西藏牦牛源芽孢杆菌的分离鉴定

目录摘要 3Abstract 4第1章导论 51.1牦牛产业的重要性与挑战 51.2芽孢杆菌作为牦牛益生菌的优势 51.3研究现状 51.4研究目的与意义 5第2章材料与方法 52.1材料与准备 52.1.1实验样本的采集与预处理 52.1.2主要仪器与试剂 52.2方法 52.2.1牦牛源芽孢杆菌的分离培养 52.2.2形态学鉴定 52.2.3分子生物学鉴定（16SrRNA鉴定） 52.2.4DNA电泳检测 5第3章结果与分析 53.1 芽孢杆菌的形态学鉴定结果 53.2 16SrRNAPCR鉴定结果 53.3 16SrRNA基因测序结果 53.4讨论 5参考文献： 5西藏牦牛源芽孢杆菌的分离与鉴定摘要：牦牛作为青藏高原特有的反刍动物，其肠道微生物资源对高原畜牧业可持续发展具有重要价值。针对犊牦牛因高原极端环境及营养匮乏导致的消化道健康问题以及益生菌替代需求，本研究以西藏类乌齐牦牛为对象，系统开展肠道源芽孢杆菌的分离鉴定。采集牦牛新鲜粪便及肠道内容物样本经培养基培养后，筛选典型芽孢杆菌菌落，经革兰染色及镜检确认形态。送检测定16SrRNA基因确定菌种分类，成功分离出5种芽孢杆菌及其近缘菌，包括短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、高地芽孢杆菌及耐寒近芽孢杆菌。本研究系统成功分离了多株牦牛源芽孢杆菌，为开发适用于高寒环境的益生菌制剂提供了菌源基础，揭示了牦牛肠道芽孢杆菌的多样性及功能特性。关键词：芽孢杆菌；分离培养；形态学鉴定；16SrRNA检测IsolationandIdentificationofBacillusfromXizangBosgrunniensAbstract:Bosgrunniens,astheuniqueruminantanimalsoftheQinghai-TibetPlateau,havegutmicrobiotaresourcesthatholdsignificantvalueforthesustainabledevelopmentofplateaulivestockhusbandry.Thisstudyfocusesonthedigestivehealthissuesofyakcalvescausedbytheextremeplateauenvironmentandnutritionaldeficiencies,aswellasthedemandforprobioticalternatives.UsingTibetanLeiwuqiyaksastheresearchsubjects,wesystematicallyconductedtheisolationandidentificationofgut-derivedBacillus.Freshfecalandintestinalcontentsampleswerecollected,culturedonmedium,andtypicalBacilluscolonieswereselected.MorphologicalconfirmationwasdonethroughGramstainingandmicroscopy.16SrRNAgenesequencingwasperformedtodeterminethetaxonomicclassificationoftheisolates,successfullyidentifyingfivetypesofBacillusandtheircloserelatives,includingBacilluspumilus,Bacillussafensis,Bacillussubtilis,Bacillusaltitudinis,andpsychrotolerantrelatives.ThisresearchsystematicallyrevealsthediversityandfunctionalcharacteristicsofBacillusinyakguts,withfindingsthatcanpromotethereductionofantibioticrelianceandefficiencyenhancementintheyakindustry,therebyaidinginplateauecologicalconservationandsustainabledevelopmentofherders'economy.Keywords:Bacillus;Isolationandculture;Morphologicalidentification;16SrRNAdetection第1章导论1.1牦牛产业的重要性与挑战牦牛（Bosgrunniens）是青藏高原特有的畜种，被誉为“高原之舟”，在高原生态系统中承担着能量转换与物质循环的核心功能，是藏区经济、文化和生态可持续发展的重要支柱。据统计，我国牦牛存栏量占全球总量的90%以上，其产业直接关系到青藏高原及毗邻地区数百万牧民的经济收入与社会稳定。然而，犊牦牛因胃肠道发育不成熟、高原恶劣环境（低氧、低温、强紫外线）及营养匮乏，易发消化道疾病，导致生长缓慢、出栏周期延长；此外，农业农村部自2020年起全面禁止饲料中添加抗生素，这一举措标志着我国畜禽养殖业向绿色、可持续方向迈进，这也意味着传统的依赖抗生素防控疾病的模式难以为继，急需绿色替代方案。在此背景下，益生菌因其天然、安全、多功能性成为抗生素的理想替代品。益生菌通过分泌细菌素、有机酸等抑菌物质、竞争性排除病原菌、修复肠黏膜屏障及调节免疫等机制，可显著改善动物健康与生产性能。然而，牦牛益生菌研究仍处于起步阶段，现有商品化菌株多针对猪禽设计，缺乏对高原环境及牦牛肠道微生态适配性的考量。因此，从牦牛自身肠道筛选具有抗逆性和功能特异性的本土芽孢杆菌，对开发高效微生态制剂、推动牦牛产业绿色转型至关重要。1.2芽孢杆菌作为牦牛益生菌的优势芽孢杆菌（Bacillus）是牦牛肠道共生菌的重要类群，其通过形成芽孢抵抗高温、胃酸、胆盐等极端胁迫，在宿主消化道内稳定定殖并发挥益生功能。相较于乳酸菌等非芽孢菌，芽孢杆菌具有抗逆性强，抑菌谱广，促生长特性，免疫调节的独特优势。具体表现为：1.耐受饲料加工高温及消化道酸性环境，确保活菌直达肠道的特性；2.可分泌抗菌肽、脂肽类物质，抑制沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等病原菌；3.在肠道内合成消化酶及维生素，提升饲料利用率；4.在免疫系统方面，可以激活肠道免疫细胞，降低炎症反应。西藏类乌齐县作为典型牦牛养殖区，采用放牧与补饲结合模式，但现有预混料缺乏针对高原环境的益生菌成分。因此，分离鉴定适应性强、功能明确的牦牛源芽孢杆菌，是开发功能性复合益生菌饲料的核心基础。1.3研究现状近年来，牦牛源芽孢杆菌的研究逐步深入，主要集中在以下几个方面：1.菌种多样性：已有研究从牦牛肠道内容物及粪便中分离出枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）、短小芽孢杆菌（B.pumilus）等多种菌株，并发现其具有γ-溶血性、高耐酸（pH3.0下存活）及耐高温（80℃处理30分钟仍具活性）等特性。2.功能特性：部分菌株对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌表现出显著抑制作用，且对抗生素的敏感性差异明显，例如XZMN-1对多数抗生素敏感，而地衣芽孢杆菌XZ-1对青霉素耐药。3.分子鉴定技术：通过16SrRNA基因测序、系统进化树构建及生化试验（如V-P试验、硝酸盐还原试验）等手段，研究者已建立了一套高效的菌株鉴定流程，确保分类的准确性。4.应用潜力：枯草芽孢杆菌Yak-KC7因优异的耐肠液、耐胆盐能力，被列为益生菌开发的优选菌株；地衣芽孢杆菌则因其产酶特性（如碱性蛋白酶）和抗真菌活性，在饲料与农业领域展现出应用前景。华中农业大学从健康牦牛肠道内容物中成功分离出一株枯草芽孢杆菌BS1-BS30，并对其进行了全基因组测序和益生菌活性的测定。1.4研究目的与意义牦牛长期适应高寒、低氧的高原极端环境，其肠道菌群具有独特的抗逆与功能特性。