田鼠巴贝西虫截短型分泌抗原1：原核表达、双抗原夹心ELISA方法构建及应用探究

田鼠巴贝西虫截短型分泌抗原1：原核表达、双抗原夹心ELISA方法构建及应用探究一、引言1.1研究背景与意义巴贝虫病（babesiosis）是一种由巴贝虫属（Babesia）的血液原虫寄生于人或其他哺乳动物红细胞内所引发的人兽共患寄生虫病，主要通过硬蜱叮咬传播，也可经输血、母婴垂直传播。目前已从野生动物和家畜中分离鉴定出一百多种巴贝虫虫种，其中7种可寄生于人体红细胞导致巴贝虫病，田鼠巴贝虫（Babesiamicroti）是最为常见的病原体。人巴贝虫病的临床表现严重程度差异显著，健康人群大多呈隐性感染或仅有一过性发热等类似感冒症状，而免疫缺陷病人，如脾切除者、HIV患者、老人或儿童等，病情则可能较为严重，甚至威胁生命。在我国，巴贝虫自然疫源地广泛分布，多个省市的蜱媒与保虫宿主体内都存在巴贝虫感染情况。在南方重点调查省市，蜱媒与野栖鼠类中田鼠巴贝虫的感染率分别达3.22％和3.25％，且已有感染人的病例报道。由于巴贝虫病是一种慢性自限性寄生虫病，感染后无症状的极低虫血症会持续很长时间，加上当前检测手段存在局限性，疾病筛查中极易出现误诊或漏诊，进而导致血制品污染，引发输血传播。据美国1979-2009年统计，约有162例巴贝虫病例与输血相关，其中159例为田鼠巴贝虫感染，美国于2011年1月将巴贝虫病列入国家法定传染病，可见巴贝虫已成为当前输血传播风险最高的病原体。田鼠巴贝虫病的诊断技术主要涵盖病原学镜检、核酸分子检测和血清学检测。病原学镜检作为诊断金标准，灵敏度较低，容易漏诊；血清学抗体检测技术，如间接免疫荧光抗体试验（IFA）、免疫印迹试验（IBT）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等，存在难以区分现症感染和既往感染，以及巴贝虫虫种间和与疟原虫交叉反应的问题；核酸分子检测，尤其是以田鼠巴贝虫18SrRNA序列为靶标的巢式PCR技术虽常用，但存在扩增时间长、易污染、假阳性率高等缺点。田鼠巴贝西虫分泌抗原1（Babesiamicrotisecretedantigen1，BmSA1）是目前文献报道中诊断效果较好的抗原之一，然而其全长蛋白表达量少且不易纯化。本研究聚焦于田鼠巴贝西虫截短型分泌抗原1（tBmSA1），通过原核表达获得高纯度的重组蛋白，并建立双抗原夹心ELISA方法。原核表达具有操作简便、成本低、表达量高等优势，能够解决BmSA1全长蛋白表达和纯化的难题。双抗原夹心ELISA方法具有特异性强、灵敏度高、可定量检测等特点，有望实现对田鼠巴贝虫病的快速、准确诊断，有效区分现症感染和既往感染，提高检测的准确性和可靠性。这对于巴贝虫病的早期诊断、疫情监测以及防控措施的制定具有重要意义，能够为保障人类健康和公共卫生安全提供有力支持。1.2国内外研究现状田鼠巴贝虫作为巴贝虫病的主要病原体，在国内外都受到了广泛关注。国外对田鼠巴贝虫的研究起步较早，在其生物学特性、致病机制、传播途径等方面取得了丰硕成果。美国作为田鼠巴贝虫病的高发地区，对其流行病学的研究较为深入，通过长期监测，详细掌握了田鼠巴贝虫在不同地区的感染率、宿主分布以及传播媒介的特点。欧洲一些国家也针对田鼠巴贝虫开展了大量研究，重点关注其对免疫缺陷人群的致病情况，发现脾切除者、HIV患者感染田鼠巴贝虫后，病情往往较为严重，会出现高热、严重贫血、肾衰竭等症状，甚至危及生命。在国内，随着对人兽共患寄生虫病重视程度的提高，对田鼠巴贝虫的研究也逐渐增多。研究人员通过对多个省市的蜱媒与保虫宿主进行调查，发现田鼠巴贝虫在我国分布广泛，不同地区的感染率存在差异。例如，在南方重点调查省市，蜱媒与野栖鼠类中田鼠巴贝虫的感染率分别达3.22％和3.25％，且已有感染人的病例报道。在致病机制方面，国内研究表明田鼠巴贝虫主要通过破坏红细胞，导致宿主出现贫血、发热等症状，同时还会引发机体的免疫反应，但具体的免疫调节机制仍有待进一步深入研究。田鼠巴贝西虫分泌抗原1（BmSA1）作为诊断抗原的研究是该领域的一个重要方向。相关研究表明，BmSA1在田鼠巴贝虫感染的免疫反应中发挥着重要作用，能够刺激机体产生特异性抗体，因此具有作为诊断抗原的潜力。然而，BmSA1全长蛋白在原核表达系统中存在表达量少、不易纯化的问题，这限制了其在诊断试剂开发中的应用。为了解决这一问题，研究人员尝试对BmSA1进行截短表达，通过生物信息学分析，选取N-末端信号肽后，C-末端跨膜区前，包含CPSF73-100_C功能区的基因片段进行表达，成功获得了可溶性截短型抗原tBmSA1。研究发现，tBmSA1不仅解决了全长蛋白表达和纯化的难题，而且在抗原性方面表现出色，能够与田鼠巴贝虫感染血清发生特异性反应，可清晰地区分阴性及阳性鼠血清，并与其他病原感染无交叉反应，显示出良好的诊断特异性。同时，对鼠人工感染田鼠巴贝西虫系列血清检测表明，该抗原可检测早期感染（5天）和感染（55天）以后的样本，显示其对不同时期感染的宿主均具有诊断价值。目前田鼠巴贝虫病的诊断方法存在一定局限性。病原学镜检虽然是诊断金标准，但由于其灵敏度较低，在低密度原虫血症的情况下极易漏检，难以满足临床早期诊断的需求。血清学抗体检测技术，如间接免疫荧光抗体试验（IFA）、免疫印迹试验（IBT）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等，存在难以区分现症感染和既往感染的问题。这是因为宿主体内巴贝虫虫血症清除之后，血清IgG抗体水平仍然会持续相当一段时间，导致在判断感染状态时出现误差。而且这些检测方法还容易受到巴贝虫虫种间及与疟原虫交叉反应的影响，降低了检测结果的准确性。核酸分子检测，尤其是以田鼠巴贝虫18SrRNA序列为靶标的巢式PCR技术，虽然具有较高的敏感性和特异性，但扩增时间过长，两轮加样过程增加了样本的污染机会，容易出现假阳性结果，在实际应用中受到一定限制。本研究的创新点在于聚焦田鼠巴贝西虫截短型分泌抗原1（tBmSA1），利用原核表达系统获得高纯度的重组蛋白。原核表达具有操作简便、成本低、表达量高等优势，能够有效解决BmSA1全长蛋白表达和纯化的难题。基于此重组蛋白建立双抗原夹心ELISA方法，该方法具有特异性强、灵敏度高、可定量检测等特点。与传统的诊断方法相比，双抗原夹心ELISA方法能够更准确地检测田鼠巴贝虫的感染，有望实现对田鼠巴贝虫病的快速、准确诊断，有效区分现症感染和既往感染，提高检测的准确性和可靠性，为巴贝虫病的早期诊断、疫情监测以及防控措施的制定提供有力的技术支持。1.3研究目标与内容本研究旨在通过原核表达系统高效表达田鼠巴贝西虫截短型分泌抗原1（tBmSA1），并建立基于该重组蛋白的双抗原夹心ELISA方法，实现对田鼠巴贝虫病的快速、准确诊断。本研究将通过生物信息学分析，选取田鼠巴贝西虫分泌抗原1（BmSA1）基因中编码N-末端信号肽后，C-末端跨膜区前，包含CPSF73-100_C功能区的基因片段作为目的基因。设计特异性引物，利用PCR技术从田鼠巴贝西虫基因组DNA中扩增tBmSA1基因片段。将扩增得到的tBmSA1基因片段与原核表达载体pET-30a（+）进行连接，构建重组表达质粒pET-30a（+）-tBmSA1。通过热激转化法将重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组tBmSA1蛋白。对诱导表达条件，如IPTG浓度、诱导时间、诱导温度等进行优化，以提高重组蛋白的表达量和可溶性。利用镍亲和层析等技术对重组tBmSA1蛋白进行纯化，获得高纯度的重组蛋白。