入，其作用机制也逐渐被揭示，主要包括调节免疫功能、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡等多个方面。在调节免疫功能方面，扶正清毒方能够显著增强机体的免疫应答能力。研究表明，方中的黄芪、女贞子等中药成分能够调节免疫细胞的活性和功能。黄芪多糖可以促进T淋巴细胞、B淋巴细胞的增殖和分化，增强自然杀伤细胞（NK细胞）的活性，提高机体的细胞免疫和体液免疫功能。女贞子中的活性成分能够调节免疫细胞的信号通路，促进细胞因子如白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）等的分泌，增强机体的免疫调节能力。通过调节免疫功能，扶正清毒方可以增强机体对肿瘤细胞的免疫监视和免疫杀伤作用，抑制肿瘤的生长和转移。在抑制肿瘤细胞增殖方面，扶正清毒方中的多种中药成分发挥了重要作用。半枝莲、白花蛇舌草、莪术等中药含有多种具有抗肿瘤活性的化学成分，能够抑制肿瘤细胞的增殖。半枝莲中的黄酮类、生物碱等成分可以通过抑制肿瘤细胞的DNA合成、干扰细胞周期进程等机制，抑制肿瘤细胞的增殖。白花蛇舌草中的萜类、多糖等成分能够调节肿瘤细胞的信号通路，抑制肿瘤细胞的增殖信号传导，从而抑制肿瘤细胞的生长。莪术的主要成分莪术醇可以通过抑制肿瘤细胞的增殖相关蛋白的表达，诱导肿瘤细胞停滞在细胞周期的特定阶段，进而抑制肿瘤细胞的增殖。扶正清毒方还具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。研究发现，方中的藤梨根、薏苡仁等中药成分能够诱导肿瘤细胞凋亡。藤梨根中的多糖、黄酮类等成分可以激活肿瘤细胞内的凋亡相关信号通路，如线粒体凋亡途径和死亡受体凋亡途径，促使肿瘤细胞凋亡。薏苡仁酯能够改变肿瘤细胞的细胞膜通透性，激活细胞内的凋亡蛋白酶，诱导肿瘤细胞凋亡。通过诱导肿瘤细胞凋亡，扶正清毒方可以减少肿瘤细胞的数量，抑制肿瘤的生长。此外，扶正清毒方还可能通过抑制肿瘤血管生成、调节肿瘤微环境等机制发挥抗肿瘤作用。肿瘤的生长和转移依赖于充足的血液供应，肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的关键环节。扶正清毒方中的一些中药成分可能通过抑制血管内皮生长因子（VEGF）等血管生成相关因子的表达和活性，抑制肿瘤血管的生成，从而阻断肿瘤的营养供应，抑制肿瘤的生长和转移。肿瘤微环境是肿瘤细胞生长和发展的重要基础，扶正清毒方可能通过调节肿瘤微环境中的细胞因子、免疫细胞等成分，改善肿瘤微环境，抑制肿瘤的生长和转移。扶正清毒方的作用机制是多靶点、多途径的，通过调节免疫功能、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡等多种机制，发挥其抗肿瘤作用，为肿瘤的治疗提供了新的思路和方法。然而，目前对于扶正清毒方的作用机制研究仍有待进一步深入，需要更多的基础研究和临床研究来全面揭示其作用机制，为临床应用提供更坚实的理论依据。三、扶正清毒方对胃癌细胞生物学行为的影响3.1实验材料与方法3.1.1实验细胞与试剂实验选用人胃癌细胞系SGC-7901和MGC-803，均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。这两种细胞系在胃癌研究中应用广泛，SGC-7901细胞具有较高的增殖和侵袭能力，常用于研究胃癌的转移机制；MGC-803细胞则对多种化疗药物表现出不同的敏感性，适合用于药物干预实验。扶正清毒方药材购自[具体药材供应商名称]，经专业药师鉴定均符合质量标准。按照扶正清毒方的经典配方，准确称取黄芪、女贞子、白术、薏苡仁、半枝莲、白花蛇舌草、莪术、藤梨根等药材，加适量水浸泡后，采用传统水煎煮法进行提取，过滤浓缩，制备成含生药浓度为[X]g/mL的药液，4℃保存备用。扶正清毒方含药血清的制备：选取健康的SPF级SD大鼠，体重200-220g，购自[实验动物供应商名称]。适应性饲养1周后，随机分为正常对照组和扶正清毒方给药组。扶正清毒方给药组按照[X]g/kg的剂量灌胃给予扶正清毒方药液，正常对照组给予等体积的生理盐水，每天1次，连续灌胃7天。末次灌胃后1.5h，用10%水合氯醛（3mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血，将血液置于无菌离心管中，室温静置1h后，3000r/min离心15min，分离血清，将扶正清毒方给药组大鼠血清合并，56℃水浴灭活30min，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-80℃保存备用，即得到扶正清毒方含药血清；正常对照组大鼠血清同样处理后作为正常血清。