2025年生物医药蛋白质工程技术考核试卷及答案

2025年生物医药蛋白质工程技术考核试卷及答案一、单项选择题（共15题，每题2分，共30分）1.蛋白质工程的核心目标是：A.解析天然蛋白质三维结构B.通过基因改造获得具有特定功能的蛋白质C.大规模表达重组蛋白质D.分离纯化天然蛋白质2.定点突变技术中，PCR介导的突变常用的引物设计原则是：A.引物长度1520bp，突变位点位于引物5’端B.引物长度2540bp，突变位点位于引物中间C.引物长度1015bp，突变位点位于引物3’端D.引物长度5060bp，突变位点随机分布3.用于蛋白质二级结构预测的常用生物信息学工具是：A.SWISSMODELB.PHYRE2C.JPred4D.PyMOL4.以下哪种技术可直接检测蛋白质配体相互作用的动力学常数（如KD值）？A.SDSPAGEB.表面等离子共振（SPR）C.圆二色谱（CD）D.荧光共振能量转移（FRET）5.工业用α淀粉酶的热稳定性改造中，最常用的理性设计策略是：A.引入二硫键B.增加表面电荷排斥C.缩短柔性环D.替换为疏水性氨基酸6.噬菌体展示技术中，外源蛋白通常与噬菌体的哪种蛋白融合表达？A.衣壳蛋白pVB.尾丝蛋白pIIIC.头部蛋白pVIIID.基质蛋白pVI7.易错PCR（errorpronePCR）中，通过添加哪种离子可降低DNA聚合酶的保真性？A.Mg²+B.Mn²+C.Ca²+D.Zn²+8.抗体工程中，CDR区（互补决定区）的主要功能是：A.维持抗体结构稳定性B.与抗原特异性结合C.激活补体系统D.介导抗体跨膜运输9.蛋白质结晶时，常用的沉淀剂不包括：A.聚乙二醇（PEG）B.硫酸铵C.异丙醇D.柠檬酸钠10.以下哪种方法属于蛋白质非理性设计？A.基于同源建模的活性位点突变B.定向进化C.分子动力学模拟优化构象D.理性设计的定点饱和突变11.重组蛋白质在大肠杆菌中表达时，包涵体形成的主要原因是：A.温度过低导致折叠缓慢B.目的蛋白表达量过高，折叠中间体聚集C.培养基中缺乏金属离子辅助因子D.宿主菌蛋白酶活性过高12.用于评估蛋白质热稳定性的常用实验方法是：A.差示扫描量热法（DSC）B.紫外可见吸收光谱C.动态光散射（DLS）D.核磁共振（NMR）13.蛋白质工程中，“从头设计”（denovodesign）的关键是：A.基于已知结构模板进行突变B.完全人工设计氨基酸序列并合成C.通过定向进化筛选功能蛋白D.利用噬菌体展示库筛选结合蛋白14.以下哪种酶常用于DNA片段的平末端连接？A.T4DNA连接酶B.限制性内切酶EcoRIC.逆转录酶D.TaqDNA聚合酶15.工业酶制剂中，通过蛋白质工程改造提高酶的pH适应性，主要针对的是：A.活性中心氨基酸的pKa值B.蛋白质整体电荷分布C.二硫键数量D.糖基化修饰位点二、多项选择题（共5题，每题3分，共15分，多选、错选不得分，少选得1分）1.蛋白质理性设计的关键要素包括：A.目标蛋白的三维结构信息B.氨基酸突变对功能的预测模型C.高通量筛选技术D.随机突变文库的构建2.定向进化技术的主要步骤包括：A.构建突变文库B.功能筛选或选择C.目标蛋白结构解析D.优势突变体的再突变与筛选3.影响蛋白质热稳定性的因素有：A.分子内氢键数量B.表面疏水性氨基酸比例C.二硫键位置与数量D.盐桥（离子键）的分布4.以下哪些技术可用于蛋白质互作网络分析？A.酵母双杂交（Y2H）B.串联亲和纯化（TAP）C.