动物营养代谢病第七章营养代谢病检测技术

动物养分代谢病第七章养分代谢病检测技术

养分代谢病检测技术第七章本章目的：

本章要求了解养分代谢病检测技术的基本学问。

本章重点：

1、血糖、蛋白质和脂肪代谢及微量元素测定。

2、消化汲取代谢过程本章难点：

维生素测定。

第一节蛋白质检测其次节血糖检测第三节脂肪代谢的检

测第四节微量元素检测第五节维生素养分的检测主要内容一、

血清总蛋白测定二、血清白蛋白测定三、血清蛋白电泳四、血

红蛋白测定五、肌红蛋白测定第一节蛋白质检测(Ketosisin

dairycows)一、血清总蛋白测定原理：

碱性溶液中蛋白质分子的肽键与铜离子作用，形成紫红色的

复合物。

这与两个尿素分子缩合生成缩二麻，在碱性条件下与铜离子作

用形成紫红色反应相像，故称为双缩服反应。

一、血清总蛋白测定试剂：

6mol/L氢氧化钠溶液：

溶解120g氢氧化钠于去离子水中，稀释至500ml,置聚乙

烯瓶内盖紧保存。

双缩胭试剂：

称3gCuS045H20和9g酒石酸钾钠(KNaC4H4044H20),先

分别溶于蒸储水，加入碘化钾5g,待完全溶解后混合，加入

6mol/L氢氧化钠100ml,最终以蒸储水加至1L置聚乙烯瓶内盖紧

贮存。

蛋白标准液：

收集混合血清，用凯氏定氮法测定蛋白质含量，亦可用定值

参考血清或标准蛋白作标准。

一、血清总蛋白测定操作：

取三支试管按下表加入式样，混匀37摄氏度水浴放置非常

钟，以空白管调零，540nm波长测定吸光度。

项目测定管

标准管空白管血清/ml

1.00--蛋白

质标准液/ml-

1.00-理生盐水/ml

--L00双

缩胭试剂/ml5.00

5.005.00二、血清白蛋白测定原理：

在pH=4.2环境中，带正电荷的白蛋白（pl=4.9）可以与阴

离子染料漠甲酚绿（BCG）结合，溶液由黄变蓝，在波长630nm具

有最大光汲取，并与白蛋白浓度成正比，与同样处理的白蛋白标准

比较，可求得血清中白蛋白含量。

二、血清白蛋白测定试剂：

溪甲酚绿（BCG）试剂：

于1L容量瓶中盛蒸镭水约400ml,加琥珀酸缓冲贮存液

100ml,用吸管精确吸取BCG贮存液8ml加入，并将内壁沾的染料

冲洗入液体中，加叠氮钠存液2.5ml,聚氧化乙烯月桂酸贮存液

2.5ml,最终用蒸储水稀释至刻度，配好的BCG试剂pH应为4.15

0.05o

白蛋白标准液：

40g/L,也可用定值参考血清。

均需置冰箱保存。

二、血清白蛋白测定操作：

血清白蛋白（g/L）=（Odu/Ods）标准白蛋白浓度（g/L）同

时测定血清总蛋白浓度，减去血清白蛋白浓度，可得血清球蛋白浓

度，并可计算血清白蛋白/球蛋白比值。

三、血清蛋白电泳电泳：

带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定

向移动的现象称为电泳。

应用1.分别各种有机物：

如蛋白质、酶、核酸等2.分析某种物质的纯度及分子量电

泳的基本原理电场中推动带电质点运动的力1F）等于质点所带净

电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。

F=QE质点前移受阻力（F）影响，球形质点听从Stoke定

律，即:

F=6r（r半径，介质粘度，质点移速）质点在电

场।F稳定运动时：

F=F即：

QE=6r同电泳条件下不同物质因其分子大小（「）和带电

量（Q）差异而有不同泳动速度，因此，肯定时间可分别。

按其泳动速度从正极端起（即速度最快〕依次为白蛋白、-

球蛋白、-球蛋白和-球蛋白等条带，有的动物-球蛋白和-球蛋

白可分为两个条带。

血清蛋白的pl大多在7.5以下，在pH8.6的巴比妥缓

冲液中以负离子形式存在，并且蛋白质的分子量、立体构象、等

电点以及形态也有差异，在电场中迁移速度不同，可以在醋酸纤维

薄膜上分别成A、1、2、和五条区带。

醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗

透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用样

量少，分别清楚，无吸附作用。

目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分别和免疫电

泳等方面。

醋酸纤维素薄膜经1,4一二氧六环、透亮液或液体石蜡处理

即透亮，因而可得背景为无色的电泳图谱。

醋酸纤维索薄膜的特性试验操作及留意事项膜的预处理：

将薄膜切成2.58cm,无光泽面对下，漂移于巴比妥缓冲液面

上，膜条自然浸湿下沉。

取充分浸透的膜条，滤纸吸取多余的缓冲液，不要弄太干。

加样：

光面用铅笔标注，无光泽面距一端L5cm处用点样器蘸取簇

新血清点样（不能望见有液滴形成），待血清进入膜内，移开点样

器。

电泳：

放置于电泳槽架时，无光泽面对下，点样端置于负极，膜与

电极紧密接触，不能留有气泡，平衡5分钟，通电lh。

染色：

通电完毕，锻子取出，浸于氨基黑的染色液中5分钟，马

上放入盛有漂洗液的培育皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净，滤

纸吸干，不耍太干。

定量：

取6支试管，编号，分别用吸管吸取0.4NNaOH4ml；剪

下膜上各蛋白质带及另一空白部位剪一平均大小的薄膜条（空白带

的宽度以最窄的条带为准）。

将各条分别浸于上述试管内（留意管与蛋白带的依次），用力

摇动，使蓝色洗出，约半小时；用分光光度计进行比色，波长

650nm,以空白薄膜条洗出液为空白比照，读取A、1、2、、

球蛋白各管的光密度。

结果计算：

光密度总和T=A+1+2++白蛋白%

=A/T100%1球蛋白%=1/T100%2球蛋白％=

2/T100%球蛋白%=/T100%球蛋白%=/T100%

【附注】电泳缓冲液耍使两侧槽的液面保持水平，以免虹吸现象

影响泳动速度。

每次电泳时应更换电泳槽的正负极，以保持两侧缓冲液离子、

pH一样。

运用一段时间后电泳缓冲液应废弃换新。

关闭电泳仪电源后才能从电泳槽上取醋纤膜，以免电击。

表动物血清蛋白质参考值（g/L）血清蛋

白浓度增高（高蛋白血症）TP增加：

脱水引起，非肯定量升高。

红细胞压积容量（PCV）增高，白蛋白蛋白比值（A/G）正常。

白蛋白增高：

单纯白蛋白升高很少。

球蛋白增加：

-球蛋白（肝球蛋白、2-巨球蛋白、■抗胰蛋白酶等）：

组织损伤或炎症。

-球蛋白（转铁蛋白、-脂蛋白、补体-3及免疫球蛋白）：

活动性肝脏疾病及圆线虫病。

-球蛋白：

慢性炎性、免疫性疾病，淋巴瘤、骨髓瘤、多克隆和肝硬

化等，免疫接种。

血清蛋白浓度降低（低蛋白血症）血浆水份增加，如静注

过多低渗溶液。

白蛋白降低：

白蛋白/蛋白比值变小。

养分不良和消耗增加，饲料蛋白质长期不足或慢性肠道疾病

所引起汲取不良，或因长期患消耗性疾病。

合成障碍：

慢性肝脏疾病、肝脏功能严峻损害。

蛋白质丢失：

大出血，烧伤，肾病综合征。

妊娠期对蛋白质须要增加。

球蛋白降低：

喂初乳不足或未喂初乳；肾上腺皮质激素和其他免疫抑制剂；

