第8章 根系表型分析技术

根系表型分析技术HUAZHONGAGRICULTURALUNIVERSITY1目录CONTENTS第一节田间根系表型研究方法第二节根系二维表型检测方法第三节根系三维表型可视化检测方法第四节根系性状分析软件第五节思考与讨论2一、田间根系表型研究方法挖掘法微根管法探地雷达法植物根系在地下生长网络结构的复杂性，破坏性挖掘会破坏根系的原位性和完整性，获取的根系性状有限，而且测量结果充满了不确定性和误差。如土芯取样法,其所用金属圆管可以安装到拖拉机上，从而提高根系挖掘的效率，增加表型检测的通量，但是高效率必然会牺牲提取精度。

随着光学成像技术的发展，破坏性挖掘出来的植株根系可以通过计算机视觉的方法快速获取人工测量难以获取的根系信息，人们将使用计算机视觉自动化提取挖掘出来的根系性状的方法称之为“Shovelomics”(Trachsel,Kaeppler,Brown,&Lynch,2011)，译为基于铲子挖掘的组学。图8-1挖掘法和计算机视觉获取根系信息34一、田间根系表型研究方法挖掘法微根管法探地雷达法微根管法适用于观测根系的动态生长，在作物种下去前将一根透明丙烯酸圆管斜向下插入土中，在植株生长的过程中定期插入彩色微型相机观测附着在圆管上的根系，这样可以观测不同深度根系生长发育状态。这种方法具有一定的局限性，其成像模式限制了对根系观测的信息量，附着在圆管上的细根只是植物根系的很小一部分，只能获取少数几个性状。想要获取更多的表型信息需要增加微根管的数量，一方面增加了设备成本，另一方面插入土壤中的微根管会破坏根系的自然结构，影响根系的生长路径，有研究表明，根管附近的根系会过渡繁殖。该方法常用于研究细根生长速率、根系降解、以及根系寿命等方向，是一种能够长期对根系进行观测的方法。5一、田间根系表型研究方法挖掘法微根管法探地雷达法图8-2微根管法和探地雷达法（a）微根管示意图；（b）探地雷达原理图探地雷达是一种原位和无损的根系检测技术。探地雷达向地下发射电磁波，通过探测地下反射波信号的波型和延时来预测地下物体的成分和深度。一般认为，植物根系的含水率高于土壤的含水率，两者导电率不同造成吸收反射的电磁波存在差异，可以从接受的电磁波信号中识别根系信息。探地雷达的性能取决于电磁波频率及雷达分辨率。想要识别小的地下物体需要更高的电磁波频率和雷达像素值，而且高频率电磁波会导致可探测深度降低，这就造成了探地雷达的分辨率存在一定限制，一般用于树木和木本植物的粗根系探测，少数有用高频雷达探测植物浅层细根的报导。二、根系二维表型检测方法

纸培法水培根管法根盒法(根窗法)6发芽纸具有很好的吸水性和韧度，底端浸泡于营养液中使得整个纸张保持湿润。植物根系会顺着发芽纸向下生长，呈现二维的根系形态，方便使用相机等设备进行图像采集。用两块透明有机玻璃将发芽纸夹住，植株根系在发芽纸与有机玻璃之间生长，固定发芽纸的同时便于操作。具有成本低、占用空间小、操作简单和可直接观测的特点，在实现高通量和自动化根系表型检测方面有很好的前景。纸培法是一种基于发芽纸的二维根系表型研究方法，近年来成为一种低成本的植物RSA的研究手段。图8-3基于纸培法的GrowScreen根系表型平台;Gioia,T.,Galinski,A.,Lenz,H.,Muller,C.,Lentz,J.,Heinz,K.,etal.,(2017).二、根系二维表型检测方法