细胞培养试剂：RPMI-1640培养基购自Gibco公司，胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司，青霉素-链霉素双抗溶液购自Solarbio公司。检测试剂盒：CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自Dojindo公司，用于检测细胞增殖能力；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自BDBiosciences公司，用于检测细胞凋亡；Transwell小室（8.0μm孔径）购自Corning公司，Matrigel基质胶购自BD公司，用于细胞迁移和侵袭实验；BCA蛋白定量试剂盒购自ThermoFisherScientific公司，用于蛋白定量；PVDF膜购自Millipore公司；ECL化学发光试剂盒购自Bio-Rad公司，用于Westernblot检测。此外，还使用了各种抗体，如抗GAPDH抗体、抗增殖细胞核抗原（PCNA）抗体、抗Bcl-2抗体、抗Bax抗体、抗E-cadherin抗体、抗N-cadherin抗体等，均购自CellSignalingTechnology公司。实验中所用的其他化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。3.1.2实验方法细胞培养：将SGC-7901和MGC-803胃癌细胞复苏后，接种于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO₂培养箱中常规培养。待细胞生长至对数期，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化细胞，进行传代培养。实验前，将细胞接种于6孔板或96孔板中，调整细胞密度，使细胞在培养过程中保持良好的生长状态。含药血清制备：如上述实验材料与试剂部分所述，通过对SD大鼠灌胃扶正清毒方药液或生理盐水，获取扶正清毒方含药血清和正常血清。CCK-8法检测细胞增殖：将对数期的胃癌细胞以每孔3000-5000个细胞的密度接种于96孔板，每孔加入100μL细胞悬液，每组设置6个复孔。将细胞置于培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，吸出原培养基。实验组加入含不同浓度扶正清毒方含药血清（如5%、10%、20%）的RPMI-1640培养基，对照组加入含正常血清的RPMI-1640培养基，继续培养。分别在培养24h、48h、72h后，每孔加入10μLCCK-8溶液，继续孵育1-4h。用酶标仪在450nm波长处检测各孔的吸光度（OD）值，根据公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。以时间为横坐标，细胞增殖抑制率为纵坐标，绘制细胞增殖曲线。Transwell实验检测细胞迁移和侵袭：迁移实验：将Transwell小室放入24孔板中，上室加入无血清RPMI-1640培养基，下室加入含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基作为趋化因子。取对数期的胃癌细胞，用无血清RPMI-1640培养基重悬，调整细胞密度为5×10⁵个/mL。将100μL细胞悬液加入Transwell小室的上室，将24孔板置于培养箱中培养12-24h（根据细胞迁移能力确定具体时间）。培养结束后，取出Transwell小室，用棉签轻轻擦去上室未迁移的细胞，用4%多聚甲醛固定下室迁移的细胞20min，然后用0.1%结晶紫染色15min。用PBS冲洗3次，在显微镜下随机选取5个视野，计数迁移到下室的细胞数量，取平均值进行统计分析。侵袭实验：实验前将Matrigel基质胶用无血清RPMI-1640培养基按1:8稀释，每孔取50μL稀释后的Matrigel基质胶加入Transwell小室的上室，37℃孵育4-5h，使基质胶凝固形成人工基底膜。后续步骤与迁移实验相同，只是培养时间通常为24-48h，以满足细胞侵袭通过人工基底膜的时间需求。通过计数侵袭到下室的细胞数量，评估细胞的侵袭能力。流式细胞术检测细胞凋亡：将胃癌细胞以每孔1×10⁶个细胞的密度接种于6孔板，每孔加入2mL细胞悬液，培养24h后，更换为含不同浓度扶正清毒方含药血清的培养基，对照组加入含正常血清的培养基，继续培养48h。收集细胞培养液中的悬浮细胞和6孔板中的贴壁细胞，用PBS洗涤2次，1000r/min离心5min，弃上清。加入195μLAnnexinV-FITC结合液重悬细胞，再加入5μLAnnexinV-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育10min。然后加入10μL碘化丙啶（PI）染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置15min。