高三生物二轮复习课件专题十四　基因工程

专题十四基因工程限制酶

利用PCR获取和扩增

基因表达载体的构建分子水平基因金版P115选必三P74考点3基因工程PART04第四部分磷酸奥司他韦的合成前体一莽草酸民间流传八角能治疗和预防流感，称八角含抗流感成分，日常食用、煮水即可达到抗病毒效果，该民间传言有科学依据吗?莽草酸是从中药八角茴香中提取的一种单体化合物，有抗炎、镇痛作用，是磷酸奥司他韦的合成原料。统览全局Q1:30公斤的八角茴香仅可生产1公斤的莽草酸。结合基因工程的应用，如何实现莽草酸的工厂化生产?通过基因工程手段，提取莽草酸合成相关基因，构建基因表达载体并导入受体菌中，实现莽草酸的工业化生产。目的基因筛选与获取基因表达载体构建将目的基因导入受体细胞目的基因检测与鉴定基因工程的四个操作程序金版P121Ca2＋处理法PCRPCR抗原—抗体通过DNA合成仪用化学方法直接合成确保重组质粒在细胞质中自我复制，并遗传给后代2023-2025年广东卷基因工程考点回顾题目题目分值情境素材生物学知识2023年第2题2分乳腺癌致病机理基因编辑2023年第20题14分野生型拟南芥诱变育种基因工程操作步骤;重组质粒结构;限制性核野生型拟南芥诱变育种酸内切酶作用机理;核酸电泳图2024年第4题2分技术进步与科学发现的关系PCR过程中的工具酶2024年第18题第(3)问2分遗传性牙龈纤维瘤病基因编辑适用的场景2024年第21题13分以合成生物学为背景，利用启动子的位置和功能;抗性基因的作用;重组基因工程改造工程菌，让细质粒中基因表达的调控过程菌合成BC膜并实现光控染色启动子的位置和功能;抗性基因的作用;重组质粒中基因表达的调控过程2025年第7题2分Solexa测序;PCR过程PCR过程中延伸过程;Taq酶具体作用位点2025年第16题4分单基因遗传病基因突变;基因检测原理2025年第20题第(3)问6分神经兴奋对免疫调节的影响PCR过程和原理2025年第21题11分以合成生物学为背景，利用基因工程改造大肠杆菌，实现莽草酸的工业化生产重组质粒结构、重组质粒中不同基因表达的相基因工程改造大肠杆菌，实互关系和影响一、基因工程与合成生物学2026广州一模【情境导学】（2025广东高考改编）一、基因工程中构建基因表达载体资料1：莽草酸是抗病毒药物奥司他韦的重要成分，八角、茴香的豆荚中莽草酸的含量较高。科研人员拟对野生型大肠杆菌通过基因工程进行改造，以生产更多的莽草酸。1.基因表达载体除了目的基因外，还应包括______________________________________等元件。2.利用基因工程生产莽草酸的过程中，为什么不能将获取的莽草酸基因直接导入受体细胞中？3.若要在大肠杆菌中实现莽草酸基因的大量表达，可以改造基因表达载体中的____________（元件）。启动子启动子、终止子、标记基因、复制原点选必三P80【情境导学】（2025广东高考改编）二、利用合成生物学改造工程菌资料2：大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。莽草酸在大肠杆菌内合成代谢途径见图1，由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。1.在快速生长期，为了保证细胞快速繁殖和正常生长，应_______（促进/抑制）酶A的合成，________（促进/抑制）酶B的合成，从而使更多能量和物质用于大肠杆菌细胞生长的需要。2.在生长稳定期，细胞数量较多，且不再大量增殖。为了实现莽草酸的大量积累，应_______（促进/抑制）酶A的表达，________（促进/抑制）酶B的表达。抑制促进促进抑制金版P122资料3：为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，如图2所示。【情境导学】（2025广东高考改编）二、利用合成生物学改造工程菌注：M、N为酶A或酶B基因；启动子PGeo仅在生长期开启转录；基因X编码的阻遏蛋白可阻遏启动子PX开启转录；C-端带SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌逐渐降解。3.若将质粒①和②分别导入大肠杆菌中，可采用__________法。（1）在只有质粒①的细胞中，若细胞在快速生长期，则M的表达量逐渐_______（增加/减少）；若细胞在生长稳定期，则M的表达量逐渐______（增加/减少），后者的原因是________________________________________________________________________。（2）在只有质粒②的细胞中，若细胞在快速生长期，则N的表达量较_______；若细胞在生长稳定期，则N的表达量________。Ca2+处理增加减少PGeo在生长稳定期停止M基因转录，且带有SsrA短肽的M蛋白被降解低增加资料3：为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，如图2所示。注：M、N为酶A或酶B基因；启动子PGeo仅在生长期开启转录；基因X编码的阻遏蛋白可阻遏启动子PX开启转录；C-端带SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌逐渐降解。4.结合图1中莽草酸的代谢途径，构建符合不同时期生产需求的莽草酸生产菌株，需同时将质粒①②导入大肠杆菌中。（1）在快速生长期，为了让细胞快速生长，质粒①中的M应选择酶_____（A/B）基因。同时，质粒②中的N应选择酶_____（A/B）基因，从而减少________的合成，增加________________的合成，进而促进细胞生长。（2）在生长稳定期，Px调控N的转录_______（受/不受）阻遏蛋白的抑制，N对应的酶基因（酶A或酶B）表达量________，从而促进莽草酸的积累。5.为了排除内源B基因的干扰，还需同时对大肠杆菌进行__________________的操作。BA莽草酸细胞生长必需物不受增加敲除酶B基因1.大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题：（1）研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及__________________检测，筛选获得重组菌株W1。荧光/抗原-抗体金版P122（2）将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有____________________________（答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是________________________________________。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是________。（3）研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为________。细菌计数板法作为检测mKate2蛋白荧光强度的对照Pgro停止转录，mKate2蛋白合成停止，但特异性降解持续(分解)快速生长期荧光强度低，生长稳定期荧光强度迅速增长金版P122（4）莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路：______。金版P122

