WB实验试题及答案

WB实验试题及答案一、单项选择题（每题2分，共20分）1.蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验中，SDS的主要作用是？A.破坏二硫键B.使蛋白质带负电荷并变性C.增加溶液密度D.指示电泳进程2.转膜过程中使用PVDF膜时，预处理步骤正确的是？A.直接放入转膜缓冲液中浸泡B.先在甲醇中浸泡30秒，再用转膜缓冲液平衡C.用去离子水浸泡10分钟D.无需预处理，直接与凝胶贴合3.WB实验中，封闭步骤使用5%脱脂奶粉的主要目的是？A.提供营养维持抗体活性B.与膜上未结合蛋白的位点结合，减少非特异性吸附C.增强抗原抗体结合力D.中和膜上残留的转膜缓冲液4.以下哪种情况最可能导致WB结果中出现高背景？A.一抗浓度过低B.封闭时间过长C.洗膜时Tween-2浓度过低D.转膜时间过短5.内参蛋白（如GAPDH）在WB实验中的主要作用是？A.验证转膜是否成功B.作为阳性对照C.校正上样量差异，确保结果可比性D.指示目标蛋白的分子量6.进行SDS时，浓缩胶（积层胶）的pH值通常为？A.6.8B.8.8C.8.3D.7.47.ECL（化学发光）显色时，关键的酶是？A.辣根过氧化物酶（HRP）B.碱性磷酸酶（AP）C.胰蛋白酶D.DNA聚合酶8.WB实验中，分离胶（分离胶）的浓度选择主要依据？A.目标蛋白的等电点B.目标蛋白的分子量C.样品中蛋白质总量D.电泳槽的大小9.以下哪种试剂常用于蛋白质定量（BCA法）？A.考马斯亮蓝B.二喹啉甲酸（BCA）C.溴酚蓝D.丽春红10.转膜后，验证转膜效果的快速方法是？A.考马斯亮蓝染色凝胶B.丽春红染色膜C.直接进行封闭D.用一抗孵育后显色二、填空题（每空1分，共20分）1.WB实验的核心步骤包括：样品制备、________、转膜、________、抗体孵育、洗膜、________。2.SDS上样缓冲液的主要成分包括：________（变性剂）、________（还原剂，破坏二硫键）、甘油（增加样品密度）、________（电泳指示剂）。3.转膜缓冲液中加入甲醇的作用是________（填“增加”或“降低”）SDS的溶解度，________（填“促进”或“抑制”）凝胶收缩，提高蛋白质与膜的结合效率。4.常用的封闭剂除脱脂奶粉外，还有________（需避免用于磷酸化蛋白检测）和________（适用于严格封闭条件）。5.一抗孵育的常用温度是________（需长时间孵育）或________（缩短时间但可能增加非特异性结合）。6.洗膜缓冲液（TBST）的主要成分是Tris-HCl、NaCl和________（非离子型去污剂，减少非特异性吸附）。7.若目标蛋白分子量为100kDa，应选择浓度约为________%的分离胶（常见分离胶浓度：5%、8%、12%、15%）。8.显色时，ECL试剂中的发光底物是________，在HRP催化下与________反应产生化学发光。三、简答题（每题8分，共40分）1.简述SDS与Native的主要区别。2.转膜时，如何根据目标蛋白的分子量选择转膜条件（电流/电压、时间）？3.封闭步骤为何不可省略？若封闭不充分会导致什么结果？4.一抗孵育后洗膜不充分可能对实验结果产生哪些影响？请说明原因。5.列举3种WB实验中常见的“无目标条带”的可能原因，并提出对应的解决方法。四、实验设计与分析题（共20分）请设计一个实验，通过WB检测A细胞在药物X处理后目标蛋白P的表达量变化（要求写出关键步骤、对照组设置及结果分析逻辑）。答案一、单项选择题1.B（SDS通过与蛋白质结合使其带负电荷，并破坏氢键等结构使蛋白质变性，形成线性结构）2.B（PVDF膜需先经甲醇活化，暴露膜上的疏水基团，增强与蛋白质的结合）3.B（封闭剂与膜上未结合蛋白质的位点结合，防止一抗/二抗非特异性吸附）4.C（洗膜时Tween-2浓度过低，无法有效去除非特异性结合的抗体，导致背景高）5.C（内参用于校正上样量差异，确保不同样品间目标蛋白表达量的可比性）6.A（浓缩胶pH6.8，分离胶pH8.8，利用pH差异实现蛋白质浓缩）7.A（ECL显色依赖HRP催化发光底物产生化学发光）8.B（分离胶浓度根据目标蛋白分子量选择，小分子用高浓度胶，大分子用低浓度胶）9.B（BCA法通过二喹啉甲酸与Cu+反应显色定量蛋白质）10.B（丽春红可短暂染色膜上的蛋白质，快速观察转膜是否成功）二、填空题1.SDS电泳；封闭；显色2.SDS；β-巯基乙醇（或DTT）；溴酚蓝3.