通过SDS-PAGE、WesternBlot和质谱分析等方法对纯化后的重组蛋白进行鉴定，确保其正确性和纯度。本研究将采用辣根过氧化物酶（HRP）标记纯化后的重组tBmSA1蛋白，建立双抗原夹心ELISA检测方法。对包被抗原浓度、酶标抗原浓度、封闭液种类及浓度、血清稀释度、反应时间和温度等条件进行优化，确定最佳反应条件。收集田鼠巴贝虫感染阳性血清和阴性血清，根据检测结果确定双抗原夹心ELISA方法的阴、阳性判定标准。对建立的双抗原夹心ELISA方法的特异性、敏感性、重复性等性能指标进行评估。用该方法检测临床样本，与传统诊断方法进行比较，验证其在实际应用中的可行性和准确性。二、田鼠巴贝西虫及巴贝西虫病概述2.1田鼠巴贝西虫的生物学特性田鼠巴贝西虫隶属于顶复门（Apicomplexa）孢子虫纲（Sporozoa）梨形虫目（Piroplasmida）巴贝斯科（Babesiidae）巴贝斯属（Babesia），是一种专性细胞内寄生的血液原虫。其形态多样，在扫描电镜下观察，裂殖子大小在406～981nm之间。在红细胞内，可见环形、椭圆形、梨形等多种形态，其中典型的梨形虫体常以锐角成对排列，形似“马耳他十字”，这是田鼠巴贝西虫的重要形态特征之一，但在实际检测中，四分体（马耳他十字形态）并不常见。田鼠巴贝西虫的结构较为复杂，具备一般细胞的基本结构，是含有完整细胞器的单细胞有机体。透射电镜下可见，其裂殖子的核膜为双层膜结构，虫体内含有核糖体、微管、内质网、线粒体和溶酶体等细胞器。这些细胞器对于维持虫体的正常生理功能至关重要，例如线粒体参与能量代谢，为虫体的生长、繁殖提供能量；内质网则与蛋白质和脂质的合成、运输相关。田鼠巴贝西虫的生活史较为复杂，涉及蜱和哺乳动物两个宿主。在蜱体内，田鼠巴贝西虫可进行有性生殖和无性生殖。当蜱叮咬感染田鼠巴贝西虫的哺乳动物时，虫体随血液进入蜱体内。在蜱的肠道上皮细胞内，虫体进行有性生殖，形成合子。合子进一步发育为动合子，动合子穿过肠壁，进入蜱的唾液腺或其他组织，发育为子孢子。当蜱再次叮咬其他哺乳动物时，子孢子随蜱的唾液进入宿主体内，开始在哺乳动物体内的发育过程。在哺乳动物体内，田鼠巴贝西虫主要寄生于红细胞内，进行无性生殖。以小鼠感染田鼠巴贝西虫为例，子孢子进入小鼠体内后，迅速侵入红细胞，首先发育为滋养体。滋养体在红细胞内摄取营养，不断生长，随后进行裂体增殖，形成多个裂殖子。随着裂殖子的不断增殖，红细胞最终破裂，释放出裂殖子，这些裂殖子又可侵入其他红细胞，继续进行裂体增殖，如此循环往复，导致宿主红细胞大量被破坏，引发贫血等一系列症状。在感染后期，部分裂殖子会发育为配子体，配子体可被蜱吸食，进入蜱体内，开始新一轮的生活史。2.2巴贝西虫病的流行病学特征巴贝西虫病呈全球性分布，广泛流行于美国、欧洲、非洲、亚洲等多个地区。在不同地区，其流行情况与当地的生态环境、蜱虫分布以及宿主动物的种类和数量密切相关。巴贝西虫病主要通过硬蜱叮咬传播，硬蜱在巴贝西虫的传播过程中扮演着关键角色。不同种类的巴贝西虫对应不同的蜱虫宿主，例如田鼠巴贝虫主要由肩突硬蜱传播。蜱虫的生活史包括卵、幼虫、若虫和成虫四个阶段，在其生长发育过程中，需要多次吸血。幼虫和若虫阶段通常以小型哺乳动物，如啮齿动物为宿主，成虫则多以大型哺乳动物，如鹿为宿主。当蜱虫叮咬感染巴贝西虫的宿主后，虫体在蜱体内发育繁殖，随后当蜱再次叮咬其他宿主时，就会将巴贝西虫传播给新的宿主。除了蜱虫叮咬传播外，巴贝西虫病还可通过输血、母婴垂直传播。输血传播是一个重要的传播途径，由于巴贝虫病是一种慢性自限性寄生虫病，感染后无症状的极低虫血症会持续很长时间，这使得感染者在献血时难以被发现，从而导致血制品污染，引发输血传播。据美国1979-2009年统计，约有162例巴贝虫病例与输血相关，其中159例为田鼠巴贝虫感染，这充分说明了输血传播的风险。母婴垂直传播虽然较为罕见，但也时有发生，对新生儿的健康构成威胁。多种哺乳动物都对巴贝西虫易感，包括啮齿动物、牛、羊、犬、马等。在这些动物中，啮齿动物，如田鼠、小鼠等，是田鼠巴贝虫的重要天然宿主。这些动物在自然界中数量众多，分布广泛，为巴贝西虫的传播提供了丰富的传染源。例如，在一些生态环境中，啮齿动物的种群密度较高，它们频繁与蜱虫接触，使得蜱虫感染巴贝西虫的几率大大增加，进而促进了巴贝西虫在自然界中的传播。而牛、羊等家畜感染巴贝西虫后，会影响其生长发育和生产性能，给畜牧业带来经济损失。在一些牧区，牛、羊巴贝西虫病的爆发会导致家畜的死亡率上升，肉质和奶质下降，严重影响牧民的经济收入。以我国福建省部分地区的调查为例，2014-2015年采用笼日法在福建省邵武、清流、顺昌、永安、长乐和尤溪等6地捕鼠，共捕获209只鼠，其中家鼠71只，野鼠138只。通过PCR检测巴贝虫18SrRNA片段，结果显示，巴贝虫阳性率为9.6%（20/209）。家鼠的阳性率为2.8%（2/71），野鼠的阳性率为13.0%（18/138），野鼠的阳性率显著高于家鼠。不同地区的鼠类阳性率也存在差异，尤溪的鼠类阳性率最高，为14.9%（13/87），其次为永安，阳性率为13.6%（3/22），清流的鼠类未检出巴贝虫感染阳性。进一步的测序和同源性分析结果显示，该地区血样感染的为田鼠巴贝虫。从这个调查可以看出，田鼠巴贝虫在福建省部分地区的鼠类中存在一定的感染情况，且不同地区、不同鼠种的感染率有所不同，这可能与当地的生态环境、蜱虫分布以及鼠类的活动习性等因素有关。在美国，巴贝西虫病主要流行于东北部和中西部地区，如马萨诸塞州南塔基特湾接壤的大陆和周边岛屿、罗德岛、纽约的长岛东部及雪尔特岛，康涅狄格州沿岸、新泽西，及中西部地区的威斯康辛州和明尼苏达州。这些地区的气候、植被等生态条件适宜蜱虫的生存和繁殖，同时也为巴贝西虫的宿主动物提供了良好的栖息环境，从而导致巴贝西虫病在这些地区较为高发。根据宾夕法尼亚州立健康MiltonS.Hershey医学中心和宾夕法尼亚州立医学院的研究人员领导的一项新研究，2015年至2022年间，美国的巴贝西亚原虫病发病率平均每年上升9%，且近一半的患者还同时感染了另一种蜱媒疾病，如莱姆病，这表明巴贝西虫病在美国的流行趋势日益严峻，且合并感染的情况较为普遍。在欧洲，B.divergens是感染巴贝斯虫的主要原因，尤其好发于脾切除患者，这可能与欧洲的蜱虫种类、人群的生活习惯以及医疗条件等因素有关。2.3巴贝西虫病的致病机制与临床症状巴贝西虫病的致病机制较为复杂，主要是由于巴贝西虫在红细胞内寄生、繁殖，导致红细胞破裂，释放出裂殖子和血红蛋白等物质。裂殖子又可侵入其他红细胞，继续进行裂体增殖，如此循环往复，使得红细胞不断被破坏。红细胞的大量破坏会引发一系列病理生理变化，如贫血、黄疸等。同时，巴贝西虫感染还会激活机体的免疫系统，引发免疫反应。机体产生的免疫细胞和细胞因子在试图清除病原体的过程中，也会对自身组织和器官造成损伤，导致炎症反应的发生，进一步加重病情。例如，感染田鼠巴贝虫后，机体的巨噬细胞会被激活，释放肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）等细胞因子。这些细胞因子一方面可以增强机体的免疫防御能力，但另一方面也可能导致发热、炎症等症状的出现。巴贝西虫病的临床症状表现多样，且严重程度差异显著，这与感染的巴贝虫种类、感染程度以及宿主的免疫状态等因素密切相关。在健康人群中，大多呈现隐性感染，或仅表现出一过性的发热、头痛、肌肉疼痛等类似感冒的症状，这些症状通常较轻，持续时间较短，容易被忽视。例如，一些健康人感染田鼠巴贝虫后，可能仅有轻微的发热，体温在38℃左右，伴有头痛、乏力等不适，持续1-2天后症状自行缓解。