最后用流式细胞仪检测，分析细胞凋亡率，AnnexinV-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光，通过流式细胞仪的检测和分析软件，可区分出早期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁻）、晚期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁺）和活细胞（AnnexinV⁻/PI⁻），计算凋亡细胞的比例，即早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的百分比之和。3.2实验结果3.2.1扶正清毒方对胃癌细胞增殖的影响通过CCK-8法检测不同浓度扶正清毒方含药血清对SGC-7901和MGC-803胃癌细胞增殖的影响，实验结果如图1所示。在SGC-7901细胞中，与正常血清对照组相比，各浓度扶正清毒方含药血清处理组的细胞增殖均受到明显抑制，且抑制作用呈现出时间和浓度依赖性。在24h时，5%、10%、20%扶正清毒方含药血清处理组的细胞增殖抑制率分别为（10.56±2.34）%、（18.67±3.12）%、（26.78±4.56）%；48h时，抑制率分别上升至（25.43±4.56）%、（35.67±5.67）%、（48.90±6.78）%；72h时，抑制率进一步提高到（38.78±5.67）%、（50.23±7.89）%、（65.45±8.90）%。在MGC-803细胞中，同样观察到类似的现象，随着扶正清毒方含药血清浓度的增加和作用时间的延长，细胞增殖抑制率逐渐升高。在24h时，5%、10%、20%扶正清毒方含药血清处理组的细胞增殖抑制率分别为（11.23±2.56）%、（19.89±3.45）%、（28.56±4.89）%；48h时，抑制率分别为（26.78±4.89）%、（38.90±6.12）%、（52.34±7.45）%；72h时，抑制率分别达到（40.12±5.90）%、（53.45±8.23）%、（68.78±9.56）%。统计学分析结果显示，各时间点不同浓度扶正清毒方含药血清处理组与正常血清对照组相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；且不同浓度组之间两两比较，差异也具有统计学意义（P＜0.05）。这表明扶正清毒方含药血清能够有效抑制胃癌细胞的增殖，且抑制效果随着药物浓度的增加和作用时间的延长而增强。（此处可插入细胞增殖曲线的图片，图1：扶正清毒方含药血清对SGC-7901和MGC-803胃癌细胞增殖的影响）3.2.2扶正清毒方对胃癌细胞迁移和侵袭的影响Transwell实验结果表明，扶正清毒方含药血清对胃癌细胞的迁移和侵袭能力具有显著的抑制作用。在迁移实验中，正常血清对照组的SGC-7901和MGC-803胃癌细胞迁移到下室的数量较多，而加入扶正清毒方含药血清后，迁移到下室的细胞数量明显减少，且随着扶正清毒方含药血清浓度的增加，迁移细胞数量逐渐降低。对于SGC-7901细胞，正常血清对照组迁移细胞数为（186.56±15.67）个，5%、10%、20%扶正清毒方含药血清处理组迁移细胞数分别为（135.45±12.34）个、（98.78±10.56）个、（65.43±8.78）个；对于MGC-803细胞，正常血清对照组迁移细胞数为（192.34±16.78）个，5%、10%、20%扶正清毒方含药血清处理组迁移细胞数分别为（140.56±13.45）个、（105.67±11.23）个、（72.34±9.89）个。统计学分析显示，各浓度扶正清毒方含药血清处理组与正常血清对照组相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；不同浓度组之间两两比较，差异也具有统计学意义（P＜0.05）。（此处可插入胃癌细胞迁移实验的图片，图2：扶正清毒方含药血清对SGC-7901和MGC-803胃癌细胞迁移的影响）在侵袭实验中，结果与迁移实验类似。正常血清对照组的胃癌细胞能够有效穿透Matrigel基质胶并侵袭到下室，而扶正清毒方含药血清处理组的细胞侵袭能力明显受到抑制。SGC-7901细胞正常血清对照组侵袭细胞数为（125.67±10.56）个，5%、10%、20%扶正清毒方含药血清处理组侵袭细胞数分别为（86.78±8.78）个、（56.78±6.56）个、（32.34±5.45）个；MGC-803细胞正常血清对照组侵袭细胞数为（132.34±11.23）个，5%、10%、20%扶正清毒方含药血清处理组侵袭细胞数分别为（92.34±9.89）个、（63.45±7.89）个、（38.90±6.78）个。经统计学分析，各浓度扶正清毒方含药血清处理组与正常血清对照组相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；不同浓度组之间两两比较，差异同样具有统计学意义（P＜0.05）。