第5章-思考题解析

第5章思考题解析试述PCR扩增的原理和步骤。答：PCR技术是体外快速扩增特异DNA序列的一种方法。基本原理：通过模拟体内DNA复制的方式，在体外以DNA为模板，4种脱氧核苷酸为原料，用特异引物为延伸起点，在DNA聚合酶的催化下，通过温度变化控制DNA的变性和复性，完成特定基因的体外复制。步骤：①变性，双链DNA模板在高温下解开成单链；②退火，温度降低后引物与模版的特定序列相结合；③延伸，DNA聚合酶催化新链DNA合成。最终这三步经过多次循环后使两条引物间DNA区段的拷贝数呈指数增加，从而短时间内获得所需的大量的特定基因序列。试比较常规重组载体构建和恒温一步法载体构建的异同点。答：常规重组载体构建过程：①合成目的基因片段两端的引物；②PCR扩增目的基因；③对目的基因和质粒载体进行双酶切（用相同的外切核酸酶）；④T4DNA连接酶将酶切后目的基因和质粒载体连接成一个整体，连接温度为22℃时，1～2h完成连接，4℃或16℃连接时，需要反应8h以上完成连接反应。恒温一步法载体构建：其主要特征是载体与片段的连接不依赖T4DNA连接酶。主要过程：①将载体线性化，通过引物设计在插入片段两端引入线性化载体的末端序列；②PCR扩增插入片段后，其两端具有与线性化载体末端相同的序列；③按一定比例加入插入片段和线性化载体，再加入dNTP，在T5外切核酸酶、DNA聚合酶和TaqDNA连接酶的混合催化下，50℃恒温反应15～30min即可完成连接反应。比较荧光染料SYBRGreenⅠ和TaqMan荧光探针的主要不同点。答：SYBRGreenⅠ荧光探针：1种荧光，波长520nm；加入到PCR反应体系中的荧光染料SYBRGreenⅠ仅能与双链DNA结合，被激发出绿色荧光，其荧光强度反映PCR产物的产量，可以检测PCR反应中获得的全部双链DNA，但是不能区分不同的双链DNA。TaqMan荧光探针：含有短波长和长波长2种荧光。在PCR反应开始前，两种荧光由于荧光共振能量转移作用而检测不到荧光。PCR反应开始后，随着双链DNA变性产生单链DNA，TaqMan探针结合到与之配对的靶DNA序列上，并被具有外切酶活性的TaqDNA聚合酶逐个切除而降解，从而解除荧光淬灭的束缚，短波长的荧光基团在激发光下产生绿色荧光，它的荧光强度反映新合成目的DNA的产量。分析基因组DNA文库和cDNA文库的主要区别。答：基因组DNA文库是把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体结合，导入微生物细胞形成克隆，理论上基因组DNA文库含有一种生物的全部DNA序列。应用：主要用于分离特定的基因片段、分析特定基因结构、研究基因表达调控，还可以用于全基因组物理图谱的构建和全基因组序列测定等。cDNA文库是指以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。应用：筛选目的基因、大规模测序、基因芯片杂交等功能基因组学的研究。cDNA合成时的方向性是如何实现的？答：为保证所获得双链cDNA的方向性，应该在cDNA合成的过程中，选用活性较高的反转录酶及甲基化dCTP，再在cDNA两端加上不同内切酶所识别的接头序列，即可保证其方向性。说说从总RNA的提取到分离出非编码RNA的主要过程。答：总RNA的提取常用异硫氰酸胍-苯酚抽提法。提取过程：首先用液氮研磨材料，匀浆，加入Trizol试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成分。然后加入氯仿抽提，离心，分离水相和有机相，收集含有RNA的水相，通过异丙醇沉淀，获得比较纯的总RNA，用于下一步mRNA的纯化。检测RNA质量后，依据非编码RNA的大小和形态结构，可通过以下几种方式分离：对于较短的，如miRNA、siRNA、piRNA等小于50nt的非编码RNA的分离。提取总RNA后，用聚丙烯酰胺电泳分离出小于50nt的RNA，割胶回收并用乙醇将RNA沉淀出来，一般加入糖原和乙酸钠做助沉剂，也可用专一性吸附小片段RNA的硅胶膜柱子纯化。