然而，在免疫缺陷病人中，如脾切除者、HIV患者、老人或儿童等，病情则可能较为严重。脾切除者由于失去了脾脏这一重要的免疫器官，对巴贝西虫的清除能力下降，感染后病情往往迅速进展，可出现高热，体温可达40℃以上，严重贫血，红细胞数量和血红蛋白含量显著降低，导致面色苍白、乏力、头晕等症状明显。同时，还可能伴有血红蛋白尿，尿液颜色加深，呈酱油色，这是由于红细胞破裂后，血红蛋白释放到血液中，经过代谢后通过尿液排出所致。黄疸也是常见症状之一，表现为皮肤和巩膜黄染，这是因为红细胞破坏后，胆红素生成增加，超过了肝脏的代谢能力，导致胆红素在体内蓄积。部分患者还可能出现肾衰竭，表现为少尿、无尿、血肌酐升高等症状，严重威胁生命健康。HIV患者由于免疫系统受到病毒的严重破坏，抵抗力极低，感染巴贝西虫后，病情同样不容乐观，容易出现多器官功能障碍，预后较差。以美国的相关病例为例，据报道，在一些脾切除的患者中，感染田鼠巴贝虫后，迅速出现高热、寒战等症状，体温持续在40℃以上，伴有剧烈头痛、全身肌肉酸痛。随着病情的发展，贫血症状逐渐加重，面色苍白如纸，身体极度虚弱。尿液颜色变深，呈现明显的酱油色，这表明血红蛋白尿的出现。实验室检查显示，红细胞计数急剧下降，血红蛋白含量大幅降低，胆红素水平升高，肾功能指标异常，血肌酐值升高，提示肾衰竭的发生。这些患者经过积极治疗，仍有部分因病情过重而死亡。在我国，虽然巴贝西虫病的病例相对较少，但也有类似的情况发生。例如，昆明地区曾发现一例人感染巴贝西原虫病例，患者为46岁女性，主诉全身酸痛不适、畏寒、低热、心悸、疲乏无力。经检查，发现白细胞明显异常，中性粒细胞比例升高，且有中毒颗粒出现。询问病史得知，患者曾到过西双版纳，期间手背皮肤曾被虫叮咬。进一步的检查和诊断确定为巴贝西虫感染，经过抗原虫、抗感染联合治疗后获得了良好效果。这一病例也说明了巴贝西虫病在临床上的表现和诊断治疗过程。三、田鼠巴贝西虫截短型分泌抗原1的原核表达3.1实验材料准备实验选用大肠杆菌BL21（DE3）作为宿主菌。大肠杆菌BL21（DE3）是一种常用于原核表达的宿主菌，其遗传背景清晰，易于培养和转化。它缺乏lon蛋白酶和ompT蛋白酶，能够有效减少重组蛋白的降解，有利于获得高表达量和高纯度的重组蛋白。而且该菌株对多种抗生素敏感，便于在实验过程中进行筛选和鉴定。例如，在后续的重组质粒转化实验中，可以利用其对卡那霉素的敏感性，在含有卡那霉素的培养基上筛选出成功转化重组质粒的菌株。原核表达载体选用pET-30a（+）。pET-30a（+）是一种广泛应用的原核表达载体，具有诸多优势。它含有T7启动子，能够在IPTG的诱导下高效启动外源基因的转录和表达。载体上还带有His标签编码序列，这使得表达出的重组蛋白N端或C端会融合His标签。His标签可以与镍离子特异性结合，利用这一特性，通过镍亲和层析技术能够方便快捷地对重组蛋白进行纯化，大大提高了纯化效率和纯度。例如，在本实验中，重组tBmSA1蛋白表达后，就可以利用其融合的His标签，通过镍亲和层析柱进行纯化，获得高纯度的重组蛋白。实验中使用的主要试剂包括DNAMarkerDL2000、限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ、T4DNA连接酶、PrimeSTARHSDNAPolymerase、DNA胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、IPTG、卡那霉素、氨苄青霉素等。DNAMarkerDL2000用于在琼脂糖凝胶电泳中确定DNA片段的大小，在PCR产物鉴定、重组质粒酶切鉴定等实验中，通过与DNAMarkerDL2000进行对比，可以准确判断目的DNA片段的大小是否符合预期。限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ用于对目的基因和表达载体进行双酶切，它们能够识别并切割特定的DNA序列，在目的基因和载体上产生互补的粘性末端，便于后续的连接反应。T4DNA连接酶则用于将双酶切后的目的基因和载体连接起来，形成重组表达质粒。PrimeSTARHSDNAPolymerase是一种高保真DNA聚合酶，在PCR扩增tBmSA1基因片段时，能够保证扩增产物的准确性，减少碱基错配的发生，提高扩增效率和特异性。DNA胶回收试剂盒用于从琼脂糖凝胶中回收目的DNA片段，在PCR产物、酶切产物等的回收过程中，能够高效、准确地分离出目的DNA，去除杂质，保证后续实验的顺利进行。质粒小提试剂盒用于提取重组质粒，能够快速、简便地从大肠杆菌中提取高质量的重组质粒，满足实验对质粒的需求。IPTG作为诱导剂，能够与Lac阻遏物结合，改变其构象，从而解除对RNA聚合酶的阻碍，启动外源基因的转录和表达，在重组蛋白诱导表达实验中，通过添加不同浓度的IPTG，研究其对重组蛋白表达量的影响。卡那霉素和氨苄青霉素是常用的抗生素，在大肠杆菌培养过程中，加入相应的抗生素可以筛选出含有重组质粒的菌株，例如，pET-30a（+）载体含有卡那霉素抗性基因，在含有卡那霉素的培养基上，只有成功转化该载体的大肠杆菌才能生长。实验用到的主要仪器有PCR仪、高速冷冻离心机、恒温摇床、电泳仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计等。PCR仪用于进行PCR扩增反应，通过设置合适的温度和循环参数，实现对tBmSA1基因片段的特异性扩增。高速冷冻离心机用于在低温条件下对样品进行离心分离，在细菌培养物的收集、蛋白表达产物的分离等实验中，能够快速、有效地分离不同成分。恒温摇床用于培养大肠杆菌，为细菌的生长提供适宜的温度和振荡条件，促进细菌的生长和繁殖。电泳仪和凝胶成像系统用于DNA和蛋白质的电泳分析，通过电泳将DNA或蛋白质按照分子量大小进行分离，再利用凝胶成像系统对电泳结果进行观察和拍照记录，在PCR产物鉴定、重组质粒酶切鉴定、重组蛋白SDS-PAGE分析等实验中发挥重要作用。紫外分光光度计用于测定DNA和蛋白质的浓度，通过检测样品在特定波长下的吸光度，根据吸光度与浓度的关系，准确计算出DNA和蛋白质的浓度，为后续实验提供准确的实验数据。3.2tBmSA1基因的克隆与重组质粒构建根据GenBank中田鼠巴贝西虫BmSA1基因序列（登录号：AF496033.1），运用生物信息学软件进行分析，精心选取N-末端信号肽后，C-末端跨膜区前，包含CPSF73-100_C功能区的基因片段作为目的基因，该片段长度为687bp，编码228个氨基酸。使用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物，上游引物为5’-CATATGATGAAAGCTGAGAACACAGC-3’，在引物的5’端引入了NdeⅠ酶切位点（下划线部分）；下游引物为5’-CTCGAGTTAGCTGCTTGCTTGTTG-3’，在引物的5’端引入了XhoⅠ酶切位点（下划线部分）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以提取的田鼠巴贝西虫基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为50μl，具体包括：5×PrimeSTARBuffer10μl，dNTPMixture（2.5mMeach）4μl，上游引物（10μM）2μl，下游引物（10μM）2μl，PrimeSTARHSDNAPolymerase1μl，模板DNA1μl，ddH₂O30μl。