微生物的选择培养和计数-2026学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

1.2.2微生物的培养技术及应用--微生物的选择培养和计数

聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于聚合酶链式反应（PCR）讨论：1.筛选水生栖热菌的思路是什么样的？2.为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找耐高温的酶耐高温生物体高温环境（热泉、火山口）寻找寻找

这是因为水生栖热菌能在70-80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存（1）利用营养缺陷进行选择培养（2）利用添加某种化学物质进行选择培养（3）利用改变培养条件进行选择培养分离耐热菌70～80℃的高温不加氮源的培养基分离固氮微生物

加高浓度食盐分离金黄色葡萄球菌加石油为唯一碳源分离出分解石油的微生物

加青霉素的培养基分离真菌(青霉素能杀死细菌、放线菌)允许特定种类的微生物生长其他种类微生物生长（1）概念抑制或阻止（2）三种方法：一、选择培养基思考·讨论选择培养基配方的设计

尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。讨论：1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？

在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，

除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基，2.从用途上来讲，培养基二属于_____培养基，3.培养基一的碳源为_______，氮源为_______；培养基二的碳源为_______，氮源为_______；培养基一牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g蒸馏水定容到1000ml培养基二KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g琼脂15.0g固体选择牛肉膏蛋白胨葡萄糖尿素4、若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌几乎

该选择培养基，该选择培养基不具有选择性。若完全培养基中生长的菌落数

该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。等于多于思考：如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，可否直接制备土壤溶液，利用平板划线法接种到选择培养基上，进行培养计数？为什么？那有什么更好的方法吗？不能。平板划线法灼烧接种环的时候也会杀死一部分细菌，导致计数偏小。平板划线法最开始的划线细菌可能会长成一片，导致无法计数，二、微生物的选择培养稀释涂布平板法稀释涂布平板法聚集的微生物单个细胞菌液梯度稀释单个菌落涂布平板生长繁殖稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。稀释涂布平板法概述由于土壤细菌的数量庞大，要想得到特定微生物的纯培养物，必须要对土壤进行________，然后再将菌液_____到制备好的__________上；两个基本操作：________和________充分稀释涂布选择培养基梯度稀释涂布平板021mL1mL1mL1mL1mL1mL1×1031×1041×1051×1061×1079mL无菌水90mL无菌水10g取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。（1）梯度稀释1×101×102（2）涂布平板涂布结束后，要将涂布器灼烧灭菌。滴加菌液移液器的枪头要灭菌取0.1ml涂布器消毒多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再灼烧涂布器浸在酒精中涂布器灭菌涂布平板冷却再涂布打开一条缝酒精灯旁转动培养皿，使涂布均匀（3）菌落培养与观察倒置菌液被吸收后30-37℃培养箱中培养①、②、a、b、c每个浓度至少设置1个平板检测培养基是否灭菌彻底d为未接种的培养基d的作用：稀释103倍稀释104倍稀释105倍空白对照abcd原因：两个或多个细胞连在一起，只有一个菌落。30~300菌落数少（间接计数）（4）、稀释涂布平板计数法计数①、原理条件：稀释度足够高方法：数菌落（原因：

。一个单菌落，来源于一个活菌②、原则同一稀释度下，至少对3个平板计数

取其平均值③、缺点统计菌落数往往比活菌的实际数少用于计数的平板：④、计数M稀释倍数；C某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V稀释液的体积(mL)；每样品克中的菌落数＝(C÷V)×M例：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？9×107个/克思考：某两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果：甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230；乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。请评价这两位同学的实验结果的有效性：1.甲同学________________；原因是________________；2.乙同学________________；原因是_____________________________；实验操作不合理未设置重复实验组结果计算不合理21与另外两组数值相差太大，应舍去细菌计数板：血细胞计数板：常用、快速、直观、设备简单；能观察微生物的形态特征。是死菌和活菌总和细菌计数板血细胞计数板（5）、显微镜直接计数工具：较薄，对细菌等较小细胞较厚，较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数结果特点计数室的规格=16×25小方格=25×16小方格1大格=16中方格1大方格=25中方格=400小方格=400小方格规格：25×16统计5个中方格，共16×5=80个小方格规格：16×25统计4个中方格，共25×4=100个小方格计数室放大不管计数室是哪一种规格，都是由400个小方格组成。每个小方格的面积是1/400mm2内容显微镜直接计数法间接计数法（稀释涂布平板法）原理计数依据缺点计算公式结果两种微生物计数方法比较充分稀释，一活菌形成一菌落细菌个数培养基上菌落数两个或多个菌在一起时，只一个菌落不能区分死活菌每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×10000×稀释倍数每克样品中的菌株数:(C÷V)×M比实际值偏大比实际值偏小样方法，一定体积中活菌数方法平板划线法稀释涂布平板法纯培养原理接种工具单菌落的获得用途效果图相同点连续划线，将菌稀释梯度稀释→涂布平板接种环涂布器从最后划线区挑取只有稀释度合适，才能得到单菌落分离菌种，获得单菌落①分离菌种，获得单菌落②用于计数①都能分离纯化菌种