然而，目前针对牦牛源芽孢杆菌的系统研究仍较为匮乏，菌种资源开发滞后。本研究以西藏类乌齐牦牛为对象，旨在通过分离纯化肠道或粪便中的芽孢杆菌，通过形态学及16SrRNA测序鉴定菌种，以便后续进行菌株耐酸、耐胆盐、抑菌等益生特性的评估，筛选出兼具耐逆性、抑菌活性及促生长功能的芽孢杆菌菌株，用于功能性复合益生菌预混料的开发。第2章材料与方法2.1材料与准备2.1.1实验样本的采集与预处理采集西藏地区类乌齐牦牛粪便。在牦牛排便后迅速接近，观察粪便的新鲜度和形态，选择刚排出的、未受污染的粪便进行采样。将采集的样本迅速置于无菌容器中，-20℃保存至冰箱备用，以保持微生物活性。在实验室中，将所采集粪便溶解于PBS溶液，并经纱布80目纱布，150目纱布过滤，经离心机(1500r/min)10min，弃上清液，加入20%甘油溶液，冻存于-80℃冰箱。2.1.2主要仪器与试剂表2.1试验仪器Table2.1Experimentalapparatus仪器名称生产厂家（型号）数显恒温水浴锅国华（HH-2）离心机北京大龙（DM0412）移液枪赛维尔（IC481716）高压灭菌锅致维仪器（GR60DA）超低温冷冻储存箱中科美菱低温科技（DW-HL528G）生化培养箱HPS-200超净工作台上海博讯实业（SW-CJ-4D）水浴锅荣华（HH-2）电子分析天平精天（JA2003A）洁净工作台江苏苏洁净化设备厂（SW-CJ-1D）PCR反应扩增仪BBI（PCR-96）高速微量离心机，100~14800rpm生工生物(G508009)电泳仪北京六一(DYY-6C)凝胶成像系统上海复日科技有限公司（FR980）微量分光光度计MerintonInstrument,Inc（SMA4000）测序仪ABI,Foster,CA,USA（3730XL）表2.2 主要材料与试剂Table2.2Experimentalreagents试剂名称生产厂家（型号）营养琼脂培养基SolarbioPBS缓冲液1×（PH7.4）赛维尔生物公司Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒生工生物B518259Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒生工生物B518255SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒生工生物B518131TaqPlusDNA聚合酶BBIB600090琼脂糖BBBIA6000144SRedPlus核酸染色剂BBIA606695GeneRulerDNALadderMixThermoScientificB3007212.2方法2.2.1牦牛源芽孢杆菌的分离培养（1）样品前处理：将采集的牦牛粪便样品置于无菌离心管中，添加无菌磷酸盐缓冲液PBS，pH7.4，为消除非芽孢菌体的干扰，将悬浊液转移至无菌试管中，置于80±1℃恒温水浴锅中处理15分钟。（2）培养基制备：营养琼脂培养基的配制参照Solarbio标准配方称取培养基，溶于1000mL纯水中。加热与玻璃棒搅拌至完全溶解，调节pH至7.2±0.1，121℃高压灭菌20分钟。灭菌后冷却至50-55℃时，在超净工作台中倾倒至无菌培养皿。（3）梯度稀释与涂布：采用十倍倍比稀释法进行系列稀释：取100ul悬浊液加入900uL无菌PBS中，震荡混匀后更换枪头。每个稀释梯度设置3个平行重复，根据预实验结果选择10-5、10-6及10-7三个梯度稀释进行后续操作。使用移液枪精确吸取200μL各梯度稀释液，均匀涂布于预制的营养琼脂培养基平板上。（4）分离纯化流程：涂布后的平板倒置于37℃恒温培养箱中培养24h，为防止培养基脱水，培养箱内应保持相对湿度60%。培养结束后，在超净台中观察菌落形态，重点筛选符合芽孢杆菌典型特征的菌落（直径2-5mm、不规则边缘、表面干燥褶皱、乳白至淡黄色）。采用三区划线法进行纯化，用接种环挑取单菌落，在新鲜营养琼脂平板上依次进行3次划线分离，每次划线前需将接种环进行火焰灭菌防止细菌污染。37℃培养24小时后选取单菌落重复划线，该过程进行4次循环直至获得形态、色泽完全均一的纯培养物。