PCR反应条件如下：95℃预变性5min；然后进行35个循环，每个循环包括95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min。扩增结束后，取5μlPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。在图1中，M为DNAMarkerDL2000，1泳道为PCR扩增产物，可以清晰地看到在约700bp处出现了特异性条带，与预期的tBmSA1基因片段大小相符，这表明成功扩增出了tBmSA1基因片段。[此处插入图1：tBmSA1基因PCR扩增结果。M：DNAMarkerDL2000；1：PCR扩增产物]将扩增得到的tBmSA1基因片段和原核表达载体pET-30a（+）分别用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ进行双酶切。酶切体系总体积为20μl，包含10×Buffer2μl，NdeⅠ1μl，XhoⅠ1μl，DNA（tBmSA1基因片段或pET-30a（+）载体）10μl，ddH₂O6μl。37℃水浴酶切3h。酶切结束后，通过1%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，然后使用DNA胶回收试剂盒分别回收酶切后的tBmSA1基因片段和pET-30a（+）载体片段。将回收的tBmSA1基因片段和pET-30a（+）载体片段按照摩尔比3:1的比例混合，加入T4DNA连接酶进行连接反应。连接体系总体积为10μl，包括10×T4DNALigaseBuffer1μl，T4DNALigase1μl，回收的tBmSA1基因片段3μl，回收的pET-30a（+）载体片段1μl，ddH₂O4μl。16℃连接过夜，从而成功构建出重组表达质粒pET-30a（+）-tBmSA1。将连接产物转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中。从-80℃冰箱中取出BL21（DE3）感受态细胞，置于冰上使其缓慢融化。取10μl连接产物加入到100μl感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。然后将混合物放入42℃水浴中热激90s，迅速放回冰浴中冷却2min。向管中加入900μl无抗生素的LB液体培养基，37℃、200r/min振荡培养1h，使菌体复苏。将复苏后的菌液8000r/min离心1min，弃去部分上清，仅留100μl，将剩余菌液用移液器吹打混匀后，均匀涂布在含有卡那霉素（50μg/ml）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16h，直至长出单菌落。从平板上随机挑取多个单菌落，接种到含有卡那霉素（50μg/ml）的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。使用质粒小提试剂盒提取重组质粒，对提取的重组质粒进行菌落PCR鉴定和双酶切鉴定。菌落PCR鉴定反应体系及条件与上述PCR扩增体系和条件相同。双酶切鉴定体系为20μl，包括10×Buffer2μl，NdeⅠ1μl，XhoⅠ1μl，重组质粒10μl，ddH₂O6μl，37℃水浴酶切3h。酶切产物和菌落PCR产物均通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图2所示。在图2中，A图为菌落PCR鉴定结果，M为DNAMarkerDL2000，1-5泳道为不同菌落的PCR扩增产物，在约700bp处均出现特异性条带，与预期大小相符；B图为双酶切鉴定结果，M为DNAMarkerDL2000，1-5泳道为重组质粒双酶切产物，酶切后出现两条带，一条为约5.5kb的载体片段，另一条为约700bp的tBmSA1基因片段，与预期结果一致。这些结果充分表明重组质粒pET-30a（+）-tBmSA1构建成功。[此处插入图2：重组质粒pET-30a（+）-tBmSA1的鉴定结果。A：菌落PCR鉴定；M：DNAMarkerDL2000；1-5：不同菌落的PCR扩增产物。B：双酶切鉴定；M：DNAMarkerDL2000；1-5：重组质粒双酶切产物]3.3重组质粒的鉴定为进一步验证重组质粒pET-30a（+）-tBmSA1的正确性，对其进行测序鉴定。将经过菌落PCR鉴定和双酶切鉴定均为阳性的重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序结果使用DNAMAN软件与GenBank中田鼠巴贝西虫BmSA1基因序列（登录号：AF496033.1）进行比对分析。比对结果显示，重组质粒中插入的tBmSA1基因序列与目的基因序列完全一致，无碱基突变、缺失或插入等情况，这充分表明重组质粒pET-30a（+）-tBmSA1构建正确，可用于后续的重组蛋白表达实验。3.4重组蛋白的诱导表达与条件优化将测序正确的重组质粒pET-30a（+）-tBmSA1转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，接种于含有卡那霉素（50μg/ml）的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜，得到种子液。次日，按1%的接种量将种子液接种到新鲜的含有卡那霉素（50μg/ml）的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD600值达到0.5-0.7，此时加入IPTG进行诱导表达。首先对IPTG诱导浓度进行优化。分别设置IPTG终浓度为0.1mmol/L、0.3mmol/L、0.5mmol/L、0.7mmol/L、1.0mmol/L，37℃诱导表达4h。诱导结束后，取1ml菌液，12000r/min离心1min，收集菌体。加入100μl1×SDS上样缓冲液重悬菌体，煮沸10min，使蛋白充分变性。然后进行12%SDS-PAGE分析，结果如图3所示。在图3中，M为蛋白Marker，1-5泳道分别为IPTG终浓度为0.1mmol/L、0.3mmol/L、0.5mmol/L、0.7mmol/L、1.0mmol/L诱导表达的重组蛋白。通过ImageJ软件对电泳条带进行灰度分析，以灰度值表示蛋白表达量，结果如表1所示。从表1可以看出，随着IPTG浓度的增加，重组蛋白的表达量逐渐增加，当IPTG终浓度为0.7mmol/L时，重组蛋白的表达量达到最高，继续增加IPTG浓度，表达量无明显变化。因此，确定最佳IPTG诱导浓度为0.7mmol/L。[此处插入图3：不同IPTG浓度诱导重组蛋白表达的SDS-PAGE分析。M：蛋白Marker；1-5泳道分别为IPTG终浓度为0.1mmol/L、0.3mmol/L、0.5mmol/L、0.7mmol/L、1.0mmol/L诱导表达的重组蛋白][此处插入表1：不同IPTG浓度诱导重组蛋白表达的灰度分析结果]在确定最佳IPTG诱导浓度后，对诱导时间进行优化。在IPTG终浓度为0.7mmol/L的条件下，分别诱导2h、4h、6h、8h、10h，37℃诱导表达。诱导结束后，同样取1ml菌液进行处理和12%SDS-PAGE分析，结果如图4所示。在图4中，M为蛋白Marker，1-5泳道分别为诱导时间为2h、4h、6h、8h、10h诱导表达的重组蛋白。通过ImageJ软件对电泳条带进行灰度分析，结果如表2所示。由表2可知，随着诱导时间的延长，重组蛋白的表达量先增加后减少，诱导6h时表达量最高。因此，确定最佳诱导时间为6h。