免疫缺陷性疾病。

四、血红蛋白测定（沙利氏比色法）原理表面活性剂红细

胞膜血红蛋白溶解高铁血红蛋白高铁氟化钾氧化氟离子棕红

色氟化高铁血红蛋白540nm比色血红蛋白浓度四、血红蛋白测定

（沙利氏比色法）试剂转化液：

氟化钾50mg,高铁氟化钾200mg,无水磷酸二氢钠114mg,

TritonX-1001.0ml,蒸镭水1000ml□

溶解混勾后用滤纸过滤，置棕色瓶中，保存于冷暗处，但勿

使结冰，可保存数月。

该液应透亮、淡黄色，PH7.0-7.4,以蒸储水作空白，在

540nm处比色，吸光度应小于0.001。

若浑浊、变绿则应废弃。

四、血红蛋白测定（沙利氏比色法）操作取血201加5ml

血红蛋白转化液，充分混匀，静置5mino

用波长540nm,光径1cm,转化液或水作空白，测吸光度计

算血红蛋白（g/L）二测定管吸光度（6445844000）251式中：

64458血红蛋白平均分子量，44000血红蛋白摩尔吸光度，

251为稀释倍数。

因品种、年龄和环境血红蛋白有差异，参考值9（T120g/L

四、血红蛋白测定（沙利氏比色法）附注血液用EDTA二钠抗凝,

不行用肝素钠抗凝。

氟化钾为剧毒化学品，在配置和保存过程中应留意平安。

测定废液应加次氯酸钠（35ml/L）混匀放开过夜，使鼠离子

氧化成CO2和N2挥发后，再排入下水道中。

四、血红蛋白测定（沙利氏比色法）临床意义血红蛋白占

红细胞32%〜36%,或干重96%O

在某些类型贫血时（如低色素贫血）红细胞与血红蛋白降低程

度不一样，血红蛋白降低比红细胞明显。

同时测定红细胞数与血红蛋白，对诊断有实际意义。

血红蛋白增多：

如血浆中水分丢失；红细胞增生活跃。

血红蛋白削减：

贫血性疾病；其中养分性贫血见于蛋白质缺乏，铜、铁、钻

等微量元素缺乏，维生素BK维生素B2、维生素B6、维生素

B12、叶酸、烟酸缺乏等。

五、肌红蛋白测定肌红蛋白（Mb）：

横^肌色素成分，分子量170kDo

肌细胞内贮存和运输氧。

肌肉组织损伤时Mb从肌细胞中释放入血，血清Mb上升，大

部分以游离状态存在，小部分与血清蛋白结合；肌红蛋白血症和肌

红蛋白尿。

测定方法：

溶解度试验、比色法、放射免疫法、酶联免疫法、胶乳凝

集试验、荧光免疫法、滴金免疫法等。

五、肌红蛋白测定1、Mb溶解度试验原理Mb分子含血

红素基团，有氧化酶活性，用联苯胺或邻甲苯胺同过氧化氢反应呈

色鉴定，Mb可溶解于80%饱和度的硫酸胺溶液，而Hb则不能。

试剂1%邻甲苯胺甲醇溶液：

难溶解但较稳定。

过氧化氢醋酸溶液：

冰醋酸1+3%过氧化氢2o

硫酸胺（化学纯）五、肌红蛋白测定操作先检尿液有无

血红素存在，簇新尿液4滴+邻甲苯胺液2滴，混合，+过氧

化氢醋酸溶液3滴，有蓝色或蓝绿色。

取过滤后透亮尿液5ml+硫酸胺2.8g,溶解混勾，静置5

min,滤纸过滤。

取滤液重复测试有无血红素色素存在，阳性表示含Mbo

阴性表示色素是Hbo

五、肌红蛋白测定2、反向胶乳凝集法原理Mb与用Mb

单克隆抗体致敏的竣化聚苯乙烯胶乳作用出现凝集者为阳性。

试剂竣化聚苯乙烯粒子；pH8.4,0.Imol/L硼酸-甘氨

酸缓冲液；Mb单克隆抗体；牛血清白蛋白。

五、肌红蛋白测定操作用Mb单克隆抗体致敏竣化聚苯乙

烯胶乳。

取2501硼酸-甘氨酸缓冲液混合，逐滴加设竣化聚苯乙烯

粒子5001,边加边摇动试管混匀，加入Img牛血清白蛋白置

37c水洗30min,用硼酸-甘氨酸缓冲液洗两次后，放4℃冰箱保存。

取待检血清101,用pH8.4硼酸-甘氨酸缓冲液做1：

20倍稀释，取251与等量致敏胶乳在玻片上混合摇动，视

察3min,同时做阳性和阴性比照。

五、肌红蛋白测定结果推断4+：

全部呈粗粒状凝集，边缘有厚凝集圈，中间液体清亮3+：

大部凝集，四周有凝集，中间液体微浑浊。

2+：

中度凝集，颗粒较细，凝集圈不显，液体浑浊。

+:

少量凝集，液体明显浑浊。

•

保持匀称的乳状，与阴性比照相同。

五、肌红蛋白测定附注志向的胶乳颗粒直径0.81m,

0.59m时可延缓凝集反应速度，胶乳最适浓度设。

缓冲液pH8.0时易发生自凝，pHlO.O使反应完全抑制。

加牛血清白蛋白可使胶乳表面的结合部位充分饱和，削减非特

异性凝集。

临床意义主要见于肌肉损伤性疾病，如马麻痹性肌红蛋白

尿症、应激综合征、马地方性肌红蛋白尿症等。

其次节血糖检测（邻甲苯胺法）原理葡萄糖与邻甲苯胺

在强酸溶液中加热，葡萄糖的醛基与邻甲苯胺缩合生成葡萄糖基胺,

其脱水生成蓝色的席夫氏（Schiff）碱，生成的蓝色化合物在630nm

有汲取峰，用比色法可测定得葡萄糖含量0

其次节血糖检测试剂邻甲苯胺：

取940ml冰醋酸，加1.5g硫月尿和60ml邻甲苯胺混合，硫

服完全溶解后置棕色瓶内室温保存，24h后可用。

该试剂腐蚀性强，避开接触皮肤。

12mmol/L苯甲酸:

将1.46g苯甲酸加入900ml蒸储水，加热助溶。

冷却后置于1L容量瓶中，以蒸储水定容至刻度。

葡萄糖标准贮存液(100mmol/L)：

取无水葡萄糖(预先置80℃干燥至恒重干燥器保存)1.802g

溶于80ml上述苯甲酸溶液中，移置100ml容量瓶中，以苯甲酸

溶液定容至刻度。

其次节血糖检测试剂葡萄糖标准应用液(5mmol/L)：

取葡萄糖标准贮存液5.0ml,置于100ml容量瓶中，用苯甲

酸溶液定容至刻度。

其次节血糖检测操作。

单位：

ml其次节血糖检测计算血清葡萄糖(mmol/L)=(ODu/ODs)