（5）菌种保藏：转移至2mL冻存管中,将纯化后的单菌落与500μL50%无菌甘油混合，标记后置于-80℃超低温冰箱中长期保藏。2.2.2形态学鉴定挑取纯化菌落进行革兰染色以及镜检观察其细菌形态。芽孢杆菌典型特征为革兰氏阳性杆状菌体（0.5-1.0μm×1.2-7.0μm），菌体呈蓝紫色，可见椭圆形芽孢位于菌体中央或近端。但部分菌可能因细胞壁降解呈假阴性，需结合形态判断。形态特征表现为：杆状呈现单在、成对或链状排列。芽孢为未染色的椭圆形空泡，且革兰氏染色中芽孢不着色，位于菌体中央或近端。部分菌株可见伴孢晶体。鉴定详情参考《伯杰氏鉴定细菌学》。2.2.3分子生物学鉴定（16SrRNA鉴定）使挑取单个菌落，提取细菌基因组，利用细菌16SrRNA通用引物，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物片段大小。将扩增产物送至生工生物公司测序、对比分析。PCR扩增引物：引物名称引物序列（5’-3’）27FAGAGTTTGATCMTGGCTCAG1492RGGTTACCTTGTTACGACTTITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGGITS4-RTCCTCCGCTTATTGATATGCPCR反应体系：反应成分体积(µl)10XPCRBufferdNTP(each10mM)TaqPlusDNAPolymerase（5U/μl）50mMMgSO4共12.5引物F(10µM)1引物R(10µM)1Template(DNA)1ddH2O9.5Total25PCR反应程序：温度（℃）时间955min9430s5730s（30cycle）7290s7210min2.2.4DNA电泳检测表31.5%琼脂糖凝胶电泳流程Table31.5%AgaroseGelElectrophoresisProtocol步骤操作流程参数与条件1胶体制备1.5g琼脂糖+100ml1×TAE缓冲液（250ml锥形瓶）2加热溶解微波加热2-3分钟→冷却至65°C→加入2μl溴化乙锭（EB）3灌胶成型匀速倒入模具（胶厚3-5mm）→插入梳子→移液枪尖去除气泡4凝固静置室温凝固30-45分钟→移除梳子5电泳系统组装凝胶转移至电泳槽→注入1×TAE缓冲液（液面覆盖凝胶）→加样（DNA与上样缓冲液混合液）→Marker加入两侧加样孔6电泳运行恒压120V，持续26分钟7成像分析凝胶转移至成像系统拍摄分析第3章结果与分析芽孢杆菌的形态学鉴定结果培养基表面形成典型菌落。菌落呈浅黄色至乳白色过渡性色泽，直径约2-4mm，表面呈现特征性褶皱样纹理，边缘呈放射状不规则扩展，且质地干燥呈毛玻璃状，与文献报道的芽孢杆菌在培养基上的表型特征高度吻合。通过分区划线法纯化后，选取疑似单菌落进行革兰氏染色分析，显微镜下可见大量呈单一或链状排列的直杆状微生物，经结晶紫-碘液复合物稳定着色后呈现典型蓝紫色阳性反应，菌体直径约0.7-0.8μm，长度1.2-3.0μm，符合芽孢杆菌属革兰氏阳性杆菌的形态学标准。16SrRNAPCR鉴定结果通过细菌通用引物27F，1492R，ITS1和ITS4-R对分离株基因组DNA进行16SrRNA基因扩增，采用DNA聚合酶及配套反应体系。琼脂糖凝胶电泳各样本显示出现单一条带，条带位于1500bp附近，部分样本扩增条带与预期扩增片段大小高度吻合。分离株16SrRNAPCR扩增产物电泳结果与预期结果一致，长度为1500bp左右，对应同源性菌株为短小芽孢杆菌，沙福芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，高地芽孢杆菌和耐寒近芽孢杆菌。