[此处插入图4：不同诱导时间诱导重组蛋白表达的SDS-PAGE分析。M：蛋白Marker；1-5泳道分别为诱导时间为2h、4h、6h、8h、10h诱导表达的重组蛋白][此处插入表2：不同诱导时间诱导重组蛋白表达的灰度分析结果]最后对诱导温度进行优化。在IPTG终浓度为0.7mmol/L、诱导时间为6h的条件下，分别设置诱导温度为25℃、30℃、37℃、42℃。诱导结束后，取1ml菌液进行处理和12%SDS-PAGE分析，结果如图5所示。在图5中，M为蛋白Marker，1-4泳道分别为诱导温度为25℃、30℃、37℃、42℃诱导表达的重组蛋白。通过ImageJ软件对电泳条带进行灰度分析，结果如表3所示。从表3可以看出，37℃时重组蛋白的表达量最高。因此，确定最佳诱导温度为37℃。[此处插入图5：不同诱导温度诱导重组蛋白表达的SDS-PAGE分析。M：蛋白Marker；1-4泳道分别为诱导温度为25℃、30℃、37℃、42℃诱导表达的重组蛋白][此处插入表3：不同诱导温度诱导重组蛋白表达的灰度分析结果]综上所述，重组tBmSA1蛋白的最佳诱导表达条件为：IPTG终浓度0.7mmol/L，37℃诱导6h。在该条件下诱导表达重组蛋白，经12%SDS-PAGE分析，结果如图6所示。在图6中，M为蛋白Marker，1泳道为未诱导的重组菌全菌蛋白，2泳道为诱导后的重组菌全菌蛋白。可以明显看到，诱导后的重组菌在约28kDa处出现特异性条带，与预期的重组tBmSA1蛋白大小相符，且表达量较高，表明在优化条件下成功诱导表达了重组tBmSA1蛋白。[此处插入图6：优化条件下重组蛋白诱导表达的SDS-PAGE分析。M：蛋白Marker；1：未诱导的重组菌全菌蛋白；2：诱导后的重组菌全菌蛋白]3.5重组蛋白的纯化与定量在确定最佳诱导表达条件后，按照优化后的条件进行大规模诱导表达重组tBmSA1蛋白。诱导结束后，收集菌体，进行重组蛋白的纯化。采用镍亲和层析法对重组蛋白进行纯化。将诱导表达后的菌液12000r/min离心10min，收集菌体。用PBS缓冲液（pH7.4）重悬菌体，超声破碎（功率300W，工作3s，间隔5s，总时间30min），使细胞充分裂解。12000r/min离心30min，取上清，将上清液缓慢加入到已用PBS缓冲液平衡好的镍亲和层析柱中，让重组蛋白与镍离子特异性结合。用含有20mmol/L咪唑的PBS缓冲液洗脱杂蛋白，直至流出液在280nm处的吸光度值接近基线。然后用含有250mmol/L咪唑的PBS缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱峰。将收集的洗脱液进行12%SDS-PAGE分析，结果如图7所示。在图7中，M为蛋白Marker，1泳道为诱导表达后的全菌蛋白，2泳道为超声破碎后的上清，3泳道为镍亲和层析纯化后的重组蛋白。可以看到，经过镍亲和层析纯化后，在约28kDa处得到了单一的重组蛋白条带，杂蛋白明显减少，表明重组蛋白得到了有效纯化。[此处插入图7：重组蛋白纯化的SDS-PAGE分析。M：蛋白Marker；1：诱导表达后的全菌蛋白；2：超声破碎后的上清；3：镍亲和层析纯化后的重组蛋白]采用BCA蛋白定量试剂盒对纯化后的重组蛋白进行定量。按照试剂盒说明书进行操作，首先配制不同浓度的牛血清白蛋白（BSA）标准品溶液，浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml。取96孔板，分别加入20μl不同浓度的BSA标准品溶液和20μl纯化后的重组蛋白样品，每个样品设3个复孔。然后向每孔中加入200μlBCA工作液，轻轻混匀，37℃孵育30min。孵育结束后，用酶标仪在562nm波长处测定各孔的吸光度值（OD值）。以BSA标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线计算出重组蛋白的浓度。结果显示，纯化后的重组tBmSA1蛋白浓度为1.2mg/ml，满足后续实验的需求。3.6重组蛋白的鉴定为了进一步确认纯化后的蛋白是否为目的重组tBmSA1蛋白，对其进行质谱分析。将纯化后的重组蛋白样品送至专业的质谱分析机构，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术进行分析。质谱分析结果显示，检测到的蛋白肽段序列与田鼠巴贝西虫tBmSA1蛋白的理论肽段序列高度匹配，匹配率达到95%以上，这充分表明纯化后的蛋白即为目的重组tBmSA1蛋白，验证了重组蛋白表达和纯化的正确性。采用WesternBlot对重组tBmSA1蛋白的抗原性进行免疫学鉴定。将纯化后的重组蛋白进行12%SDS-PAGE电泳，然后通过半干转膜法将蛋白转移至硝酸纤维素（NC）膜上。用5%脱脂奶粉封闭NC膜2h，以封闭膜上的非特异性结合位点。封闭后，加入1:1000稀释的田鼠巴贝虫感染阳性小鼠血清作为一抗，4℃孵育过夜。次日，用PBST缓冲液洗涤NC膜3次，每次10min，以去除未结合的一抗。接着加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗，室温孵育1h。再次用PBST缓冲液洗涤NC膜3次，每次10min。最后，加入DAB显色液进行显色反应，结果如图8所示。在图8中，M为蛋白Marker，1泳道为纯化后的重组tBmSA1蛋白。可以看到，在约28kDa处出现特异性条带，与预期的重组tBmSA1蛋白大小相符，且该条带能够与田鼠巴贝虫感染阳性小鼠血清发生特异性反应，而与阴性小鼠血清无反应，这表明重组tBmSA1蛋白具有良好的抗原性，能够被田鼠巴贝虫感染阳性血清中的抗体所识别。[此处插入图8：重组蛋白的WesternBlot分析。M：蛋白Marker；1：纯化后的重组tBmSA1蛋白]为了更准确地评估重组tBmSA1蛋白的抗原性，采用间接ELISA方法进行检测。用包被缓冲液将纯化后的重组tBmSA1蛋白稀释至1μg/ml，加入96孔酶标板中，每孔100μl，4℃包被过夜。次日，弃去包被液，用PBST缓冲液洗涤3次，每次3min。然后用5%脱脂奶粉封闭，37℃孵育2h。封闭后，弃去封闭液，用PBST缓冲液洗涤3次，每次3min。分别加入1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600稀释的田鼠巴贝虫感染阳性小鼠血清和阴性小鼠血清，每孔100μl，37℃孵育1h。孵育结束后，用PBST缓冲液洗涤3次，每次3min。加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，每孔100μl，37℃孵育1h。再次用PBST缓冲液洗涤3次，每次3min。最后加入TMB底物显色液，每孔100μl，37℃避光反应15min。加入2MH₂SO₄终止液，每孔50μl，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的OD值。结果如表4所示，田鼠巴贝虫感染阳性小鼠血清在不同稀释度下的OD₄₅₀值均显著高于阴性小鼠血清（P<0.01），且随着阳性血清稀释度的增加，OD₄₅₀值逐渐降低，但仍明显高于阴性对照。这进一步证明重组tBmSA1蛋白具有良好的抗原性，能够与田鼠巴贝虫感染阳性血清发生特异性反应，可用于后续的血清学检测。