②都在固体培养基上进行平板划线法和稀释涂布平板法的比较③都在酒精灯火焰旁接种合适的等比稀释，均匀涂布得到的菌落互不接触。①、平板划线法不能否达到对细菌进行计数的目的得原因？开始的划线，菌类可能长成一片灼烧一部分菌类。②稀释涂布平板法可以用于细菌的计数的原因？（6）、显微镜直接计数现象分析结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基

是否筛选出一些菌落。1.实验原理绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用________________的_____培养基，可以从土壤中分离出_______的细菌脲酶以尿素作为唯一氮源选择分解尿素CO(NH2)2+H2O脲酶2NH3+CO22.实验步骤（1）土壤取样注意事项：

①接近中性潮湿土壤②铲去表土③铁铲和取样袋使用前都要灭菌④操作完后，一定要洗手三、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（2）制备选择培养基葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g琼脂15.0g蒸馏水1000ml尿素为唯一碳源（3）样品的稀释与涂布平板⑤、另加不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基；以验证培养基中是否含有杂菌；①每个浓度至少设置4个平板②、1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复）③、4为牛肉膏蛋白胨培养基④、4用以判断选择培养基是否具有选择作用（4）微生物的培养与观察①培养条件：不同种类的微生物，培养温度和时间不同。

②观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。

③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出

，如形状、大小和颜色等。细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目稳定的菌落特征

思考：①在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？

选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养；（5）结果分析现象分析未涂布培养基上无菌落生长未涂布培养基上有菌落生长牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数木培养基未被杂菌污染培养基被杂菌污染选择培养基具有选择作用在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。这样，我们就可以初步鉴定该种细菌能够分解尿素。液体培养基：可以直接看液体的变色情况。固体培养基：可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。脲酶的检测属于鉴别培养基课堂练习题1、尿素是一种重要的农业氮肥，但是尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成NH3以后，才能被利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。尿素只能在脲酶的催化下被分解成NH3才能被植物吸收利用。结合所学知识判断：(1)筛选分解尿素的细菌的培养基以尿素为唯一氮源，且为液体培养基。(

)(2)能分解尿素的细菌之所以能分解尿素，是因为其能产生脲酶。(

)(3)稀释涂布平板法能分离细菌，也能计数。(

)(4)测定不同微生物数量时，接种的土壤悬浮液的稀释度相同。(

)(5)菌落特征是鉴别菌种的重要依据。(

)(6)利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量。(

)错误正确正确错误正确错误2、牛奶是微生物的良好培养基，故饮用前需要对牛奶进行消毒。牛奶也可以被加工成酸奶。某生物兴趣小组探究某品牌酸奶中乳酸菌数量时的实验操作如图所示。下列叙述错误的是（

）A．采用巴氏消毒法对牛奶进行消毒的优点是基本不破坏牛奶的营养成分B．应统计a、b、c三个平板中菌落数的平均值，使实验结果更加准确可靠C．该方法统计的结果往往较实际结果偏低，主要原因是存在多个细菌形成一个菌落的现象D．过程①②表示对酸奶样品进行梯度稀释，过程③利用了平板划线法D3．某兴趣小组尝试在马铃薯琼脂培养基上进行酵母菌的纯培养。下列操作顺序合理的是（）A．配制培养基→灭菌→倒平板→接种分离→培养B．配制培养基→倒平板→灭菌→接种分离→培养C．配制培养基→灭菌→接种分离→倒平板→培养D．配制培养基→接种分离→倒平板→灭菌→培养A4．为了从土壤中筛选出产蛋白酶的高产菌株，某同学采集了10g土壤样品，进行了如图筛选过程，并挑选出培养基上的5个菌落分别进行扩大培养。将分别浸过5种菌液的无菌圆纸片置于含高浓度蛋白质的平板培养基表面，结果如图所示。下列叙述正确的是（）A．图中第一次接种菌种应在酒精灯旁操作，使用的是平板划线法B．若三个甲平板上的平均菌落数为30个，则10g土样约含个蛋白分解菌C．为了使乙平板上的实验结果更可信，还可增设浸过无菌水的圆纸片进行对照D．乙平板上的圆纸片b中的菌株不能合成蛋白酶C5、ε-聚赖氨酸（ε-PL）能抑制多种微生物的活性，且人体可将其分解为赖氨酸，是一种优良的天然食品防腐剂。