纸培法水培根管法根盒法(根窗法)74PMI所使用的根管为外部透明有机玻璃内部不锈钢的同心管，两者中间填有基质，基质外侧为孔径18um蓝色渗透膜。植株在渗透膜与有机玻璃之间生长，基质中营养物质、水、根代谢物和微生物可以通过渗透膜接触根系，保证根系生长。使用线阵列相机对旋转的根管进行扫描获取二维根系图像，该平台可搭载1200个根管，每个根管可种植6株植物，具有全自动浇水、根管运输和地上地下表型信息采集等功能。法国农业科学院开发了一套基于水培根管的植物与微生物互作根系表型平台（4PMI）图8-4基于水培根管的植物与微生物互作表型平台（4PMI）;Jeudy,C.,Adrian,M.,Baussard,C.,Bernard,C.,Bernaud,E.,Bourion,V.,etal.(2016).二、根系二维表型检测方法

纸培法水培根管法根盒法(根窗法)8图8-5基于根盒法的表型检测系统GROWSCREEN-Rhizo以及获取的拟南芥和大麦根系的二维图片（Nagel

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al.,

2012）根盒法（根窗法）是一种能够展现土壤条件下的根系生长状态的方法，根据植株根系生长过程中存在向地性的特点，在植株下方倾斜摆放透明玻璃，根系会贴着玻璃平面生长。根窗法：将玻璃埋置在野外的土壤中，研究人员在地窖、隧道或者沟渠中透过玻璃窗口观测植株根系，在观测树木等大型植物RSA时有着很好的应用。根盒法：将植株种到一个倾斜的方盒中，使得根系紧贴盒子下部玻璃壁生长，从玻璃平面中获取根系表型信息，适用于观测小型植物RSA。根盒法在评估植物根系生长动态方面被证明是有效的，是在实验室中完成大批量基于土壤的根系表型研究的最优选择。三、根系三维表型可视化检测方法特点是在取根时可以最大限度的减少根的损失和破坏，根系在网格中呈现原有的三维结构是一种破坏性的三维表型研究方法，只能获取根系最终结构特征，不适合连续观测。可以将根箱更换为钉板进行二维的根系构型研究9根箱法气培法水培法凝胶培养透明土壤穿透射线成像法三、根系三维表型可视化检测方法气培法又称气雾栽培法，是一种结合植物栽培、植物营养学和农业工程学的综合性根系研究方法。10根箱法气培法水培法凝胶培养透明土壤穿透射线成像法植物根系悬挂生长于黑暗密闭容器当中，营养液通过水泵加压，经管道输送到各个生长容器，由雾化喷头将雾化的营养液喷洒在空气当中。由于雾状的营养液能够实现水肥气三位一体供给植物根系，解决了根系对于水分、营养和空气的吸收互相冲突的问题，使得植物长时间处在最佳生长环境当中，对植物生长有着巨大促进作用。气体的根系生长介质一方面为根系提供生长空间，同时也方便对根系直接接触和观测，所以气培法常常用来进行植物根系病害研究。基本原理①由于容器和液体通量的限制，气培法适合蔬菜或花卉苗期根系的研究，无法进行植物全生育期的根系研究。②气培法对容器密封、设备安装和自动化可靠性有着较高的要求，大大提升了设备成本和图像采集难度。③营养液运输和植物种植过程中容易带有真菌、细菌和病毒等病原体，这些病原体会随着营养液管道在植物之间迅速传播，需要经常进行消毒处理，对精细化栽培管理要求很高。不足三、根系三维表型可视化检测方法11根箱法气培法水培法凝胶培养透明土壤穿透射线成像法水培又称营养液栽培，是让植物根系直接生长在营养液中的一种栽培技术。由于水培直接给与植株根系所需要的空气、水分和养分，与土壤环境相比明显缩短植株生长周期。（a）气培法的原理和实物图；（b）使用定根架的水培根系构型研究系统；（c）基于凝胶培养的根系三维检测平台局限性水溶液中不存在土壤中的机械阻力，容易使根系生长过快，在短时间内就将培养容器占满；由于根系不存在缺水的问题，会在一定程度上抑制根毛和分枝根的发育，对这两者的观测存在不确定性。三、根系三维表型可视化检测方法12根箱法气培法水培法凝胶培养透明土壤穿透射线成像法在凝胶培养基中进行植株育苗是一种研究根系三维结构的有效手段，这避免了气培和水培RSA不确定的问题，固定了根系的三维结构，并允许重复、非破坏性、快速和经济地观察植物根系。