降低；促进4.BSA（牛血清白蛋白）；酪蛋白5.4℃（过夜）；室温（1-2小时）6.Tween-207.8%（分子量100kDa属于中大分子，8%分离胶适合50-150kDa蛋白）8.鲁米诺（或其衍生物）；过氧化氢（H₂O₂）三、简答题1.主要区别：①SDS中蛋白质被SDS变性并带负电荷，电泳迁移率仅与分子量相关；Native保持蛋白质天然构象和电荷，迁移率与分子量、电荷、形状均有关。②SDS用于分离并检测目标蛋白分子量及表达量；Native用于研究蛋白质活性或复合物结构。③SDS需加入SDS和还原剂（如β-巯基乙醇），Native无变性剂。2.转膜条件选择：①小分子蛋白（<30kDa）：易扩散，需降低转膜时间（1-2小时）或电压（60-80V），避免过转；②大分子蛋白（>100kDa）：扩散慢，需延长转膜时间（2-3小时）或增加电流（300-400mA），或使用半干转（提高效率）；③中等分子量蛋白（30-100kDa）：常规湿转（100V，1-1.5小时）或恒流（250mA，2小时）。3.封闭不可省略的原因：膜（如PVDF/NC膜）具有强疏水结合能力，若不封闭，一抗/二抗会非特异性结合到膜的空白位点，导致高背景或假阳性条带。封闭不充分的结果：膜上残留未结合位点，抗体非特异性吸附，表现为背景模糊、非目标位置出现条带（假阳性）。4.洗膜不充分的影响及原因：①高背景：未结合的一抗/二抗残留，与膜非特异性结合，显色后背景发亮；②非特异性条带：未洗去的抗体与样品中其他蛋白非特异性结合，出现额外条带；③目标条带信号弱：过量抗体覆盖目标条带，或与显色底物反应过快导致信号饱和后淬灭。5.无目标条带的可能原因及解决方法：①目标蛋白未表达或表达量过低：通过提高上样量、优化细胞刺激条件（如延长药物处理时间）或换用高灵敏度显色试剂（如超敏ECL）；②一抗失效或种属不匹配：验证抗体效价（做阳性对照）、确认抗体与目标蛋白种属匹配（如检测人源蛋白需用人源抗体）；③转膜失败（蛋白未转移到膜上）：转膜后用丽春红染色膜（观察是否有蛋白条带）或考马斯亮蓝染色凝胶（确认凝胶中是否仍有蛋白残留），调整转膜时间/电流；④上样缓冲液未煮沸（蛋白未充分变性）：确保上样前样品在100℃煮沸5-10分钟，破坏蛋白质高级结构。四、实验设计与分析题实验设计步骤：1.细胞处理：取对数生长期的A细胞，分为对照组（无药物X）和实验组（药物X处理，设置不同浓度/时间梯度，如10μM处理24小时、48小时）。2.样品制备：细胞裂解：吸去培养基，PBS洗2次，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），冰上裂解30分钟，4℃12,000rpm离心15分钟，取上清。蛋白定量：用BCA法测定蛋白浓度，调整各组样品浓度至一致（如50μg/μL）。上样缓冲液处理：样品与5×SDS上样缓冲液按4:1混合，100℃煮沸10分钟，冰浴冷却。3.SDS电泳：制胶：根据目标蛋白P的分子量（假设为60kDa），配制10%分离胶（适合30-100kDa）和5%浓缩胶。上样：每组上样20-30μg蛋白（根据预实验调整），同时上预染蛋白Marker。电泳条件：浓缩胶80V恒压至溴酚蓝进入分离胶，分离胶120V恒压至溴酚蓝接近胶底部（约1.5小时）。4.转膜：膜选择：PVDF膜（提前甲醇活化30秒，转膜缓冲液平衡5分钟）。转膜装置：湿转法，胶-膜-滤纸三明治结构（注意膜在阳极侧），恒流250mA转膜1.5小时（60kDa蛋白易转移）。5.封闭：转膜后，膜用5%脱脂奶粉（TBST配制）室温封闭1小时（若目标蛋白为磷酸化蛋白，改用5%BSA封闭，避免奶粉中的酪蛋白干扰）。6.抗体孵育：一抗孵育：用封闭液稀释一抗（兔抗人P蛋白抗体，1:1000），4℃孵育过夜（或室温2小时）；同时设置内参抗体（鼠抗人GAPDH抗体，1:5000）。洗膜：TBST洗膜3次，每次10分钟（摇床低速震荡）。二抗孵育：用封闭液稀释HRP标记的二抗（山羊抗兔IgG，1:5000；山羊抗鼠IgG，1:10,000），室温孵育1小时。洗膜：TBST洗膜5次，每次10分钟（减少非特异性结合）。7.显色与成像：膜滴加ECL显色液（A液和B液等体积混合），暗室曝光或用化学发光成像仪采集图像。对照组设置：阳性对照：已知高表达P蛋白的细胞裂解液（验证抗体有效性）；阴性对照：未加一抗的样品（验证二抗是否非特异性结合）；内参对照：GAPDH（校正上