（正式版）T∕SDYY 265-2026 五叶草莓脱毒组培快繁技术规程

ICS65.020.20CCSB05SDYYCodeofpracticefortissuecultureandrapidpropagationforvirus-free‘FragariapentaphyllaLosinsk.’IT/SDYY265—2026本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东园艺学会提出并归口。本文件起草单位：青岛农业大学、尚好科技有限公司、山东省农业科学院、青岛市农业技术推广中心、青岛市农业科学研究院、成县连丰农产品有限责任公司、青岛华垦进出口有限公司、北京大学现代农业研究院。本文件主要起草人：郑晓东、王彩虹、郁东兴、王俊峰、刘爱娜、李少旋、于连泽、鲍雯青、田义轲、赵强、孙志娟、王婵玉、刘萍、张庶、陈立勇、张蕊芬、周军会、梁咏琪、张瑶、孙泽春。1T/SDYY265—2026五叶草莓脱毒组培快繁技术规程本文件界定了五叶草莓组培快繁的术语与定义，规定了外植体构建、初代培养、继代培养、生根培养、病毒检测等技术要求。本文件适用于五叶草莓组培苗繁育。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB8599-2023大型压力蒸汽灭菌器技术要求DB13/T5110-2019植物组织培养室组建及操作技术规程3术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3.1五叶草莓FragariapentaphyllaLosinsk蔷薇科草莓属，二倍体植物。叶片呈羽状五小叶，质地较厚，小叶片倒卵形或椭圆形。聚伞花序，白色花瓣，果实呈白色或红色卵圆形，平均单果重为0.8g~1.5g，表面密布棕红色斑点，其种子均凹于果面。3.2脱毒Viruselimination利用组织培养，去除感染病毒的草莓植株体内所携带的病毒，从而获得无病毒种苗的过程。3.3外植体Explant植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织片段。4外植体构建4.1外植体选取选取健壮无病虫害的草莓植株，剪取当年生匍匐茎。以4月、5月、10月、11月晴天上午取材为宜。4.2外植体预处理剪取匍匐茎顶端2cm～3cm，去除叶片和叶柄，用自来水流水冲洗1h，沥干备用。4.3外植体消毒4.3.1前期准备用75%酒精擦拭超净工作台台面，清除灰尘和杂物，紫外灯照射灭菌30min～60min，之后通风10min。镊子、刀片、三角瓶等工具高温高压灭菌锅121℃灭菌25min，冷却后备用。4.3.2快速灭菌2T/SDYY265—2026在超净工作台中将预处理后的匍匐茎放入无菌三角瓶，倒入75%乙醇，浸泡30s，期间轻轻摇晃三角瓶。然后倒出乙醇，立即用无菌水冲洗外植体3次，每次1min～2min。4.3.3深层灭菌在三角瓶中倒入适量有效氯含量为1%的NaClO溶液，溶液应没过外植体，浸泡5min～6min，期间轻轻摇晃三角瓶。然后倒出消毒剂，用无菌水冲洗外植体5次，每次2min～3min，期间轻轻摇晃三角瓶，减少消毒剂残留。5初代培养5.1激素的母液配制将所需的6-苄氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）、吲哚丁酸（Indole-3-butyricAcid，IBA）用1mol/LNaOH溶解，再用蒸馏水稀释后分别配制成0.1mg/mL的母液，装入棕色广口瓶中，置于4℃冰箱保存。5.2初代培养基制备按所需容量的80%加蒸馏水，随后加入Murashige&Skoog培养基（M519干粉）、3%蔗糖，稍加热搅拌至完全溶解。溶解后加入0.5mg/L6-BA和0.1mg/LIBA，用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节pH至5.8～6.0。随后加入0.7%琼脂并充分搅拌，高温高压灭菌锅121℃灭菌25min后分装备用，灭菌锅使用符合GB8599-2023要求。5.3茎尖接种在解剖镜下，用镊子逐层剥去小叶，直至露出半球形的生长点，用刀片切取0.2mm～0.5mm茎尖，生长点朝上接种在初代培养基上，一瓶接种3个～4个生长点为宜。5.4接种后管理接种后，将培养瓶置于培养室培养，温度20℃~23℃,光照强度2000lx，日均光照时长12h/d，培养室环境符合DB13/T5110-2019要求。6继代培养6.1继代芽体选择从初代接种日起算，培养30d～40d后，茎尖分化出不定芽，形成2cm～3cm高的丛生芽时可进行继代增殖。6.2继代培养基制备按所需容量的80%加蒸馏水，随后加入M519干粉、3%蔗糖，稍加热搅拌至完全溶解。溶解后加入6-BA母液至终浓度0.5mg/L和IBA母液至终浓度0.03mg/L，用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节pH至5.8～6.0。随后加入0.7%琼脂并充分搅拌，高温高压灭菌锅121℃灭菌25min后分装备用。6.3继代苗接种用无菌手术刀将单株苗从基部切下，去除愈伤，保证切口平整，避免撕裂，并将单株苗转接至继代培养基中。需注意的是，继代次数不宜超过7次，总培养时长不超过1年，以防止组培苗发生变异。6.4接种后管理接种后将组培苗置于光照强度2000lx、日均光照时长12h、温度24℃~26℃、湿度60%～70%的培养室中培养。7生根培养T/SDYY265—20267.1生根培养基制备按所需容量的80%加蒸馏水，随后加入M519干粉、3%蔗糖，稍加热搅拌至完全溶解。溶解后加入0.3mg/LIBA，用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节pH至5.8～6.0。完全溶解后加入0.7%琼脂并充分搅拌，高温高压灭菌锅121℃灭菌25min后分装备用。7.2生根苗的选取与处理从继代培养苗中，挑选健壮、无畸形、高度2.5cm～3cm、带2片～3片展叶的单株苗，避免选用弱小苗、黄化苗和玻璃化苗。用无菌手术刀将单株苗从基部切下，保证切口平整，避免撕裂茎秆，若基部带有愈伤组织，需切除多余愈伤。7.3接种后管理接种后将组培苗置于光照强度3000lx、日均光照时长14h、温度24℃~26℃、湿度60%～70%的组培室中培养。从接种日起算，当生根至第35d～45d时，根系健壮、有分支，根数3条以上时，苗高2.5cm~3cm、带2片～3片展叶时可进行驯化，驯化前需提前5d～7d开盖炼苗，逐步降低湿度，提高移栽成活8病毒检测8.1检测方法在组培苗生根培养驯化前进行病毒检测，每批次组培苗随机抽取5%～10%的样本，采用RT-PCR（逆转录—聚合酶链式反应）检测。8.2检测步骤8.2.1RNA提取在超净工作台上切取五叶草莓组培苗叶片0.1g～0.2g，放入无菌无酶的2ml离心管，并放入1个钢珠做好相应标记，迅速置于液氮中备用。将样品放入组织研磨机中，研磨频率70Hz，研磨时间90s。按照试剂盒步骤（山东思科捷生物技术有限公司，新型植物RNA快速提取试剂盒，货号：AC0305提取总RNA。8.2.2反转录按照试剂盒步骤（山东思科捷生物技术有限公司，SPARKscriptⅡRTPlusKit，货号：AC0304得到cDNA模板，置于-20℃暂存备用。8.2.3PCR检测用primer5.0软件设计引物序列（参见附录A在PCR管中依次加入3µLddH2O、0.5µLPrimerF、0.5µLPrimerR、3µL2×Mix、1µLcDNA并离心混匀，放入PCR仪中，扩增条件设置为94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共3