5参考值表11-5动物血糖参考值其次节血糖检测临床意义

低血糖：

见于胰岛素分泌增多，肾上腺皮质功能减退、糖原贮存性疾

病，牛酮病，绵羊妊娠毒血症，饥饿，消化汲取不良，肝脏机

能不全，马黄曲霉毒素中毒等。

高血糖：

反刍动物氨中毒、剧痛、运输、胰腺炎等可引起短暂性高糖

血症。

糖尿病、肢端肥大症、肾上腺功能亢进、脑垂体功能亢进等

可引起持续性高糖血症。

一、血清胆固醇测定二、血清甘油三酯测定三、酮体测

定第三节脂肪代谢的检测一、血清胆固醇测定原理异丙醇抽

提、高铁冰醋酸-硫酸显色法。

血清经异丙醇沉淀蛋白质并经氧化铝吸附，胆固醇被抽提，与

浓硫酸及三价铁作用，生成较稳定的紫红色化合物，与同样处理的

标准液比色，求得样品中胆固醇浓度。

试剂异丙醇（AR）氧化铝：

层析用中性氧化铝，用水洗去不易下沉的细颗粒，吸滤干后,

在110C烘箱中活化至少3h,密闭容器保存一、血清胆固醇测定

试剂三氯化铁贮存液：

取三氯化铁0.1g溶于冰醋酸lOOmlo

显色剂：

三氯化铁贮存液与浓硫酸按1：

1体积混合。

5.17mmol/L胆固醇标准液：

取重结晶胆固醇200mg,用异丙醇溶解至100ml,置4℃冰

箱保存。

胆固醇重结晶：

取10g于烧杯中加无水乙醇50ml,70c水浴中加热溶解放

冷置冰箱过夜重结晶，过滤，收集沉淀再溶于50ml热乙醇中，放

冷置冰箱过夜，过滤，收集沉淀再溶于30ml热乙醉中，重夏3

〜4次，最终收集沉淀于100C烘箱中干燥4h,贮于干燥器中备

用。

一、血清胆固醇测定操作取血清（测定管）或胆固醇标准

液（标准管）0.1ml于带塞试管中，向管底吹入异丙醇2.4ml,冲散

血清，使蛋白质沉淀，加塞混匀后放60℃水浴1-2min,加氧化

铝0.4g,加塞于漩涡混合器上混合15s或手摇2min,离心。

取上清液。

取上清液1ml于另二支试管中，空白管中加异丙醇Imlo

各管置60℃预热lmin（试管不离开水浴），分别加入显色

剂3ml,充分混合后留在水浴中15niin。

冷却，以空白管调零，530-550nm波长比色。

一、血清胆固醇测定附注加显色剂时会产热，程度与显

色深浅有关，应留意：

①所用试管口径和厚度一样，试管口径大便于快速摇匀。

②加显色剂时要沿管壁加入，使上下分成两层，然后突然混

合。

③加显色剂必需加一管摇一管，不行成批加完后一起混合，

摇的手法也要一样。

所用试管和比色杯均须干燥。

所用浓硫酸耍求较高，应密闭保存防止吸水。

一、血清胆固醇测定计算血清胆固醇（mmol/L）

=（Odu/Ods）5.17参考值一、血清胆同醉测定I临床意义血清胆

固醇升高：

肝内或肝外胆汁郁积、胆结石（尤其胆固醇结石）、脂肪肝、

糖尿病及肾病综合征笔。

血清胆固醇降低：

严峻贫血、养分不良、感染及甲状腺机能亢进等。

二、血清甘油三酯测定原理用高效微生物脂蛋白脂肪酶

(LPL)使血清中的甘油三酯水解成甘油和脂肪酸，将生成的甘油

用甘油激酶(GK)及三磷酸腺甘(ATP)磷酸化，以磷酸甘油氧化酗(GPO)