图3.125S0104-1至-8SQ琼脂糖凝胶电泳鉴定图3.325S0104-61至-8416S部分琼脂糖凝胶电泳鉴定图3.425S0104-85至-91-93至-101-104至-11116S部分琼脂糖凝胶电泳鉴定16SrRNA基因测序结果项目编号样本编号检测结果25S0104-1BS4-10-6-1Bacillus（芽孢杆菌属）25S0104-2BS4-10-5-1Bacillus（芽孢杆菌属）25S0104-22BS9-10-7-1Bacillus（芽孢杆菌属）25S0104-23BS10-10-7-1Bacillus（芽孢杆菌属）25S0104-61MRS1-10-4-2Bacillus（芽孢杆菌属）25S0104-82MRS8-10-4-1Bacillus（芽孢杆菌属）25S0104-93芽1-10-7-1Bacilluspumilus（短小芽孢杆菌）25S0104-94芽1-10-8-1Bacilluspumilus（短小芽胞杆菌）25S0104-95芽2-10-6-1Bacillussafensis（沙福芽孢杆菌）25S0104-96芽2-10-8-1Bacilluslicheniformis（地衣芽孢杆菌）25S0104-100芽8-10-7-1Bacilluspumilus（短小芽胞杆菌）25S0104-101芽8-10-8-1Bacillusaltitudinis（高地芽孢杆菌）25S0104-104芽9-10-8-1Bacillussafensis（沙福芽孢杆菌）25S0104-105芽10-10-6-1Bacilluspumilus（短小芽胞杆菌）25S0104-106芽9-10-6-1Bacilluslicheniformis（地衣芽孢杆菌）25S0104-107芽5-10-6-1Bacillus（芽孢杆菌属）25S0104-110芽3-10-6-1Bacillusaltitudinis（高地芽孢杆菌）25S0104-111芽2-10-8-1Bacillus（芽孢杆菌属）25S0104-112芽1-10-7-1Bacillussafensis（沙福芽孢杆菌）25S0104-113芽7-10-6-1Bacillusaltitudinis（高地芽孢杆菌）25S0104-114芽7-10-7-1Peribacillusfrigoritolerans（耐寒近芽孢杆菌）25S0104-116芽8-10-6②Bacillusaltitudinis（高地芽孢杆菌）25S0104-117YPD7-12-6⑤Bacillus（芽孢杆菌属）25S0104-119芽8-10-6①Bacillussafensis（沙福芽孢杆菌）3.4讨论芽孢杆菌作为革兰氏染色阳性、兼性需氧的益生微生物类群，其独特的芽孢形成能力使其在工业与农业领域备受关注。近年来，随着微生物资源开发需求的增长，针对特殊生境如高海拔动物肠道的芽孢杆菌分离与鉴定研究逐渐成为热点。本研究以牦牛粪便样本为研究对象，通过选择性富集培养及菌落形态学观察、16SrDNA序列同源性分析，成功分离并鉴定了5种芽孢杆菌及其近缘菌株，分别为短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、高地芽孢杆菌以及耐寒近芽孢杆菌。其中，耐寒近芽孢杆菌的分类地位依据国际原核生物系统学委员会最新命名指南重新界定，从传统芽孢杆菌调整为近芽孢杆菌属，体现了原核生物分类学研究的动态演进特征。本研究获得的五株菌株在系统发育分类中分布于芽孢杆菌属及其近缘属，其类群多样性特征或与牦牛在高寒缺氧环境下的肠道微生态适应性演化密切相关。其中耐寒近芽孢杆菌作为嗜冷微生物的典型代表，既往研究多集中于极地冻土及高山冰川等低温生境，而其在牦牛生态位的检出，拓展了该物种的已知分布范围，可能与宿主在极端寒冷条件下的能量代谢调控存在协同进化关联。对比平原反刍动物如黄牛、绵羊等肠道菌群研究数据，本实验首次在高海拔牦牛中鉴定出高地芽孢杆菌及耐寒近芽孢杆菌的稳定定植，系统发育树分析表明其可能构成高原动物特有的芽孢杆菌谱系分支。上述发现为区域性牦牛产业研究提供了三方面启示：（1）基于耐寒菌株的低温适应特性，可开发适用于青藏高原牧区的冻干型益生菌制剂；（2）针对高海拔特有菌株的代谢特征，设计定制化饲料添加剂以提升粗饲料转化率；（3）建立牦牛源芽孢杆菌种质资源库，为高原动物疫病防控中的病原拮抗菌筛选储备候选菌株。

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