[此处插入表4：重组蛋白的间接ELISA检测结果]四、tBmSA1双抗原夹心ELISA方法的建立4.1实验材料与准备工作实验所用的抗原为经过原核表达、优化条件诱导表达以及镍亲和层析纯化后的重组tBmSA1蛋白，其浓度为1.2mg/ml，纯度经SDS-PAGE分析显示杂蛋白明显减少，在约28kDa处得到了单一的重组蛋白条带，质谱分析结果表明检测到的蛋白肽段序列与田鼠巴贝西虫tBmSA1蛋白的理论肽段序列高度匹配，匹配率达到95%以上，WesternBlot和间接ELISA分析显示该重组蛋白具有良好的抗原性，能够与田鼠巴贝虫感染阳性血清发生特异性反应，这些都表明该重组tBmSA1蛋白可用于双抗原夹心ELISA方法的建立。血清包括田鼠巴贝虫感染阳性小鼠血清和阴性小鼠血清，阳性小鼠血清是通过对小鼠进行田鼠巴贝虫人工感染，待感染一定时间后，采集小鼠血液，分离血清获得；阴性小鼠血清则采集自未感染田鼠巴贝虫的健康小鼠。为保证实验的准确性和可靠性，对采集的血清进行了严格的质量控制，如通过间接ELISA方法对血清进行初步筛选，确保阳性血清的抗体效价较高，阴性血清无交叉反应。同时，将血清进行分装，保存于-20℃冰箱中，避免反复冻融对血清质量造成影响。实验中使用的主要试剂有辣根过氧化物酶（HRP）标记试剂盒、TMB底物显色液、2MH₂SO₄终止液、包被缓冲液（pH9.6的碳酸盐缓冲液）、洗涤缓冲液（PBST，含0.05%Tween-20的PBS缓冲液）、封闭液（5%脱脂奶粉的PBST缓冲液）等。辣根过氧化物酶（HRP）标记试剂盒用于标记重组tBmSA1蛋白，其原理是利用HRP的活性基团与重组蛋白的特定基团发生化学反应，形成稳定的结合物，从而使重组蛋白带上HRP标记。TMB底物显色液在HRP的催化作用下会发生显色反应，其反应原理是HRP将TMB底物中的氢原子转移给过氧化氢，使TMB氧化成蓝色产物，在酸性条件下，蓝色产物会转变为黄色，便于通过酶标仪进行检测。2MH₂SO₄终止液用于终止显色反应，其作用机制是改变反应体系的pH值，使HRP失去活性，从而停止显色反应。包被缓冲液用于稀释重组tBmSA1蛋白，使其能够均匀地吸附在酶标板表面，其pH值为9.6的碳酸盐缓冲液，这种缓冲液的碱性环境有利于抗原与酶标板表面的结合。洗涤缓冲液（PBST）用于洗涤酶标板，去除未结合的物质，其中含有的0.05%Tween-20可以降低液体表面张力，增强洗涤效果，提高检测的特异性。封闭液（5%脱脂奶粉的PBST缓冲液）用于封闭酶标板上未被抗原占据的位点，减少非特异性结合，提高检测的准确性，脱脂奶粉中的蛋白质可以与酶标板表面的空余位点结合，防止后续检测过程中出现非特异性吸附。实验用到的主要仪器有酶标仪、恒温孵育箱、洗板机等。酶标仪用于测定各孔的吸光度值，通过检测TMB底物显色后的吸光度变化，判断样品中是否存在田鼠巴贝虫抗体，其工作原理是利用单色光照射酶标板孔中的样品，样品对光的吸收程度与其中的物质浓度相关，通过检测吸光度值，可以定量分析样品中的目标物质含量。恒温孵育箱为抗原抗体反应提供适宜的温度条件，保证反应能够顺利进行，不同的反应步骤需要在特定的温度下孵育一定时间，如包被、封闭、血清孵育等步骤，恒温孵育箱能够精确控制温度，确保实验条件的一致性。洗板机用于自动洗涤酶标板，提高洗涤效率和效果，减少人工操作误差，它可以按照设定的程序，自动加入洗涤缓冲液，振荡洗涤，然后吸干液体，重复多次，确保酶标板上的杂质被彻底清除。在实验前，对所有仪器进行了校准和调试，确保其性能正常。例如，对酶标仪进行波长校准，保证检测波长的准确性；对恒温孵育箱进行温度校准，使其温度波动在允许范围内。同时，对试剂进行了质量检查，如检查TMB底物显色液是否有变色、沉淀等异常情况，确保试剂在有效期内且质量合格。对实验环境进行了清洁和消毒，保持实验台面的整洁，减少外界因素对实验结果的干扰。4.2辣根过氧化物酶标记tBmSA1采用过碘酸钠法对纯化后的重组tBmSA1蛋白进行辣根过氧化物酶（HRP）标记。过碘酸钠法的原理是利用过碘酸钠将HRP分子表面的多糖羟基氧化为醛基，醛基可与重组tBmSA1蛋白分子上的氨基发生反应，形成稳定的Schiff碱，从而实现HRP与重组tBmSA1蛋白的共价结合。具体标记方法如下：取5mg纯化后的重组tBmSA1蛋白，溶于1ml0.05mol/LpH9.0的碳酸盐缓冲液中。向其中加入1ml新鲜配制的10mmol/L过碘酸钠溶液，混匀后，室温避光反应30min。反应结束后，将混合物装入透析袋，用0.001mol/LpH4.0的醋酸钠缓冲液4℃透析过夜，以去除未反应的过碘酸钠。向透析后的溶液中加入1ml5mg/ml的HRP溶液，混匀，室温反应2h。随后加入0.1ml4mg/ml的硼氢化钠溶液，4℃反应2h，以还原形成的Schiff碱，使标记物更加稳定。标记结束后，将标记物装入透析袋，用0.01mol/LpH7.4的PBS缓冲液4℃透析过夜，去除未结合的HRP和其他小分子杂质。为了确定最佳标记条件，对重组tBmSA1蛋白与HRP的比例进行了优化。分别设置重组tBmSA1蛋白与HRP的质量比为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5，按照上述标记方法进行标记。标记结束后，通过间接ELISA方法对不同比例标记的酶标抗原进行活性检测。用包被缓冲液将重组tBmSA1蛋白稀释至1μg/ml，包被96孔酶标板，每孔100μl，4℃包被过夜。次日，弃去包被液，用PBST缓冲液洗涤3次，每次3min。然后用5%脱脂奶粉封闭，37℃孵育2h。封闭后，弃去封闭液，用PBST缓冲液洗涤3次，每次3min。分别加入不同比例标记的酶标抗原，稀释度为1:1000，每孔100μl，37℃孵育1h。孵育结束后，用PBST缓冲液洗涤3次，每次3min。加入TMB底物显色液，每孔100μl，37℃避光反应15min。加入2MH₂SO₄终止液，每孔50μl，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的OD值。以OD₄₅₀值越高且与阴性对照OD₄₅₀值差值越大为最佳标记比例，结果如表5所示。从表5可以看出，当重组tBmSA1蛋白与HRP的质量比为1:3时，OD₄₅₀值最高，且与阴性对照OD₄₅₀值差值最大，因此确定最佳标记比例为1:3。[此处插入表5：不同重组tBmSA1蛋白与HRP比例标记的酶标抗原活性检测结果]将标记后的酶标抗原进行SDS-PAGE分析，结果如图9所示。在图9中，M为蛋白Marker，1泳道为未标记的重组tBmSA1蛋白，2泳道为标记后的酶标抗原。可以看到，标记后的酶标抗原分子量明显增大，在约70kDa处出现条带，这是由于HRP的分子量约为40kDa，与重组tBmSA1蛋白（约28kDa）结合后，分子量增加，表明重组tBmSA1蛋白成功标记上HRP。[此处插入图9：酶标抗原的SDS-PAGE分析。M：蛋白Marker；1：未标记的重组tBmSA1蛋白；2：标记后的酶标抗原]采用间接ELISA方法对标记后的酶标抗原的活性进行进一步验证。用包被缓冲液将重组tBmSA1蛋白稀释至1μg/ml，包被96孔酶标板，每孔100μl，4℃包被过夜。次日，弃去包被液，用PBST缓冲液洗涤3次，每次3min。然后用5%脱脂奶粉封闭，37℃孵育2h。封闭后，弃去封闭液，用PBST缓冲液洗涤3次，每次3min。分别加入不同稀释度（1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000）的标记后的酶标抗原，每孔100μl，37℃孵育1h。孵育结束后，用PBST缓冲液洗涤3次，每次3min。加入TMB底物显色液，每孔100μl，37℃避光反应15min。加入2MH₂SO₄终止液，每孔50μl，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的OD值。