动物细胞融合实验教学设计与课件

动物细胞融合实验教学设计与课件一、实验名称动物细胞融合技术二、实验类型综合性实验三、实验对象生命科学相关专业本科学生四、实验学时3-4学时五、实验目的与要求本实验旨在使学生通过亲手操作，深入理解动物细胞融合的基本原理和重要意义，掌握聚乙二醇（PEG）诱导动物细胞融合的基本操作技术，并观察细胞融合的过程及结果。具体要求如下：1.知识目标：阐明细胞融合的概念、生物学意义；解释PEG诱导细胞融合的原理；了解细胞融合技术在生命科学研究领域的广泛应用。2.能力目标：熟练掌握鸡血红细胞的采集、洗涤与处理方法；准确操作PEG诱导细胞融合的关键步骤；学会使用显微镜观察并识别不同阶段的融合细胞，初步判断融合效率。3.情感态度与价值观目标：培养学生严谨的科学态度、细致的观察能力和规范的实验操作技能；激发学生对细胞工程等前沿生物技术的兴趣，培养其科学探究精神与创新意识。六、实验原理细胞融合，又称细胞杂交，是指两个或多个细胞通过细胞膜的融合形成一个杂种细胞的过程。在自然生理状态下，细胞融合现象普遍存在，如受精过程。在实验室条件下，可通过物理（如电激）、化学（如PEG）或生物（如灭活病毒）方法诱导细胞融合。本实验采用化学诱导法，以PEG作为融合剂。PEG是一种水溶性高分子化合物，其诱导细胞融合的机制尚未完全阐明，目前普遍认为：PEG能改变细胞膜的磷脂双分子层的排列，使细胞膜的流动性增加，同时降低细胞表面张力，导致细胞之间相互聚集、接触。在高浓度PEG的作用下，相邻细胞膜接触区域的磷脂分子发生重排，进而发生膜融合，随后细胞质流通，最终形成含有两个或多个细胞核的杂种细胞。鸡血红细胞因其来源广泛、取材方便、细胞体积较大、细胞核明显且无细胞核的干扰（此处指成熟红细胞，鸟类红细胞有核），是观察细胞融合过程的理想材料。通过离心、洗涤等步骤处理鸡血细胞，去除血浆等杂质后，在适宜浓度的PEG溶液作用下，可诱导红细胞发生融合。融合过程通常经历细胞接触、细胞膜融合、细胞质融合和细胞核融合等阶段。七、实验材料与试剂1.实验材料：新鲜鸡血（由屠宰场提供或实验前采集）。2.实验试剂：*0.85%生理盐水（或PBS缓冲液，pH7.2-7.4）*Alsever’s抗凝剂（或柠檬酸钠抗凝剂，适宜浓度）*聚乙二醇（PEG）：分子量选用常用的，配制成适宜浓度的溶液（用生理盐水或PBS缓冲，pH调至中性）*詹纳斯绿染液（可选，用于线粒体染色，辅助观察细胞活性）八、实验仪器与耗材1.实验仪器：普通光学显微镜、倒置显微镜（可选）、离心机、恒温水浴锅、冰箱、移液器（1mL,200µL等规格）、试管架、记号笔。2.实验耗材：一次性无菌注射器（带针头）、离心管（10mL或15mL）、试管、载玻片、盖玻片、烧杯（50mL,100mL）、胶头滴管、移液枪吸头、废液缸、擦镜纸。九、实验步骤与操作要点（一）鸡血红细胞的采集与处理1.鸡血采集与抗凝：用一次性注射器抽取适量Alsever’s抗凝剂（约为采血量的1/5-1/4），再从鸡翅静脉或心脏采集新鲜鸡血。轻轻摇匀，使血液与抗凝剂充分混合，防止血液凝固。*操作要点：采血过程应规范，避免污染。若血液出现凝块，应弃用。2.红细胞洗涤：*取适量抗凝鸡血于离心管中，加入3-5倍体积的0.85%生理盐水，轻轻混匀。*____rpm离心5-8分钟，弃上清液，保留沉淀的红细胞。*重复上述洗涤步骤2-3次，直至上清液无色透明，以彻底去除血浆蛋白等杂质。