凝胶培养过程中注意问题①凝胶容易受到污染，造成微生物群落失衡并且养分大量流失；②凝胶提供的养分和水分有限，长时间种植造成脱水或者养分枯竭，这让凝胶只适合进行作物苗期根系研究；③凝胶虽然其自身具有一定的机械阻力使得比起水培和气培更能反映植株自然状态，但是在物理性质与真实土壤也存在较大差异，在运用凝胶研究根系动力学需要格外注意。三、根系三维表型可视化检测方法13根箱法气培法水培法凝胶培养透明土壤穿透射线成像法英国詹姆斯·赫顿研究所发明了一种原料为Nafion的透明土壤(Downieetal.,2012)，这种透明材料的物理化学性质具有很高的可塑性，能够人工控制使其与土壤有着相似的固体颗粒体系和空隙网格体系，同时该材料与水具有相似的折射率，通过匹配Nafion和营养液的折射率使得固体的边界消失，土壤就变得透明，根系在其中保证三维结构的同时也能够对异质、复杂的接触刺激做出反应，复制土壤中发生的机械过程。这种透明土壤配合荧光标记可以获得根系和根际微生物三维图像，用于生物活性研究。Nafion的成本极高（1000美元/kg），不适合用于高通量根系表型研究。三、根系三维表型可视化检测方法14根箱法气培法水培法凝胶培养透明土壤穿透射线成像法RSA检测工具正电子发射型计算机断层显像（PET）磁共振成像(MRI)X射线计算机断层扫描(CT)在生物体注入半衰期短的放射性核素，放射性核素衰变时会产生中子，这些产生的中子会在极短的距离中与电子发生湮灭产生光子，用高精度相机获取光子信息从而对生物体内部进行影像重构。通过核磁共振信号来实现成像，在对静磁场中的物体施加射频脉冲时，被测对象的氢质子会产生磁共振现象，当停止施加射频脉冲，氢质子在退出磁共振的过程中，会释放一定的能量产生射电信号，传感器感应不同位置的射电信号得到运动中原子的空间分布，从而重构物体内部影像。用X射线束对不透明被测物进行扫描，发生器发射的X射线穿透物体后会降低辐射强度，辐射的衰减程度取决于被测物体的材质，由探测器接收透过该物体的X射线，转变为数字信号并由计算机生成CT图像。三、根系三维表型可视化检测方法15根箱法气培法水培法凝胶培养透明土壤穿透射线成像法PET和MRI的成像机理是根据生物体内化学元素的分布来进行成像的，所以这两种方法除了用于在RSA的研究外可以在根系病理、内部结构以及水分或者代谢物分布等方面发挥作用。德国的尤利希研究中心生物地理研究所将PET和MRI相结合研究实现对玉米的根系生长以及碳分配的监视(Jahnkeetal.,2009)，MRI获取根系影像，PET探测碳分配。日本国家农业和食品研究组织作物科学研究所开发了高通量的水稻根系三维可视化方法RSAvis3D(Teramotoetal.,2020)，一方面优化了植物生长和CT扫描条件，减少了操作时间；另一方面通过调整土壤类型、土壤颗粒大小、扫描条件或根检测算法将可检测盆栽尺寸提高到20cm。（a）将PET和MRI相结合用于玉米根系三维重建以及碳分配研究；（b）高通量水稻根系表型分析方法RSAvis3D四、根系微观结构表型分析软件基于2D成像的分析软件基于3D成像的分析软件16通过荧光标记法对根的细胞壁进行标记，便于提取结构通过两级分水岭的分割方法来分割根的细胞壁，可以通过人工干预的方法调整分割效果使用蛇形网络的方法实现了细胞网络的自动追踪，识别出分割图像的轮廓线以及多细胞之间的连接交点，从而实现对整个根细胞壁结构的定义与分析软件用于对根横截面中的解剖特征进行自动图像分析使用像素阈值将横截面与其背景分开并将其划分为不同的组织区域，面积测量和物体计数在不同的感兴趣区域内进行对每张图像可以计算20多个根系横截面关键性状，包括横总横截面面积、横切面细胞壁面积、通气组织陷窝面积、总中柱面积、中柱面积、细胞壁、木质部导管和侧根(如果存在)CellSeTRootScan图8-8CellSeT软件分析(Sethuraman等，2011)：(a)拟南芥的根末端图像；(b)用绿色荧光蛋白对跟组织进行标记；(c)优化分割的细胞壁；(d)识别根细胞壁结构图8-9RootScan软件分析（Burton