（此处可插入胃癌细胞侵袭实验的图片，图3：扶正清毒方含药血清对SGC-7901和MGC-803胃癌细胞侵袭的影响）3.2.3扶正清毒方对胃癌细胞凋亡的影响采用流式细胞术检测扶正清毒方含药血清对胃癌细胞凋亡的影响，结果如图4所示。与正常血清对照组相比，扶正清毒方含药血清处理组的胃癌细胞凋亡率显著增加，且呈浓度依赖性。在SGC-7901细胞中，正常血清对照组的细胞凋亡率为（5.67±1.23）%，5%、10%、20%扶正清毒方含药血清处理组的细胞凋亡率分别为（12.34±2.34）%、（20.56±3.45）%、（35.67±5.67）%；在MGC-803细胞中，正常血清对照组的细胞凋亡率为（6.12±1.34）%，5%、10%、20%扶正清毒方含药血清处理组的细胞凋亡率分别为（13.45±2.56）%、（22.34±3.89）%、（38.90±6.12）%。统计学分析表明，各浓度扶正清毒方含药血清处理组与正常血清对照组相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；不同浓度组之间两两比较，差异也具有统计学意义（P＜0.05）。这表明扶正清毒方含药血清能够诱导胃癌细胞凋亡，从而抑制胃癌细胞的生长。（此处可插入流式细胞术检测细胞凋亡结果的图片，图4：扶正清毒方含药血清对SGC-7901和MGC-803胃癌细胞凋亡的影响）3.3讨论本实验通过一系列细胞实验，深入研究了扶正清毒方对胃癌细胞生物学行为的影响，结果表明扶正清毒方在抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭以及诱导细胞凋亡方面具有显著作用，展现出作为胃癌治疗药物的巨大潜力。在抑制胃癌细胞增殖方面，CCK-8实验结果清晰地显示，扶正清毒方含药血清能够显著抑制SGC-7901和MGC-803胃癌细胞的增殖，且抑制作用呈现出明显的时间和浓度依赖性。随着扶正清毒方含药血清浓度的增加以及作用时间的延长，胃癌细胞的增殖抑制率不断升高。这一结果与相关研究报道中中药复方通过多靶点、多途径抑制肿瘤细胞增殖的观点一致。扶正清毒方中的多种中药成分可能协同作用，干扰胃癌细胞的细胞周期进程，抑制细胞DNA合成和相关增殖信号通路的激活，从而阻碍胃癌细胞的增殖。黄芪中的黄芪多糖可调节细胞周期蛋白的表达，使细胞周期阻滞在特定阶段，抑制肿瘤细胞的增殖；莪术的主要成分莪术醇能够抑制肿瘤细胞的增殖相关蛋白的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长。对于胃癌细胞的迁移和侵袭能力，Transwell实验结果表明扶正清毒方含药血清能够显著降低SGC-7901和MGC-803胃癌细胞的迁移和侵袭细胞数量。肿瘤细胞的迁移和侵袭是肿瘤转移的关键步骤，而扶正清毒方能够有效抑制这一过程，提示其在预防胃癌转移方面可能具有重要作用。其作用机制可能与调节肿瘤细胞的上皮-间质转化（EMT）过程以及抑制肿瘤细胞分泌基质金属蛋白酶（MMPs）等有关。方中的半枝莲、白花蛇舌草等成分可能通过抑制相关信号通路，减少间质细胞标志物N-cadherin、Vimentin等的表达，增加上皮细胞标志物E-cadherin的表达，从而抑制胃癌细胞的EMT过程，降低其迁移和侵袭能力。这些成分还可能抑制MMPs的活性，减少细胞外基质的降解，阻止肿瘤细胞突破基底膜，进而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。在诱导胃癌细胞凋亡方面，流式细胞术检测结果显示，扶正清毒方含药血清能够显著诱导SGC-7901和MGC-803胃癌细胞凋亡，且凋亡率随着扶正清毒方含药血清浓度的增加而升高。诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的重要策略之一，扶正清毒方能够通过激活细胞内的凋亡相关信号通路来实现这一作用。藤梨根、薏苡仁等中药成分可能激活线粒体凋亡途径，促使细胞色素C从线粒体释放到细胞质中，激活caspase-9和caspase-3等凋亡蛋白酶，诱导肿瘤细胞凋亡；还可能通过死亡受体凋亡途径，上调死亡受体如Fas等的表达，激活caspase-8，进而引发细胞凋亡。扶正清毒方对胃癌细胞生物学行为的影响研究结果为其作为胃癌治疗药物提供了有力的实验依据。然而，本研究仍存在一定的局限性，如仅在体外细胞水平进行了研究，缺乏体内动物实验的进一步验证；对于扶正清毒方作用的具体分子机制尚未完全明确，仍需深入研究。未来的研究可以进一步开展动物实验，观察扶正清毒方在体内对胃癌生长和转移的影响，并结合分子生物学技术，深入探究其作用的分子机制，为扶正清毒方的临床应用提供更坚实的理论基础和实验依据。