类病毒检测技术培训于德才教学提纲

类病毒检测技术培训于德才

类病毒结构示意图Thestructureofviroid

马铃薯纺锤块茎类病毒热变性过程Heat-denaturedprocessdiagramofPSTVd三、类病毒结构马铃薯纺锤块茎类病毒的五个功能区ThefivefunctionaldomainsofPSTVd马铃薯类病毒中国分离株核苷酸序列序列测定结果

PSTVd致病区的位置和结构。图解表示PSTVd-Intermediate的完整结构，包括左未端区（TL,1-46/315-359），致病区（47-73/286-314），中央保守区（74-120/240-285），可变区（121-148/212-239）和右未端区（TR,149-211）(Keeseandsymons,1985),premelting(PM)区1-3（Steger等，1984）和二级发夹结构1-111。下面为三个自然发生的PSTVd分离株系。水平箭头指出PM1和VM区域（Schnölzer等，1985），“星号”表示中间株系和强、弱系序列差异。此图引自Owensetal(1996)。PSTVd中国分离株与已报道序列在一级结构上的差异

PSTVd强、弱系及中间株系的核苷酸序列差异比较ComparisonwithmildstrainfromChinainnucleotidesequenceoftheisolatesofthemild,intermediateandseverestrainofpotatospindletuberviroid(PSTVd)PSTVd分离株系PSTVdisolates类病毒核酸长度Viroid-nucleotideChainlength同中国弱株系相比核酸差异Differencesfrom“themildstrain”ofChinainsequence变化位置PositionofthechangednuoleotideMild:①PSTVd-WA(未例出)①PSTVd-F(未例出)②PSTVd-India

③PSTVd-WB

359nt358nt359nt

359nt

U→AUCU→GAC→AC→UG→A

309(致病区)309(致病区)255(中央保守区)258(中央保守区)253(中央保守区)④PSTVdKF-6mildtype359ntNoneNoneSevere:④PSTVd-F-SL

⑤PSTVdS17-I-8

359nt

359nt

A→insertionA→deletionU→insertionC→deletionG→AC→AU→deletionCinsertionU→AAUdeletionC→AU→GG→A

48-49（致病区）122(可变区)140-141(可变区)232(可变区)254(中央保守守区)310(致病区）311（致病区）320-321(左未端区)120(中央保守区)309（致病区）310（致病区）312（致病区）319(左未端区)Intermediate:②PSTVd-I-India

359nt

U→AAU→AU→deletion

120(中央保守区)309(致病区)311(致病区)注：①FromHeroldetal.(1992);②FromOwensetal.(1992);③FromSinghetal.(1993);④FromGrossetal.(1981);and⑤FromGora-Sochacka(1997).

四、类病毒鉴定1、指示植物接种鉴定1）鲁特格番茄

2）新莨菪2、电泳1）垂直双向丙烯酰胺电泳（2-D）2）往返丙烯酰胺电泳（R）3、反转录—PCR（RT-PCR）4、核酸斑点杂交（NASH）往返丙烯酰胺电泳（R）检测流程图核酸提取第一项电泳反向电泳固定银染色显色结果判读PSTVd上样量：8μg,1.6μg,0.32μg,64ng,13ng,2.6ng,520pg,104pg最低检出率：13ng双向电泳检测PSTVd

PSTVd检测结果：样品含有PSTVd，箭头所指为类病毒核酸带RT-PCR检测类病毒流程引物设计扩增产物分析（６％ＰＡＧＥ）以cDNＡ为模板ＰＣＲ扩增制备cDNＡ第一链（反转录）样品核酸提取检测结果：PCR反应退火温度分别设定为55℃和57℃，在57℃下特异性好，可用来检测PSTVd434bp328bp12345ＰＳＴＶｄ资料检索、收集、样品采集类病毒病原鉴定:三种方法：（R、2-D、RT-PCR）含PSTVdpGEM-7Z质粒利用HaeIII对重组质粒进行酶切验证鉴定结果：含PSTVd设计引物、对含PSTVd的pGEM-7Z质粒进行PCR扩增利用生物素biotin-11-dUTP代替dUTP制备探针进行核酸斑点杂交反应NBT/BCIP化学颜色反应Flu荧光素发光反应试剂盒组装生产应用核酸斑点杂交（ＮＡＳＨ）检测技术流程探针制备终止反应预杂交封闭孵育信号产生杂交漂洗点样尼龙膜的处理500ng50ng5ng500pg50pg5pg1234

200pg50pg200pg50pg

NASH方法检测PSTVd专化性测试（颜色反应）结果显示：阳性样品有斑点，阴性样品不产生斑点。反应专化性强。

核酸斑点杂交（ＮＡＳＨ）检测反应原理图核酸斑点杂交（NASH）技术的研究探针的制备1、HaeⅢ单酶切含PSTVd单体的pGEM-7Z质粒

123

328bp结果显示：pGEM-7Z重组质粒含有PSTVd单体，且为正向插入2、引物筛选

根据已报导的PSTVd基因序列（Genebank登陆号AY372400）设计两对引物对7Z质粒上的PSTVd单体目的片段进行PCR扩增引物Ⅰ(PrimerⅠ):片段大小为154bpP(c):5‵>CGAAGCCGATGAT<3‵与261-249互补P(H):5‵>GGAATAACG<3‵与124-116同源引物Ⅱ(PrimerⅡ):片段大小为309bpP(c):5‵>TGGAGGACTCGT<3‵与47-37互补P(H):5‵>GGAATAACG<3‵与124-116同源10mMdNTP2μl引物(60pM)2μl模板(P7z-PSTVd单体)2μlDEPCH2O80.5μl10×PCRbuffer10μlTaq酶(Promega公司)2.5μlTotal