etal.,

2012）四、根系微观结构表型分析软件基于2D成像的分析软件基于3D成像的分析软件17图8-10iRoCS软件性状部分展示(Schmidtetal.,2014)由德国弗莱堡大学(Schmidtetal.,2014)使用共聚焦激光扫描显微镜对染色的根尖进行成像，并堆叠为3D图像，使用其开发的软件“iRoCS”实现在一个健全和直观的背景下对根种群进行定量比较研究。可观测三维可视化的在体正投影视图自动检测和注释具有几个有意义的属性的细胞和细胞核，如位置、半径、组织、细胞个数、细胞周期状态、体积等并且任何操作步骤都可以进行人工修正并随时更新改进模型可检索和定位关键事件，如细胞分裂四、基于RSA的根系表型软件基于2D成像的根系表型分析基于3D成像的根系表型分析从2D和3D的角度探究根尖以及根系显微结构的性状，可以精细地探究根系在特定部位的特征与发育过程，开发的软件更多的是对根尖细胞的识别以及分类，来计算相关的数量、体积、大小以及基于时间序列的变化过程。该工作中使用的设备成本相对较高，软件的开发更有针对性。相比于从细微的角度分析根的局部表型，从2D或是3D的角度分析根系的全局特征可以获取根系的整体结构、分布以及发育过程，这个可能是国内外学者做得相对较多且更为成熟的一个方面，其针对不同类型的根系表型采集设备所采集的数据开发的根系性状提取软件也相对较多。18WinRHIZO主要针对水洗过的根系以及拟南芥幼苗进行形态学、拓扑结构、结构和颜色等自动分析。它是一个全自动的图像分析系统，包括一个软件程序和图像采集组件。图8.11（a）WinRHIZO软件界面（b）WinRHIZOTRON软件界面19如果是原位的根系或是2D土培的根系，该软件的计算精度就会大打折扣基于2D成像的根系表型分析基于3D成像的根系表型分析四、基于RSA的根系表型软件RegentInstruments公司另开发一款半自动的根系性状提取软件WinRHIZOTRON，可以通过鼠标或是画笔进行辅助点击进行根系的跟踪以提取根系的性状。20不同植物的根系以及根系图像的多样性使得自动化的精度难以保证，事实证明使用商业软件对密集根系进行自动分析容易出错。因此许多学者会去选择开发一款适用于自己的根系图像采集设备的针对性处理软件，不拘泥于商业软件所提出的性状，也可以针对性的提取特定的关键性状，做到具体问题具体分析。例如由法国农科院开发的DART软件，侧重于对根系的拓扑结构进行评估，实验数据使用水培的根系图像进行分析。该软件是一款手动的软件，依赖于手动测量，所以它本身不会产生错误，可以做到绝对精准。该软件的缺陷就是针对后期复杂根系的耗时长，无法进行大批量的标注和性状提取。图8.12DART软件界面(LeBotetal.,2010)基于2D成像的根系表型分析基于3D成像的根系表型分析四、基于RSA的根系表型软件EZ-Root-VIS(Shahzadetal.,2018)半自动化设计软件兼容精度与速度，可以实现人工精准控制、计算机辅助提速，对关键步骤进行人工干预，如分割根系的阈值选择，识别出根的人为分类等可以大大提高根系性状提取的精度。EZ-Rhizo(Armengaudetal.,2009)根系性状提取软件。该软件将根系处理的流程做成控件可供用户进行点击操作，包括二值化、去噪、骨架化等。用户可以定义根系的起始点以使根系与植株部分分开，并且可以人为删除图片中的非根系区域保证分割出完美的根系，再通过点击确定各个根的位置即可进行性状的自动计算。