免疫共沉淀（CoIP）D.等温滴定量热法（ITC）5.CRISPRCas9系统在蛋白质工程中的应用包括：A.定点敲入突变基因B.构建基因敲除细胞株C.调控目标基因转录水平D.直接编辑蛋白质氨基酸序列三、填空题（共10空，每空1分，共10分）1.蛋白质工程的核心流程包括分子设计、__________、__________和功能验证。2.定点饱和突变技术中，常用__________（碱基简并码）实现单个位点的多种氨基酸替换。3.抗体人源化改造的主要目的是降低__________。4.蛋白质结构解析的三大实验方法是X射线晶体学、__________和冷冻电镜（CryoEM）。5.工业酶改造中，通过__________（技术）可提高酶在有机溶剂中的稳定性。6.噬菌体展示库的库容通常用__________（单位）表示，决定了筛选的覆盖范围。7.蛋白质糖基化修饰会影响其__________（至少答1点）和免疫原性。8.易错PCR中，突变频率通常控制在__________（范围），以避免功能丧失。四、简答题（共4题，第12题各6分，第34题各7分，共26分）1.简述理性设计与非理性设计（定向进化）的主要区别，并各举1例应用场景。2.说明噬菌体展示技术筛选抗原结合肽的基本流程。3.开放型问题：若需改造新冠病毒刺突蛋白（S蛋白）的RBD区以降低其与ACE2受体的结合能力（用于开发中和抗体靶点），可采用哪些蛋白质工程策略？（至少列出3种并简述原理）4.封闭型问题：解释“蛋白质分子动力学模拟”在蛋白质工程中的作用，并举1例具体应用。五、应用题（共2题，第1题10分，第2题9分，共19分）1.计算与分析题：某实验室通过易错PCR构建突变文库，使用含0.5mMMnCl₂的反应体系（正常PCR无Mn²+时突变率为0.1%）。已知Mn²+浓度每增加0.1mM，突变率提高0.3%。若目标突变率为1.0%，需调整MnCl₂浓度至多少？若突变文库大小为1×10⁶克隆，其中携带单个突变的克隆占比约为多少？（假设突变符合泊松分布，公式：P(n)=e^(λ)λⁿ/n!，λ为平均突变数）2.综合设计题：设计一个实验方案，通过蛋白质工程改造人胰岛素，使其与胰岛素受体（IR）的亲和力提高2倍以上。要求包含以下关键步骤：（1）目标区域选择；（2）突变策略；（3）表达与纯化；（4）亲和力检测方法。答案及解析一、单项选择题1.B（蛋白质工程通过基因修饰或合成，改造现有蛋白质或设计新蛋白质，核心是获得特定功能）2.B（引物需足够长以保证特异性，突变位点位于中间以确保有效掺入）3.C（JPred4专注二级结构预测；SWISSMODEL和PHYRE2用于同源建模，PyMOL用于结构可视化）4.B（SPR可实时监测相互作用动力学，直接计算KD值）5.A（引入二硫键是提高热稳定性最经典的理性设计策略）6.B（噬菌体展示中，外源蛋白多与pIII或pVIII融合，pIII用于展示大蛋白，pVIII用于小肽）7.B（Mn²+可替代Mg²+，降低Taq酶的3’→5’外切酶活性，增加错配率）8.B（CDR区是抗体与抗原结合的关键区域）9.D（柠檬酸钠常用作缓冲液，而非沉淀剂；PEG、硫酸铵、异丙醇是常见沉淀剂）10.B（定向进化属于非理性设计，依赖随机突变和筛选）11.B（表达量过高时，折叠中间体来不及正确折叠，形成包涵体）12.A（DSC通过测量热变性温度（Tm）评估热稳定性）13.B（从头设计完全人