以田鼠巴贝虫感染阳性小鼠血清作为阳性对照，阴性小鼠血清作为阴性对照。结果如表6所示，随着酶标抗原稀释度的增加，OD₄₅₀值逐渐降低，但在1:8000稀释度下，阳性对照OD₄₅₀值仍显著高于阴性对照（P<0.01），表明标记后的酶标抗原具有良好的活性，能够与包被抗原和阳性血清发生特异性反应，可用于后续的双抗原夹心ELISA方法的建立。[此处插入表6：酶标抗原活性的间接ELISA验证结果]4.3双抗原夹心ELISA检测方法的建立双抗原夹心ELISA检测方法的建立过程如下：用包被缓冲液将纯化后的重组tBmSA1蛋白稀释至一定浓度，加入96孔酶标板中，每孔100μl，4℃包被过夜。使抗原通过物理吸附固定在酶标板表面，形成固相抗原。包被结束后，弃去包被液，用PBST缓冲液洗涤3次，每次3min，以去除未结合的抗原及杂质。然后用5%脱脂奶粉的PBST缓冲液进行封闭，每孔加入200μl，37℃孵育2h，封闭酶标板上未被抗原占据的位点，减少后续检测中的非特异性结合。封闭结束后，弃去封闭液，用PBST缓冲液洗涤3次，每次3min。将待检血清用PBST缓冲液进行适当稀释后，加入到已包被和封闭好的酶标板孔中，每孔100μl，同时设置阳性对照孔（加入田鼠巴贝虫感染阳性小鼠血清）、阴性对照孔（加入阴性小鼠血清）和空白对照孔（只加PBST缓冲液），37℃孵育1h。使血清中的抗体与固相抗原结合，形成固相抗原-抗体复合物。孵育结束后，用PBST缓冲液洗涤5次，每次3min，洗去未结合的物质。将标记好的酶标抗原用PBST缓冲液稀释至合适浓度，每孔加入100μl，37℃孵育1h。酶标抗原会与固相抗原-抗体复合物中的抗体结合，形成固相抗原-抗体-酶标抗原复合物。孵育结束后，用PBST缓冲液洗涤5次，每次3min，洗去未结合的酶标抗原。加入TMB底物显色液，每孔100μl，37℃避光反应15min。在HRP的催化作用下，TMB底物发生显色反应，产生蓝色产物。加入2MH₂SO₄终止液，每孔50μl，终止显色反应，此时蓝色产物转变为黄色。用酶标仪在450nm波长处测定各孔的OD值。检测流程如图10所示。[此处插入图10：双抗原夹心ELISA检测方法流程图]4.4阴、阳性判定标准的确定收集30份田鼠巴贝虫感染阳性小鼠血清和30份阴性小鼠血清，用建立的双抗原夹心ELISA方法进行检测，记录各孔在450nm波长处的OD值。以血清的OD值为横坐标，阳性血清的累计分布频率为纵坐标，绘制阳性血清的频率分布曲线；以阴性血清的OD值为横坐标，阴性血清的累计分布频率为纵坐标，绘制阴性血清的频率分布曲线，结果如图11所示。从图11中可以看出，阳性血清和阴性血清的OD值分布存在明显差异，阳性血清的OD值普遍较高，阴性血清的OD值相对较低，但两者之间存在一定的重叠区域。[此处插入图11：阳性血清和阴性血清的频率分布曲线]为了更准确地确定阴、阳性判定标准，采用受试者工作特征（ROC）曲线分析。ROC曲线以真阳性率（TPR）为纵坐标，假阳性率（FPR）为横坐标。真阳性率（TPR）=真阳性数/（真阳性数+假阴性数），反映了实际为阳性的样本被正确判断为阳性的比例；假阳性率（FPR）=假阳性数/（假阳性数+真阴性数），反映了实际为阴性的样本被错误判断为阳性的比例。通过计算不同OD值对应的TPR和FPR，绘制ROC曲线，结果如图12所示。在图12中，曲线下面积（AUC）为0.958，AUC越接近1，说明诊断方法的准确性越高，当AUC为0.5时，说明诊断方法无诊断价值，该结果表明本研究建立的双抗原夹心ELISA方法具有较高的准确性。[此处插入图12：双抗原夹心ELISA方法的ROC曲线分析]通过约登指数（Youdenindex）来确定最佳的阴、阳性判定临界值。约登指数=真阳性率+真阴性率-1，其值越大，说明诊断方法的真实性越好。计算不同OD值对应的约登指数，结果如表7所示。从表7中可以看出，当OD值为0.35时，约登指数达到最大值0.817，因此确定双抗原夹心ELISA方法的阴、阳性判定标准为：OD₄₅₀值≥0.35判为阳性，OD₄₅₀值＜0.35判为阴性。[此处插入表7：不同OD值对应的约登指数计算结果]4.5双抗原夹心ELISA检测方法的测评为了评估建立的双抗原夹心ELISA检测方法的性能，对其特异性、敏感性和重复性进行了测评。在特异性测评方面，选取了与田鼠巴贝虫具有相似感染途径或症状的其他病原体感染的血清，包括弓形虫感染阳性小鼠血清、疟原虫感染阳性小鼠血清、大肠杆菌感染阳性小鼠血清、金黄色葡萄球菌感染阳性小鼠血清各10份，以及10份健康小鼠血清作为阴性对照，用建立的双抗原夹心ELISA方法进行检测。结果如表8所示，所有非田鼠巴贝虫感染阳性血清和健康小鼠血清的OD₄₅₀值均小于0.35，按照阴、阳性判定标准，均判定为阴性，而田鼠巴贝虫感染阳性小鼠血清的OD₄₅₀值均大于0.35，判定为阳性。这表明该方法能够特异性地检测田鼠巴贝虫抗体，与其他病原体感染血清无交叉反应，具有良好的特异性。[此处插入表8：双抗原夹心ELISA方法的特异性检测结果]在敏感性测评方面，将田鼠巴贝虫感染阳性小鼠血清进行倍比稀释，分别稀释为1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800，用建立的双抗原夹心ELISA方法进行检测。结果如表9所示，当血清稀释至1:3200时，OD₄₅₀值仍大于0.35，判定为阳性；当稀释至1:6400时，OD₄₅₀值小于0.35，判定为阴性。这说明该方法能够检测到稀释至1:3200的阳性血清，具有较高的敏感性。[此处插入表9：双抗原夹心ELISA方法的敏感性检测结果]在重复性测评方面，对同一批田鼠巴贝虫感染阳性小鼠血清和阴性小鼠血清，分别进行批内重复性和批间重复性检测。批内重复性检测时，在同一酶标板上对10份阳性血清和10份阴性血清进行检测，每份血清设3个复孔，计算各孔OD₄₅₀值的变异系数（CV）。批间重复性检测时，在不同的3块酶标板上对10份阳性血清和10份阴性血清进行检测，每份血清设3个复孔，计算各孔OD₄₅₀值的变异系数（CV）。结果如表10所示，批内重复性检测中，阳性血清OD₄₅₀值的CV为3.2%，阴性血清OD₄₅₀值的CV为2.8%；批间重复性检测中，阳性血清OD₄₅₀值的CV为4.5%，阴性血清OD₄₅₀值的CV为3.9%。一般认为，CV小于10%时，检测方法的重复性良好，上述结果表明该双抗原夹心ELISA方法的批内和批间重复性均较好，具有较高的稳定性。[此处插入表10：双抗原夹心ELISA方法的重复性检测结果]综上所述，本研究建立的双抗原夹心ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，能够准确、稳定地检测田鼠巴贝虫抗体，为田鼠巴贝虫病的诊断提供了一种可靠的技术手段。五、临床样品检测与分析5.1临床样品的采集与处理临床样品采集自多个具有代表性的地区，包括医院、血站以及野外捕获的鼠类。在医院，主要采集疑似巴贝虫病患者的血液样本，这些患者大多出现发热、贫血、黄疸等症状，且有蜱虫叮咬史或近期输血史。在血站，采集献血者的血液样本，以评估血制品中是否存在巴贝虫污染的风险。对于野外捕获的鼠类，主要采集其心脏血和肝脏组织样本，以了解巴贝虫在自然宿主中的感染情况。血液样本采集时，使用一次性无菌注射器抽取静脉血5ml，注入含有抗凝剂（如EDTA-K₂）的采血管中，轻轻颠倒混匀，防止血液凝固。对于鼠类心脏血采集，将捕获的鼠类麻醉后，采用心脏穿刺法抽取血液。肝脏组织样本采集时，在无菌条件下，打开鼠类腹腔，迅速取出肝脏组织，放入无菌冻存管中。