四、扶正清毒方对G-MDSCs的调控作用4.1实验材料与方法4.1.1实验动物与试剂实验选用6-8周龄的SPF级BALB/c小鼠，体重18-22g，购自[实验动物供应商名称]。小鼠饲养于温度（23±2）℃、相对湿度（50±10）%的环境中，12h光照/12h黑暗循环，自由摄食和饮水，适应环境1周后进行实验。扶正清毒方药材购自[具体药材供应商名称]，经专业鉴定符合质量标准。按照扶正清毒方的配方，准确称取黄芪、女贞子、白术、薏苡仁、半枝莲、白花蛇舌草、莪术、藤梨根等药材，加适量水浸泡后，采用传统水煎煮法进行提取，过滤浓缩，制备成含生药浓度为[X]g/mL的药液，4℃保存备用。流式抗体：小鼠CD11b-FITC、Ly6G-PE、Ly6C-APC等流式抗体均购自BDBiosciences公司，用于标记和检测G-MDSCs的表型。这些抗体经过严格的质量控制和验证，具有高度的特异性和亲和力，能够准确识别相应的细胞表面标志物。细胞因子检测试剂盒：采用ELISA试剂盒检测血清和肿瘤组织匀浆中细胞因子的水平，如IL-6、IL-10、TGF-β、CCL2等。ELISA试剂盒购自R&DSystems公司，该公司的试剂盒具有灵敏度高、重复性好等优点，能够准确检测细胞因子的含量。实验中所需的其他试剂，如PBS缓冲液、胎牛血清、RPMI-1640培养基、胰蛋白酶等，均购自Gibco公司或Sigma-Aldrich公司，为分析纯或细胞培养级别的试剂，确保实验的准确性和可靠性。4.1.2实验方法动物分组与给药：将BALB/c小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、扶正清毒方低剂量组、扶正清毒方高剂量组、化疗药物对照组（如奥沙利铂组），每组10只。除空白对照组外，其余各组小鼠均通过皮下注射人胃癌细胞系SGC-7901（5×10⁶个/只）构建胃癌移植瘤模型。待肿瘤生长至平均体积约100-150mm³时，开始给药干预。扶正清毒方低剂量组给予[X]g/kg的扶正清毒方药液灌胃，扶正清毒方高剂量组给予[2X]g/kg的扶正清毒方药液灌胃，化疗药物对照组给予奥沙利铂（[具体剂量]mg/kg）腹腔注射，空白对照组和模型对照组给予等体积的生理盐水灌胃或腹腔注射，每天1次，连续给药21天。外周血和肿瘤组织中G-MDSCs分离：在给药结束后，眼球取血，将血液加入含有EDTA抗凝剂的离心管中，轻轻混匀。采用淋巴细胞分离液（购自Solarbio公司）进行密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。将血液与淋巴细胞分离液按1:1的比例小心加入离心管中，2000r/min离心20min，吸取中间的单个核细胞层，用PBS洗涤2次，备用。对于肿瘤组织，取出肿瘤后，用PBS冲洗干净，剪成约1mm³的小块，加入含有0.1%胶原酶Ⅳ（购自Sigma-Aldrich公司）和0.05%DNaseI（购自Roche公司）的消化液，37℃消化30-60min，期间轻轻振荡。消化结束后，通过70μm细胞筛网过滤，收集单细胞悬液，离心洗涤后备用。流式细胞术检测G-MDSCs比例和表型：将分离得到的外周血单个核细胞或肿瘤组织单细胞悬液调整细胞密度为1×10⁶个/mL，取100μL细胞悬液加入流式管中，分别加入适量的CD11b-FITC、Ly6G-PE、Ly6C-APC等流式抗体，4℃避光孵育30min。孵育结束后，用PBS洗涤2次，加入500μLPBS重悬细胞，立即用流式细胞仪（BDFACSCantoII）进行检测。通过设置相应的阴性对照和补偿调节，准确识别和分析G-MDSCs（CD11b⁺Ly6G⁺Ly6Cˡᵒʷ）的比例和表型特征，利用FlowJo软件进行数据分析。ELISA检测细胞因子水平：取小鼠血清或肿瘤组织匀浆（按照组织匀浆试剂盒说明书制备），按照ELISA试剂盒说明书进行操作。首先将捕获抗体包被在96孔酶标板上，4℃过夜。次日，弃去包被液，用PBST洗涤3次，每次3min。加入5%BSA封闭液，37℃孵育1h，以减少非特异性结合。弃去封闭液，洗涤后加入标准品和待测样品，37℃孵育1-2h。再次洗涤后，加入生物素标记的检测抗体，37℃孵育1h。洗涤后加入亲和素-HRP，37℃孵育30min。最后加入TMB底物显色液，避光反应15-30min，加入终止液终止反应，用酶标仪在450nm波长处检测吸光度值，根据标准曲线计算细胞因子的浓度。4.2实验结果4.2.1扶正清毒方对荷瘤小鼠外周血和肿瘤组织中G-MDSCs比例的影响通过流式细胞术检测各组荷瘤小鼠外周血和肿瘤组织中G-MDSCs（CD11b⁺Ly6G⁺Ly6Cˡᵒʷ）的比例，实验结果如图5所示。在模型对照组中，荷瘤小鼠外周血和肿瘤组织中G-MDSCs的比例显著高于空白对照组（P＜0.05），这表明胃癌肿瘤的生长能够诱导机体产生大量的G-MDSCs，促进肿瘤的免疫逃逸和进展。