工设计序列，不依赖天然模板）14.A（T4DNA连接酶可连接平末端和黏性末端；EcoRI是内切酶，逆转录酶用于cDNA合成，Taq用于PCR）15.A（pH适应性主要与活性中心氨基酸的解离状态（pKa）有关）二、多项选择题1.AB（理性设计依赖结构信息和预测模型；C、D属于定向进化要素）2.ABD（定向进化步骤：突变文库构建→筛选→优势突变体再进化；结构解析非必需）3.ACD（表面疏水性过强会导致聚集，降低稳定性；氢键、二硫键、盐桥均增强稳定性）4.ABCD（Y2H、TAP、CoIP用于互作检测，ITC用于热力学分析）5.ABC（CRISPR编辑DNA水平，无法直接编辑蛋白质序列）三、填空题1.基因操作（或“基因改造”）；重组表达（或“表达筛选”）2.NNK（或“NNB”，N=A/T/C/G，K=G/T，覆盖20种氨基酸）3.免疫原性（或“人抗鼠抗体反应”）4.核磁共振（NMR）5.表面化学修饰（或“定点突变增加极性基团”“糖基化修饰”）6.克隆数（或“cfu”，菌落形成单位）7.稳定性/溶解度/半衰期（任答1点）8.0.5%2%（或“每个基因15个突变”）四、简答题1.区别：理性设计基于蛋白质结构与功能关系的认知，定向改造特定氨基酸（如活性中心突变）；非理性设计（定向进化）通过随机突变+高通量筛选获得功能优化变体（无需已知结构）。应用场景：理性设计例：改造胰蛋白酶活性中心的His57提高底物特异性；定向进化例：改造β内酰胺酶提高抗生素抗性。2.流程：①构建噬菌体展示文库（外源肽基因与噬菌体衣壳蛋白基因融合）；②文库与固定化抗原孵育，未结合噬菌体洗脱；③结合噬菌体洗脱后感染宿主菌扩增；④重复“吸附洗脱扩增”35轮富集高亲和力克隆；⑤测序分析阳性克隆的外源肽序列。3.策略：①定点突变RBD区关键结合残基（如ACE2接触位点K417、E484、N501），替换为电荷或空间位阻大的氨基酸（如K417A）破坏相互作用；②插入柔性肽段增加RBD构象灵活性，降低与ACE2的互补性；③通过定向进化构建RBD随机突变文库，筛选与ACE2结合减弱的变体（利用SPR或流式细胞术筛选）；④糖基化工程：在RBD区引入新的N糖基化位点（如突变S/T为NXS/T），通过糖链遮蔽结合界面。4.作用：通过模拟蛋白质在不同条件下的动态构象变化（如温度、pH、配体结合），预测突变对结构稳定性和功能的影响，为理性设计提供依据。应用例：模拟胰岛素与受体结合时的构象变化，发现B链C端柔性区（B24B30）是关键结合区域，指导该区域的定点突变以增强互补性。五、应用题1.计算：（1）初始突变率0.1%（无Mn²+），Mn²+每增加0.1mM，突变率提高0.3%。设需Mn²+浓度为xmM，则：0.1%+(x0)/0.1×0.3%=1.0%解得：(x/0.1)×0.3%=0.9%→x=0.3mM（2）平均突变数λ=1.0%（突变率）×基因长度（假设目标基因长度为1000bp，突变率1.0%即1个突变/基因）。单个突变克隆占比P(1)=e^(1)×1¹/1!≈0.368（36.8%）。2.实验方案：（1）目标区域选择：胰岛素与IR结合的关键区域（A链N端、B链C端及α螺旋区，如B12B16、A1A4），参考已解析的胰岛素IR复合物晶体结构（PDB:4OGA）。（2）突变策略：①理性设计：对结合界面的疏水残基（如B15Leu、B24Phe）进行饱和突变（NNK简并引物），增强与IR疏水口袋