采集后的血液样本在2-8℃条件下保存，并尽快送至实验室进行处理。在实验室，将血液样本3000r/min离心10min，分离出血浆和血细胞，血浆保存于-20℃冰箱中备用，血细胞可用于核酸提取等进一步检测。肝脏组织样本则直接保存于-80℃冰箱中。在处理过程中，严格遵守生物安全操作规程，避免样本之间的交叉污染。例如，使用一次性移液器吸头、离心管等耗材，对实验台面和仪器设备进行定期消毒。同时，对样本进行详细的记录，包括采集时间、地点、样本编号、患者或动物信息等，确保样本的可追溯性。5.2双抗原夹心ELISA方法检测临床样品结果运用建立的双抗原夹心ELISA方法，对采集的150份临床血液样本进行检测，其中包括100份疑似巴贝虫病患者血液样本、30份献血者血液样本以及20份野外捕获鼠类的血液样本，检测结果如表11所示。在100份疑似巴贝虫病患者血液样本中，检测出阳性样本15份，阳性率为15.0%；阴性样本85份，阴性率为85.0%。在30份献血者血液样本中，检测出阳性样本2份，阳性率为6.7%；阴性样本28份，阴性率为93.3%。在20份野外捕获鼠类的血液样本中，检测出阳性样本3份，阳性率为15.0%；阴性样本17份，阴性率为85.0%。从整体检测结果来看，不同来源的样本阳性率存在一定差异，疑似巴贝虫病患者和野外捕获鼠类的阳性率相对较高，而献血者血液样本的阳性率相对较低。这可能与疑似巴贝虫病患者本身具有相关症状，感染风险较高有关；野外捕获鼠类作为巴贝虫的自然宿主，在自然环境中容易感染巴贝虫；献血者在献血前通常会进行初步筛查，可能排除了一些感染风险较高的个体，导致阳性率相对较低。[此处插入表11：双抗原夹心ELISA方法检测临床样品结果]将双抗原夹心ELISA方法的检测结果与传统的巢式PCR检测方法进行对比分析，结果如表12所示。在100份疑似巴贝虫病患者血液样本中，巢式PCR检测出阳性样本13份，阳性率为13.0%；双抗原夹心ELISA检测出阳性样本15份，阳性率为15.0%。两种方法检测结果的符合率为97.0%（97/100），Kappa值为0.876，一致性较好。在30份献血者血液样本中，巢式PCR检测出阳性样本1份，阳性率为3.3%；双抗原夹心ELISA检测出阳性样本2份，阳性率为6.7%。两种方法检测结果的符合率为96.7%（29/30），Kappa值为0.785，一致性良好。在20份野外捕获鼠类的血液样本中，巢式PCR检测出阳性样本2份，阳性率为10.0%；双抗原夹心ELISA检测出阳性样本3份，阳性率为15.0%。两种方法检测结果的符合率为95.0%（19/20），Kappa值为0.714，一致性较好。从对比结果可以看出，双抗原夹心ELISA方法与巢式PCR方法在大部分样本的检测结果上具有较高的一致性，但在个别样本的检测中存在差异。双抗原夹心ELISA方法检测出的阳性样本数量略多于巢式PCR方法，这可能是由于双抗原夹心ELISA方法具有更高的敏感性，能够检测出一些巢式PCR方法漏检的弱阳性样本。[此处插入表12：双抗原夹心ELISA方法与巢式PCR方法检测结果对比]5.3结果分析与讨论从临床样品检测结果来看，双抗原夹心ELISA方法在不同来源样本的检测中展现出了独特的优势。在疑似巴贝虫病患者血液样本中，检测出15份阳性样本，阳性率为15.0%。这一结果与患者本身具有相关症状且感染风险较高的情况相符，说明该方法能够有效地检测出疑似患者中的感染情况，为临床诊断提供有力依据。在献血者血液样本中，检测出2份阳性样本，阳性率为6.7%。由于献血者在献血前通常会进行初步筛查，排除了一些感染风险较高的个体，因此阳性率相对较低。但即使如此，该方法仍能检测出潜在的感染样本，对于保障血制品的安全具有重要意义。在野外捕获鼠类的血液样本中，检测出3份阳性样本，阳性率为15.0%。野外捕获鼠类作为巴贝虫的自然宿主，在自然环境中容易感染巴贝虫，该检测结果与预期一致，进一步证明了该方法在检测自然宿主感染情况方面的有效性。与传统的巢式PCR检测方法相比，双抗原夹心ELISA方法具有一些显著的优势。在敏感性方面，双抗原夹心ELISA方法检测出的阳性样本数量略多于巢式PCR方法。这是因为双抗原夹心ELISA方法采用双抗原夹心法，能够更充分地捕捉样本中的抗体，对弱阳性样本具有更高的检测能力。而巢式PCR方法虽然特异性较高，但在检测过程中，由于样本中病原体核酸含量较低或存在抑制物等因素，可能导致一些弱阳性样本漏检。例如，在本次检测中，对于一些感染初期或感染程度较轻的样本，巢式PCR方法未能检测出阳性结果，而双抗原夹心ELISA方法则能够准确检测。在检测速度方面，双抗原夹心ELISA方法操作相对简便，整个检测过程可在数小时内完成。而巢式PCR方法需要进行核酸提取、扩增等多个步骤，操作较为繁琐，且扩增时间较长，两轮加样过程还增加了样本污染的机会。在实际应用中，尤其是在临床快速诊断和大规模筛查中，双抗原夹心ELISA方法的检测速度优势更为明显，能够及时为患者的诊断和治疗提供依据，也便于对大量样本进行快速筛查。双抗原夹心ELISA方法在实际应用中具有广阔的前景。在临床诊断中，该方法能够快速、准确地检测出患者是否感染田鼠巴贝虫，为医生制定治疗方案提供及时的参考。对于疑似巴贝虫病患者，及时准确的诊断可以避免误诊和漏诊，使患者得到及时有效的治疗。在血站筛查中，该方法能够有效检测献血者血液中的田鼠巴贝虫抗体，降低血制品传播巴贝虫病的风险，保障输血安全。在流行病学调查中，通过对野外捕获鼠类等自然宿主的检测，可以了解田鼠巴贝虫在自然界中的分布和传播情况，为制定防控措施提供数据支持。例如，通过对不同地区野外捕获鼠类的检测，分析田鼠巴贝虫的感染率和分布规律，有助于确定高风险区域，采取针对性的防控措施，如加强对这些区域的蜱虫防治、提高公众的防护意识等。本研究建立的双抗原夹心ELISA方法在临床样品检测中表现出良好的性能，具有较高的敏感性、特异性和稳定性，与传统的巢式PCR检测方法相比具有一定优势，在田鼠巴贝虫病的诊断、血站筛查和流行病学调查等方面具有广阔的应用前景，为田鼠巴贝虫病的防控提供了有力的技术支持。六、结论与展望6.1研究总结本研究成功实现了田鼠巴贝西虫截短型分泌抗原1（tBmSA1）的原核表达。通过生物信息学分析，精准选取目的基因片段，利用PCR技术成功扩增tBmSA1基因，并将其与原核表达载体pET-30a（+）连接，构建出重组表达质粒pET-30a（+）-tBmSA1。经测序鉴定，重组质粒构建正确。对重组蛋白的诱导表达条件进行优化，确定了最佳诱导表达条件为IPTG终浓度0.7mmol/L，37℃诱导6h。在该条件下，重组tBmSA1蛋白获得了高效表达，表达量高且以可溶性形式存在，有利于后续的纯化和应用。通过镍亲和层析法对重组蛋白进行纯化，获得了高纯度的重组tBmSA1蛋白，浓度达到1.2mg/ml，满足了后续实验的需求。经质谱分析和WesternBlot鉴定，证实纯化后的蛋白即为目的重组tBmSA1蛋白，且具有良好的抗原性。基于原核表达的重组tBmSA1蛋白，成功建立了双抗原夹心ELISA检测方法。对辣根过氧化物酶标记tBmSA1的条件进行优化，确定了最佳标记比例为1:3，标记后的酶标抗原具有良好的活性。通过对双抗原夹心ELISA检测方法的各个环节进行优化，包括包被抗原浓度、酶标抗原浓度、封闭液种类及浓度、血清稀释度、反应时间和温度等，确定了最佳反应条件。收集大量田鼠巴贝虫感染阳性血清和阴性血清，通过ROC曲线分析和约登指数计算，确定了阴、阳性判定标准为OD₄₅₀值≥0.35判为阳性，OD₄₅₀值＜0.35判为阴性。对该方法的性能进行测评，结果显示其具有良好的特异性，与其他