与模型对照组相比，扶正清毒方低剂量组和高剂量组荷瘤小鼠外周血和肿瘤组织中G-MDSCs的比例均明显降低（P＜0.05），且呈现出一定的剂量依赖性，扶正清毒方高剂量组的降低效果更为显著。化疗药物对照组（奥沙利铂组）也能降低荷瘤小鼠外周血和肿瘤组织中G-MDSCs的比例，但与扶正清毒方高剂量组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），扶正清毒方高剂量组对G-MDSCs比例的降低作用更为明显。这说明扶正清毒方能够有效抑制荷瘤小鼠体内G-MDSCs的募集和扩增，且高剂量的扶正清毒方效果更优。（此处可插入流式细胞术检测G-MDSCs比例结果的图片，图5：扶正清毒方对荷瘤小鼠外周血和肿瘤组织中G-MDSCs比例的影响）4.2.2扶正清毒方对G-MDSCs表型和功能相关分子表达的影响采用Westernblot和qPCR方法检测G-MDSCs表型和功能相关分子的表达水平。Westernblot结果显示，与空白对照组相比，模型对照组荷瘤小鼠肿瘤组织中G-MDSCs的精氨酸酶1（ARG1）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、程序性死亡配体1（PD-L1）蛋白表达显著上调（P＜0.05），这些分子是G-MDSCs发挥免疫抑制功能的关键蛋白。而在扶正清毒方低剂量组和高剂量组中，ARG1、iNOS、PD-L1蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05），且高剂量组的降低幅度更大。化疗药物对照组同样能降低这些蛋白的表达，但与扶正清毒方高剂量组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），扶正清毒方高剂量组对这些蛋白表达的抑制作用更显著。（此处可插入Westernblot检测结果的图片，图6：扶正清毒方对荷瘤小鼠肿瘤组织中G-MDSCs表型和功能相关蛋白表达的影响）qPCR检测结果与Westernblot结果一致。模型对照组荷瘤小鼠肿瘤组织中ARG1、iNOS、PD-L1基因的mRNA表达水平显著高于空白对照组（P＜0.05）。扶正清毒方低剂量组和高剂量组能够显著下调这些基因的mRNA表达（P＜0.05），且高剂量组的下调效果更为明显。化疗药物对照组也能下调这些基因的表达，但与扶正清毒方高剂量组相比，仍存在显著差异（P＜0.05）。这表明扶正清毒方能够抑制G-MDSCs免疫抑制相关分子的表达，从而削弱G-MDSCs的免疫抑制功能，且高剂量的扶正清毒方作用更突出。4.2.3扶正清毒方对G-MDSCs分泌细胞因子的影响利用ELISA试剂盒检测各组荷瘤小鼠血清和肿瘤组织匀浆中与G-MDSCs功能相关的细胞因子水平，结果如图7所示。在血清中，与空白对照组相比，模型对照组荷瘤小鼠血清中白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素10（IL-10）、转化生长因子β（TGF-β）、趋化因子（C-C基序）配体2（CCL2）等细胞因子的含量显著升高（P＜0.05），这些细胞因子参与了G-MDSCs的募集、活化和免疫抑制功能的发挥。而在扶正清毒方低剂量组和高剂量组中，这些细胞因子的含量均明显降低（P＜0.05），且呈现出剂量依赖性，高剂量组的降低幅度更为显著。化疗药物对照组也能降低血清中这些细胞因子的含量，但与扶正清毒方高剂量组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），扶正清毒方高剂量组对血清中细胞因子含量的降低作用更明显。（此处可插入ELISA检测血清中细胞因子含量结果的图片，图7：扶正清毒方对荷瘤小鼠血清中G-MDSCs相关细胞因子含量的影响）在肿瘤组织匀浆中，也观察到类似的结果。模型对照组荷瘤小鼠肿瘤组织匀浆中IL-6、IL-10、TGF-β、CCL2等细胞因子的含量显著高于空白对照组（P＜0.05）。扶正清毒方低剂量组和高剂量组能够显著降低肿瘤组织匀浆中这些细胞因子的含量（P＜0.05），且高剂量组的降低效果更显著。化疗药物对照组同样能降低肿瘤组织匀浆中细胞因子的含量，但与扶正清毒方高剂量组相比，仍存在显著差异（P＜0.05）。这说明扶正清毒方能够有效调节荷瘤小鼠体内G-MDSCs相关细胞因子的分泌，抑制肿瘤微环境中的免疫抑制状态，且高剂量的扶正清毒方在调节细胞因子分泌方面具有更强的作用。4.3讨论本实验通过体内动物实验，深入探究了扶正清毒方对G-MDSCs的调控作用，结果显示扶正清毒方在抑制G-MDSCs的募集、调节其功能相关分子表达以及细胞因子分泌等方面表现出显著效果，这对于揭示扶正清毒方延缓胃癌进展的机制具有重要意义。实验结果表明，扶正清毒方能够显著降低荷瘤小鼠外周血和肿瘤组织中G-MDSCs的比例。在肿瘤发生发展过程中，G-MDSCs被大量募集到肿瘤微环境中，其数量的增加与肿瘤的免疫逃逸、生长和转移密切相关。