*操作要点：离心速度和时间要适中，避免红细胞破裂或沉淀不充分。每次弃上清时，应小心操作，勿将红细胞沉淀倾出。3.红细胞悬液制备：向洗涤后的红细胞沉淀中加入适量0.85%生理盐水，配制成约10%的红细胞悬液，轻轻混匀，置于冰浴或4℃冰箱中备用。*操作要点：红细胞浓度过高或过低均会影响融合效果，应根据经验或预实验调整。（二）PEG诱导细胞融合1.预热：将恒温水浴锅调至37℃（或适宜温度），将PEG溶液、生理盐水（或PBS）、离心管等实验用品置于水浴锅中预热片刻。*操作要点：温度对PEG的融合效果影响较大，需保持稳定。2.细胞准备：取1mL10%的红细胞悬液于离心管中，加入2-3mL预热的生理盐水（或PBS），轻轻混匀，1000rpm离心5分钟，弃尽上清液，留下紧密的红细胞沉淀。*操作要点：务必弃尽上清，否则残留的液体可能稀释PEG浓度，影响诱导效果。3.PEG处理：用预热的移液器吸取适量（例如0.5mL）预热的PEG溶液，缓慢滴加到红细胞沉淀中，边滴加边轻轻旋转离心管，使PEG与红细胞充分接触并混匀。之后将离心管置于37℃水浴中保温1-3分钟（具体时间根据PEG浓度和实验效果调整）。*操作要点：PEG溶液加入时要缓慢均匀，避免局部浓度过高导致细胞大量损伤。混匀动作要轻柔，防止机械损伤细胞。保温时间是关键，过短融合率低，过长细胞损伤严重。4.终止PEG作用：融合保温结束后，缓慢加入预热的生理盐水（或PBS）5-10mL，轻轻混匀，以终止PEG的作用。置于37℃水浴中静置5-10分钟。*操作要点：稀释PEG时应缓慢加入液体，避免细胞受到渗透压急剧变化的冲击。（三）融合细胞观察1.制片：取上述细胞悬液1-2滴，滴于载玻片中央，盖上盖玻片（注意避免产生气泡）。若进行染色，可在盖玻片一侧滴加少量詹纳斯绿染液，另一侧用吸水纸吸引，使染液渗入，染色数分钟后观察。2.镜检：将制备好的装片先置于低倍镜下观察，找到细胞分布均匀的区域，再转换至高倍镜仔细观察。*操作要点：显微镜操作应规范，先用低倍镜定位，再转换高倍镜。注意调节光线和焦距，以获得清晰图像。3.结果观察与记录：仔细观察细胞形态，识别未融合的单个红细胞、正在融合的细胞（如两个细胞接触处膜融合形成桥状结构）以及已融合的多核细胞（如双核、三核甚至多核的融合细胞）。绘制所观察到的不同融合阶段的细胞形态图，并记录观察结果。十、实验结果观察与记录1.观察内容：*未融合的鸡血红细胞形态：通常呈双面凹的圆盘状（正常形态）或因处理略有变化。*融合过程中的细胞形态：如细胞粘连、细胞膜局部融合、细胞质开始沟通等。*融合后的细胞形态：双核细胞、三核细胞、四核细胞及多核融合体。注意观察融合细胞的大小、细胞核数量及排列方式。2.记录方式：*绘图：在实验报告中绘制观察到的典型细胞形态，包括单个细胞、不同融合阶段的细胞以及融合后的多核细胞，并进行标注。*文字描述：描述所观察到的融合细胞的数量、形态特征、大致比例等。*（可选）拍照：若有显微摄影设备，可拍摄典型的融合细胞图像附于实验报告中。十一、实验注意事项1.实验安全：*鸡血可能携带病原体，操作时需注意个人防护，佩戴手套，实验后及时洗手。*实验器材如针头、刀片等使用后应放入指定利器盒，严禁随意丢弃。*妥善处理实验废液和废弃物，不得随意倾倒。2.试剂使用：*PEG具有一定的刺激性，操作时避免接触皮肤和黏膜，若不慎接触，应立即用大量清水冲洗。