氧化3-瞬酸甘油(G-3-P),然后以过氧化氢酶(POD)、4-氨基比林

(4-AAP)与4-氯酚(三者合成PAP)显色，测定所生成的H202,

本法简称GPO-PAP法。

该方法有一步终点法和两步终点法测定，目前常用两步法。

二、血清甘油三酯测定试剂Tris-HCl缓冲液，

150mmol/L,pH7.6,每升中含MgSO4lOmmol,胆酸钠3.5mmol,

ATPl.Ommol,4-氯酚2.5mmol,TritonX-1000.1g酶液T：

Tris缓冲液50ir.l中溶GK500U,GPO3000U,POD1000Uo

酶液II：

Tris缓冲液50irl中溶LPL3000U,4-AAPImmolo

手工法应用试剂I：

酶液I5m1与Tris缓冲液45ml混合。

手工法应用试剂H：

酶液II5ml与Tris缓冲液45ml混合，

二、血清甘油三酯测定试剂用于自动分析时，试剂I、

II的用量随仪器调整，但缓冲液与酶液I和酶液II的最终比例

9:0.5:0.5不变。

参考物（校准液）：

2mmol/L三油酸酯水溶液。

精确称取三油酸酯（纯品）1771ng（可干脆称入100ml容量瓶

中），加TritonX-1005ml,摇动使成乳浊状，置56℃水浴约

lOmin,澄清后加蒸播水90ml,冷却至室温，再加蒸储水至刻度,

混匀。

以2ml分装，4c保存至少稳定2年，勿冰冻。

二、血清甘油三酯测定操作采血前两天不进食含脂肪食

物，样品4℃存放不超过3d0

测定管、校准管和空白管中分别加入血清、校准液及蒸馄水

各101,各加应用试剂I0.5ml,混匀，37c水浴5min,然后

再各加应用试剂HO.5ml,混匀后37℃水浴lOmin,空白管校零,

在波长500nm测吸光度在）。

二、血清甘油三酯测定计算血清甘油三酯（TG）（mmol/L）二

（测定管A/校准管A）校准液TG浓度（mmol/L）参考值：

犬0.43mmol/L,猫0.40mmol/L0

临床意义增高：

原发性高脂血症、肥胖症、糖尿病、脂肪肝、肾病综合征、

犬肝脏疾病、长期饥绒或高脂饮食等。

降低：

甲状腺功能减退、肾上腺功能降低及严峻肝功能不良等。

三、酮体测定酮体：

乙酰乙酸、-羟丁酸（脂质代谢中间产物）和丙酮（剩余物）。

碳水化合物缺乏时酮体产生增多，糖异生作用增加；三段

酸循环中草酰乙酸缺乏抑制脂肪生成，乙酰辅酶A增多。

酮体肾阈较低，在酮血症之前，通常已出现酮尿。

三、酮体测定定性试验：

常用亚硝基铁氧化钠反应。

特异性对乙酰乙酸，但对-羟丁酸不起反应，而-羟丁酸在

酮血症中占主耍成分。

该法简便易行，可用酮粉法或配置的液体试剂测定奶、尿或

血清样品。

酮粉试剂配制：

取硫酸镂100g,无水碳酸钠50g,亚硝基铁氟化钠3g,研

碎混匀备用。

操作方法：

在短试管内加酮粉试剂1g,滴加被检样品，数分钟后呈高锦

酸钾样红色为阳性反应。

三、酮体测定定量试验（微量凯氏蒸佣、水杨醛比色法）：

以氢氧化钢和硫酸锌除蛋白，丙酮首先被蒸储分别，乙酰乙

酸和-羟丁酸经先后加入硫酸和重络酸钾氧化使变成丙酮而蒸馈，

蒸镭液与芳族醛在碱性条件下发生红色反应。

酶试验法比较简便的酮体定量试验，但进口试剂。

临床意义酮血或酮尿表明机体脂肪和能量代谢紊乱。

如奶牛酮病、绵羊妊娠毒血症、母牛肥胖综合征、长期饥饿

等。

一、样品采集二、样品制备三、定量检测第四节微量

元素检测一、样品采集样品：

土壤、水、饲草料和体液、被毛及组织器官等；保证样品

的匀称性和代表性；据探讨目的、要求，选择不同预处理和分析

方法；牧草：

多点采样，离开地表2、3cm,避开土壤污染；土壤：

多点采集植物根部延长到的部位（0~30cm）；组织：

簇新，无离子水冲洗，烘干，研细备用；被毛：

固定部位、不锈钢剪刀采样，洗净；血样：

采集干净容器内，避用橡胶盖，避用防腐剂。

二、样品制备目的：

将样转为相宜分别和测定的物理状况和化学状况。

重要：

灵敏度、精密度和精确度，影响分析结果。

原则：

不加待测成分，不损失，无干扰。

方法：

稀释法干灰化法（高温、低温）湿消化法（常压、高压）

燃烧法水解法微波消解法等二、样品制备稀释法：

适于体液、分泌物测定。

血清和血桨常用。

高温干灰化法：

为破坏样中有机物，温度450~550℃。

对低沸点的元素有损失，损失程度取决于灰化温度和时间。

低温干灰化法：

氧等离子体灰化法，利用高频或超高频激发产生氧等离子体，

在70100℃下氧化生物组织。

常压湿消化法：

加热分解或回流消化。

硝酸-高氯酸，硫酸-过氧化氢等。

试剂用量大，空白值高。

高压湿消化法：

在常压基础上密封加压，加速分解，削减酸用量，防止污染,

可降空白值。

适于易挥发元素分析。

二、样品制备燃烧法：

样品置于常压氧或高压氧容器（氧瓶和氧弹）中燃烧，待测

组分被汲取液汲取定容后测定。

用于测定硫、卤素及微量元素。

水解法：

样品在酸、碱、酶存在下同水作用而分解。

酸水解法，碱水解法和酶水解法。

微波消解法：

利用微波能量快速分解样品。

高压消解和微波快速加热，消解快，试剂消耗少，空白低，避

开挥发。

其他：

萃取、沉淀、过滤、蒸储、离子交换等。

三、定量检测原子汲取光谱法（AAS）电感耦合高频等离

子体原子放射光谱法（ICP/AES）X射线荧光光谱法（XRF）原子

荧光光谱法（AFS）分子荧光光谱分析法（MFS）中子活化处理法