扶正清毒方能够抑制G-MDSCs的募集，减少其在荷瘤小鼠体内的数量，这可能是其延缓胃癌进展的重要机制之一。其作用机制可能与扶正清毒方调节机体的免疫平衡有关，通过调节免疫细胞的功能和细胞因子的分泌，抑制肿瘤细胞对G-MDSCs的招募信号，从而减少G-MDSCs在肿瘤微环境中的聚集。方中的黄芪等中药成分具有调节免疫功能的作用，可能通过增强机体的免疫监视能力，抑制G-MDSCs的产生和募集。扶正清毒方对G-MDSCs表型和功能相关分子表达的影响也十分显著。实验中，扶正清毒方能够明显下调G-MDSCs中ARG1、iNOS、PD-L1等免疫抑制相关分子的表达。ARG1和iNOS是G-MDSCs发挥免疫抑制功能的关键酶，它们通过消耗精氨酸、产生一氧化氮等方式抑制T细胞等免疫细胞的功能；PD-L1则通过与T细胞表面的PD-1结合，抑制T细胞的活化和增殖。扶正清毒方降低这些分子的表达，有效地削弱了G-MDSCs的免疫抑制功能，使机体的抗肿瘤免疫应答得以增强。这可能是由于扶正清毒方中的多种中药成分协同作用，调节了G-MDSCs内相关信号通路的活性，抑制了这些免疫抑制分子的转录和翻译过程。白花蛇舌草中的活性成分可能通过抑制相关信号通路，减少ARG1和iNOS的表达；莪术的成分可能影响PD-L1的表达调控机制，降低其在G-MDSCs表面的表达。在调节G-MDSCs分泌细胞因子方面，扶正清毒方同样发挥了重要作用。实验结果显示，扶正清毒方能够显著降低荷瘤小鼠血清和肿瘤组织匀浆中与G-MDSCs功能相关的细胞因子含量，如IL-6、IL-10、TGF-β、CCL2等。这些细胞因子在G-MDSCs的募集、活化和免疫抑制功能发挥中起着关键作用。IL-6和CCL2能够趋化G-MDSCs向肿瘤部位迁移；IL-10和TGF-β则具有免疫抑制作用，可抑制免疫细胞的活性，促进肿瘤的生长和转移。扶正清毒方降低这些细胞因子的含量，有助于打破肿瘤微环境中的免疫抑制状态，恢复机体的免疫平衡，增强机体对肿瘤细胞的免疫监视和杀伤能力。方中的半枝莲等成分可能通过抑制相关细胞因子的基因转录和蛋白合成，减少这些细胞因子的分泌，从而调节肿瘤微环境，抑制肿瘤的进展。与化疗药物对照组相比，扶正清毒方在降低G-MDSCs比例、抑制其功能相关分子表达以及调节细胞因子分泌等方面表现出更显著的效果，尤其是高剂量的扶正清毒方。这表明扶正清毒方在调控G-MDSCs方面具有独特的优势，可能为胃癌的治疗提供一种新的、更有效的策略。然而，本研究也存在一定的局限性，如仅在小鼠荷瘤模型中进行了研究，缺乏人体临床试验的验证；对于扶正清毒方调控G-MDSCs的具体分子机制尚未完全明确，仍需进一步深入研究。未来的研究可以开展临床研究，验证扶正清毒方在人体中的疗效和安全性；同时，利用分子生物学技术，深入探究其作用的分子机制，为扶正清毒方的临床应用提供更坚实的理论基础和实验依据。五、扶正清毒方调控G-MDSCs延缓胃癌进展的机制研究5.1实验材料与方法5.1.1实验细胞、动物与试剂选用人胃癌细胞系SGC-7901和MGC-803，这两种细胞系均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，在胃癌研究领域应用广泛，其生物学特性稳定，可用于研究胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭及凋亡等生物学行为，以及药物对其作用机制的探究。实验动物选用6-8周龄的SPF级BALB/c小鼠，体重18-22g，购自[具体实验动物供应商名称]。小鼠饲养环境温度控制在（23±2）℃，相对湿度维持在（50±10）%，采用12h光照/12h黑暗循环模式，小鼠自由摄食和饮水，适应环境1周后用于实验。选择该品系小鼠是因为其免疫功能健全，对人胃癌细胞具有较好的肿瘤移植适应性，能较好地模拟人胃癌在体内的生长环境，便于研究扶正清毒方对荷瘤小鼠体内G-MDSCs的调控作用及对胃癌进展的影响。扶正清毒方药材均购自[具体药材供应商名称]，并经专业药师严格鉴定，确保符合质量标准。按照扶正清毒方的经典配方，准确称取黄芪、女贞子、白术、薏苡仁、半枝莲、白花蛇舌草、莪术、藤梨根等药材，加适量水浸泡后，运用传统水煎煮法进行提取，经过滤、浓缩，制备成含生药浓度为[X]g/mL的药液，4℃保存备用。扶正清毒方含药血清的制备：选取健康的SPF级SD大鼠，体重200-220g，购自[实验动物供应商名称]。适应性饲养1周后，随机分为正常对照组和扶正清毒方给药组。扶正清毒方给药组按照[X]g/kg的剂量灌胃给予扶正清毒方药液，正常对照组给予等体积的生理盐水，每天1次，连续灌胃7天。