*所有试剂使用前需仔细核对标签，确认无误后方可使用。试剂应按要求储存和处理。3.操作规范：*离心操作时，离心管需平衡放置，盖紧盖子，防止液体溢出和离心管破裂。*显微镜使用时，动作要轻，避免损坏镜头和载物台。高倍镜观察时，切勿使用粗准焦螺旋。*严格控制实验各步骤的时间、温度和试剂用量，以保证实验结果的可靠性和重复性。4.无菌观念：虽然本实验对无菌要求不如细胞培养严格，但基本的清洁操作仍需注意，以减少污染对观察结果的干扰。十二、实验思考题1.简述PEG诱导动物细胞融合的可能机制。2.实验中，为什么要对鸡血红细胞进行多次洗涤？3.影响细胞融合率的主要因素有哪些？（至少列举2-3点）4.观察到的融合细胞中，双核细胞和多核细胞是如何形成的？5.除了PEG诱导法，还有哪些常用的细胞融合方法？各有何优缺点？6.细胞融合技术在生物学研究和医学领域有哪些重要的应用？（试举例说明）十三、实验教学建议1.课前预习：要求学生在实验前认真阅读实验指导书，复习细胞融合相关理论知识，明确实验目的、原理和步骤，了解各试剂的作用及注意事项。可布置相关思考题，引导学生主动思考。2.课堂组织：*教师讲解与演示：实验开始前，教师应对实验原理、关键步骤（如PEG处理、细胞洗涤）、操作要点和注意事项进行重点讲解和必要的示范操作，特别是强调PEG处理的时机和手法。*分组合作：可将学生分成小组进行实验，培养其团队协作能力。小组成员分工合作，如负责采血、离心、PEG诱导、制片观察等不同环节。*巡回指导：实验过程中，教师应密切关注学生的操作情况，及时发现并纠正不规范操作，解答学生提出的疑问，对普遍存在的问题进行集中指导。3.难点解析：*PEG浓度与作用时间：这是影响融合效果的关键因素，可引导学生思考不同浓度和时间可能产生的影响，鼓励有条件的情况下进行探索性尝试。*细胞状态：强调细胞悬液制备的质量对后续实验的影响，如细胞浓度、活性等。*显微镜观察技巧：指导学生如何快速找到融合细胞，区分正常细胞与融合细胞，特别是处于不同融合阶段的细胞形态特征。4.鼓励提问与讨论：在实验过程中及实验后，鼓励学生积极提问，对实验现象和结果进行讨论分析，如“为什么有些细胞没有融合？”“观察到的多核细胞一定是融合产生的吗？”等，培养其批判性思维。5.安全教育贯穿始终：从实验开始到结束，时刻强调实验安全规范，确保实验在安全有序的环境下进行。6.实验报告指导：要求学生认真撰写实验报告，包括实验目的、原理、步骤、结果（图文并茂）、讨论（结合思考题和实验中遇到的问题进行分析）和结论。教师对实验报告进行细致批阅，及时反馈，帮助学生巩固所学知识。十四、板书设计或课件内容要点（示例）动物细胞融合实验1.引言：细胞融合的概念、意义（提问：大家知道克隆羊多莉吗？它的培育过程是否涉及细胞融合？）2.实验目的：（知识、能力、情感三方面简述）3.实验原理：*细胞融合的定义*PEG诱导融合的原理（图文结合：细胞膜结构、PEG作用示意图）*鸡血红细胞作为实验材料的优点4.实验材料与试剂：（列表展示，重点介绍PEG、抗凝剂的作用）5.实验步骤：（流程图形式展示，突出关键步骤：红细胞洗涤、PEG处理、终止反应）*鸡血处理→红细胞洗涤→PEG诱导→终止反应→制片观察*关键操作要点用醒目标记（如★）6.预期实验结果与观察要点：*展示典型的融合细胞图片（单个细胞、双核、多核细胞）*绘图示例7.注意事项：（