从而计算出主根的长度，侧根的长度角度以及数量等性状。EZ-Rhizo(Armengaudetal.,2009)根系性状提取软件根据EZ-Rhizo所提取的性状对拟南芥的根型进行可视化重建，针对不同处理以及不同品种，如图可以分析并展示出根型的特征。21基于2D成像的根系表型分析基于3D成像的根系表型分析四、基于RSA的根系表型软件22图8.13EZ-Rhizo软件软件界面以及EZ-Root-VIS所定义的根型展示(Armengaudetal.,2009;Shahzadetal.,2018)基于2D成像的根系表型分析基于3D成像的根系表型分析四、基于RSA的根系表型软件法国农业发展研究中心（CIRID）开发的GT-RootS(Borianne,Subsol,Fallavier,Dardou,&Audebert,2018)该软件提出了一种房屋形状的多边形来估计密集根系的全局形式，可以根据房屋的形状对根系进行分类并提取相关特征，如拟合出房屋形状多边形的高度，相关的角度，左右对称的偏移量等等。相类似使用可视化建模的方法来定义根型特征的软件还有美国纽约大学基因组学和系统生物学中心所开发的RootScape(Ristovaetal.,2013)。为如何去定义根型提供了许多解决方案。23图8.14GT-RootS所定义的根型展示(Borianneetal.,2018)基于2D成像的根系表型分析基于3D成像的根系表型分析四、基于RSA的根系表型软件saRIA软件界面(Wangetal.,2019)saRIA(Narisettietal.,2019)基于自适应图像增强、可调节阈值和滤波以及可选的手动校正功能可以半自动分割出土壤中的根区域，并且获取相关的性状包括总根长、面积、生物量分布以及根的几何形状。24基于2D成像的根系表型分析基于3D成像的根系表型分析四、基于RSA的根系表型软件具体步骤1.图像增强，通过图像预处理的手段增强图像中根系区域与背景的对比度，从而为下一步分割根系做好准备，针对不同环境、实验条件下获取的根系图像，图像增强的方法也不尽相同，半自动软件可以更好地人为干预确定最好的增强方法。2.图像分割，根系的图像分割是最关键也是最难的一步，分割的好坏直接影响根系性状的准确性，绝大部分软件的适用图像均为透明介质下的图像，难度会大大降低，但反观土壤介质下的根系图像，分割难度巨大，如何去又快又好分割土壤介质下的根系，这个问题依然在不断深入研究和优化。3.图像理解，即计算性状，这是所有根系性状分析软件的最后一步，只要有分割完整的根系二值图像，即可实现此目的，透明介质下的根系图像呈现出了所有根系，所有该图像计算出的性状相比于土壤介质下的图像会更多更全面，但土壤介质下的根系图像更能反映根系在田间的实际情况，如何去拓展理解土壤介质下的根系图像也是一个需要继续研究的问题。由以上内容可见2D根系图像性状的提取方法主要是基于特别开发的图像处理算法25基于2D成像的根系表型分析基于3D成像的根系表型分析四、基于RSA的根系表型软件26基于2D成像的根系表型分析基于3D成像的根系表型分析四、基于RSA的根系表型软件3D的优势在哪？2D根系图像只能看到根系的直面表现，信息是不全面的，3D是根系性状提取的最终目标，是反映田间根系最直观最真实的途径，但同时也难度巨大。主要的成像手段为透明介质下的多视角RGB图像的三维重构以及基于透射图像的三维重构，维度的增加使得根系性状分析软件的开发难度与成本也大大增加。相对于2D，可以计算整个根系系统的总根长以及直接得到其生物量的