也可以从总RNA样品中去除rRNA和tRNA，再分离其他非编码RNA。该方法首先合成rRNA和tRNA特异性生物素标记的寡核苷酸探针，这些探针与各种rRNA及tRNA杂交，杂合链因为带有生物素标记而被偶联了链霉亲和素的磁珠高效捕获，链霉亲和素与生物素之间稳定的非共价结合使得生物素标记的双链分子紧密结合在磁珠上。用磁铁将磁珠从样品中分离，就排除了这两种组成型RNA的干扰。cirRNA中具有闭合环状的结构，利用它的这一特殊结构可单独将其分离出来。将rRNA和tRNA从总RNA中除去后，使用具有3′端核糖核酸外切酶活性的RNaseR专一性降解单链线性RNA分子，即可将mRNA和其他线性非编码RNA除去，留下环状的RNA分子。已知一个cDNA3′端的部分序列，请设计实验流程得到该基因的全长cDNA。答：①提取RNA，以RNA为模板，oligo（dT）做引物，在反转录酶催化下形成cDNA。由末端转移酶在已合成的cDNA链的3′端连续加入dCTP，形成oligo（dC）尾巴；②5′RACE，以连有oligo（dC）的锚定引物AP和基因片段内部特异引物进行巢式PCR扩增，得到目的基因5′端片段；将获得的5′端扩增片段通过T4DNA连接法或者恒温一步法连接到克隆载体；④将重组克隆载体转入大肠杆菌感受态细胞，经过PCR筛选鉴定后进行测序，获得全长序列。简述Gateway大规模克隆技术原理及基本操作流程。答：原理：利用λ噬菌体进行位点特异性DNA片段重组，实现不需要传统的酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转移。基本操作流程：主要包括TOPO反应和LR反应两步。TOPO反应将目的基因PCR产物连入Entry载体，该载体上的CCCTT能被拓扑异构酶所识别，切开后通过该酶274位上的酪氨酸与切口处的磷酸基团形成共价键，被偶联在载体上。加入PCR产物后，载体上3′突出端GTGG与PCR产物的互补性末端接头序列CACC配对，使PCR产物以正确方向连入Entry载体。LR反应将目的片段从Entry载体中重组入表达载体。Entry载体上基因两端具有attL1和attL2位点，目的载体上含有attR1和attR2位点，在重组蛋白的作用下发生定向重组，形成新的位点attB1和attB2，最终将目的基因转移到表达载体中。说说基因图位克隆法的原理和过程。答：基因的图位克隆法是分离未知性状目的基因的一种方法，从理论上说，所有具有某种表型的基因都可以通过该方法克隆得到。其原理和过程如下：首先，通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。其次，通过对许多不同生态型个体的大量限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的分子标记。第三，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段分离并克隆出来。第四，根据基因功能互补原理鉴定目的基因。比较基因组与蛋白质组的主要差别。答：基因组是确定的，组成某个体的所有细胞共同享有固定的基因组，而各个基因的表达调控及表达程度却会根据时间、空间和环境条件发生显著的变化，所以，不同器官、组织或细胞拥有不同的蛋白质组，同一器官、组织或细胞在不同时空环境条件下也有不同的蛋白质组。说出纳升液相色谱（nano-liquidchromatography，Nano-LC）与质谱联用技术的基本原理。答：纳升液相色谱（nano-liquidchromatography，Nano-LC）与质谱联用技术结合了纳升液相色谱的分离能力和质谱的分析能力，其基本原理如下：纳升液相色谱中使用非极性的反向介质为固定相，极性有机溶剂为流动相，根据肽段的极性差异进行分离，使不同的肽段在不同的时间点进入离子源。不同极性的肽段在不同时间进入质谱