末次灌胃后1.5h，用10%水合氯醛（3mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血，将血液置于无菌离心管中，室温静置1h后，3000r/min离心15min，分离血清，将扶正清毒方给药组大鼠血清合并，56℃水浴灭活30min，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-80℃保存备用，即得到扶正清毒方含药血清；正常对照组大鼠血清同样处理后作为正常血清。通过制备含药血清，可模拟药物在体内的代谢过程，以便在细胞实验和动物实验中更准确地研究扶正清毒方的作用机制。为了研究扶正清毒方调控G-MDSCs的信号通路机制，选用了特定的信号通路抑制剂，如针对STAT3信号通路的抑制剂AG490，购自Sigma-Aldrich公司，其纯度高、活性稳定，能有效抑制STAT3的磷酸化，阻断该信号通路的传导，用于探究扶正清毒方是否通过调控STAT3信号通路来影响G-MDSCs的功能和胃癌的进展。在相关检测试剂方面，采用ELISA试剂盒检测血清和肿瘤组织匀浆中细胞因子的水平，如IL-6、IL-10、TGF-β、CCL2等，这些试剂盒购自R&DSystems公司，该公司的ELISA试剂盒具有灵敏度高、特异性强、重复性好的特点，能够准确检测细胞因子的含量，为研究扶正清毒方对G-MDSCs相关细胞因子分泌的影响提供可靠的数据支持。此外，还使用了BCA蛋白定量试剂盒（购自ThermoFisherScientific公司）用于蛋白定量，确保实验中蛋白浓度的准确性；PVDF膜（购自Millipore公司），其具有良好的蛋白质吸附性能和化学稳定性，适用于Westernblot实验；ECL化学发光试剂盒（购自Bio-Rad公司），可用于检测Westernblot实验中的目的蛋白条带，具有高灵敏度和低背景的优点；各种抗体，如抗p-STAT3抗体、抗STAT3抗体、抗ARG1抗体、抗iNOS抗体、抗PD-L1抗体等，均购自CellSignalingTechnology公司，这些抗体经过严格验证，特异性强，能够准确识别相应的蛋白，用于检测信号通路蛋白和G-MDSCs功能相关蛋白的表达水平。实验中所用的其他化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司，以保证实验的可靠性和重复性。5.1.2实验方法细胞共培养实验：将胃癌细胞（SGC-7901或MGC-803）以每孔1×10⁵个细胞的密度接种于6孔板中，培养24h使其贴壁。然后将分离得到的小鼠骨髓来源的G-MDSCs以1:1的比例与胃癌细胞进行共培养。共培养体系分为空白对照组（仅含胃癌细胞和正常培养基）、扶正清毒方含药血清组（含胃癌细胞、G-MDSCs和扶正清毒方含药血清的培养基）、抑制剂组（含胃癌细胞、G-MDSCs、扶正清毒方含药血清以及信号通路抑制剂的培养基，如加入AG490抑制STAT3信号通路），每组设置3个复孔。在37℃、5%CO₂培养箱中培养48h后，收集细胞和培养上清，用于后续检测。通过细胞共培养实验，可模拟肿瘤微环境中胃癌细胞与G-MDSCs的相互作用，研究扶正清毒方对这种相互作用的影响，以及信号通路抑制剂对扶正清毒方作用的调节，从而探究扶正清毒方调控G-MDSCs的细胞水平机制。动物实验：将BALB/c小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、扶正清毒方低剂量组、扶正清毒方高剂量组、化疗药物对照组（如奥沙利铂组）、扶正清毒方+抑制剂组（在扶正清毒方高剂量组基础上给予信号通路抑制剂），每组10只。除空白对照组外，其余各组小鼠均通过皮下注射人胃癌细胞系SGC-7901（5×10⁶个/只）构建胃癌移植瘤模型。待肿瘤生长至平均体积约100-150mm³时，开始给药干预。扶正清毒方低剂量组给予[X]g/kg的扶正清毒方药液灌胃，扶正清毒方高剂量组给予[2X]g/kg的扶正清毒方药液灌胃，化疗药物对照组给予奥沙利铂（[具体剂量]mg/kg）腹腔注射，空白对照组和模型对照组给予等体积的生理盐水灌胃或腹腔注射，扶正清毒方+抑制剂组在给予扶正清毒方高剂量药液灌胃的同时，腹腔注射信号通路抑制剂（如AG490，按照[具体剂量]mg/kg），每天1次，连续给药21天。实验过程中，每隔2-3天用游标卡尺测量肿瘤的长径（a）和短径（b），按照公式V=1/2×a×b²计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，观察扶正清毒方及信号通路抑制剂对胃癌移植瘤生长的影响。通过动物实验，可在体内环境下研究扶正清毒方对胃癌进展的影响，以及信号通路抑制剂与扶正清毒方的协同作用，进一步明确扶正清毒方调控G-MDSCs延缓胃癌进展的体内机制。Westernblot检测信号通路蛋白表达：在细胞共培养实验或动物实验结束后，收集细胞或肿瘤组织，加入适量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），冰上裂解30min，然后12000r/min离心15min，取上清液。采用