先敲除野生型菌株中的酶B基因，再将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，并将上述质粒导入其中快速生长期表达生长稳定期表达快速生长期表达生长稳定期表达三、发酵工程及其应用【情境导学】（2025广东高考改编）资料4：改造后的工程菌株可利用发酵工程大规模生产，获得代谢产物莽草酸，应用于医疗、工业和农业等领域。1.发酵工程的中心环节是____________________。2.在发酵过程中，要随时检测培养液中_________________________等以了解发酵进程。3.通过适当的_________________措施可以获得莽草酸。发酵罐内的发酵微生物的数量、产物浓度提取、分离和纯化16在菌种确定之后，要选择原料制备培养基。在生产实践中，培养基的配方要经过反复试验才能确定。接种选育菌种配制培养基扩大培养灭菌发酵罐内发酵分离、提纯产物获得产品性状优良的菌种可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。工业发酵罐的体积一般为几十到几百立方米，接入的菌种总体积需要几立方米到几十立方米。所以，在发酵之前还需要对菌种进行扩大培养发酵工程中所用的菌种大多数是单一菌种，一旦有杂菌污染，可能导致产量大大下降。因此，培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌。现代发酵工程使用的大型发酵罐均有计算机控制系统，能对发酵过程中的温度、pH、溶解氧、罐压、通气量、搅拌、泡沫和营养等进行监测和控制；还可以进行反馈控制，使发酵全过程处于最佳状态。电动机排气管pH计冷却水排出口冷却夹层发酵液搅拌叶轮生物传感器装置空气入口放料管阀门培养物或营养物质的加入口观察孔取样管温度传感器和控制装置冷却水进入口

这是发酵工程的中心环节。在发酵过程中，要随时检测培养液中微生物的数量、产物的浓度等，以了解发酵进程。还要及时添加必需的营养组分，要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。

环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖，而且会影响微生物代谢物的形成。如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥，即可得到产品。如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。P22一.发酵工程基本环节单细胞蛋白的获得方法？1.组成型启动子:驱动基因持续、稳定表达，不受环境、组织或发育阶段影响，通常调控管家基因(如参与基础代谢、细胞结构维持的基因)。2.组织特异性启动子:仅在特定组织、器官或发育阶段被激活，驱动基因进行特异性表达，受生物体内部精密调控网络控制。3.诱导型启动子:在基础状态下基因表达水平低或不表达，需特定诱导物(如化学小分子、温度、光照等)激活或抑制，实现基因表达的时空调控。四、不同类型的启动子例：2024年广东高考题中，利用蓝光光敏蛋白标签和T7启动子构建的光控表达载体，使工程菌在蓝光照射下激活酪氨酸酶基因表达，属于诱导型工程菌。乳房生物反应器乳腺中特异表达的基因的启动子四、不同类型的启动子诱导型启动子可以通过正控制或负控制进行调节：1.正诱导型：在关闭状态下，启动子不活跃，因为激活蛋白无法结合。在诱导剂与激活蛋白结合后，激活蛋白可以结合到启动子上，开启并启动转录。2.负诱导型：在关闭状态下，启动子不活跃，因为结合的阻遏蛋白积极阻止转录。一旦诱导剂与阻遏蛋白结合，阻遏蛋白就会从DNA上移除。在没有阻遏蛋白的情况下，转录被开启。2026广州一模乳糖操纵子图1

图2调控基因表达①无诱导物存在时(见图1)，阻遏蛋白与操纵基因结合阻止了RNA聚合酶与启动子结合，使结构基因不能正常转录。②诱导物(乳糖)存在时(见图2)，诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白结构改变，不能与操纵基因结合，则RNA聚合酶结合到启动子上并启动结构基因的表达。金版P711.转录水平的调控——操纵子

2．光控诱导性启动子(2024·广东选择考)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(见图1)。回答下列问题：金版P122(1)研究者优化了培养基的________________(答两点)等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和BC膜的复合物)。碳源、氮源(2)研究者利用T7噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体[光控原理见图2(a)，载体的部分结构见图2(b)]。构建载体时，选用了通用型启动子PBAD(被工程菌RNA聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为____________________，理由是_______________________________________________________。PT7、PBAD和PBAD基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达金版P123(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为_________________________________(答两点)。(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是_________________________________________________________。(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路：__________________________________________________________________________。抑制杂菌、去除丢失质粒的菌株该处细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色的蛋白)金版P1232．光控诱导性启动子(2024·广东选择考)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(见图1)。回答下列问题：3(2023·广东选择考）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n＝10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。回答下列问题：（1）拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与

植株的种子大小相近。（2）用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和

进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备

。野生型Ti质粒启动子和终止子金版P123（3）转化后，T－DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了

。②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约

%的培养基中幼苗继续培养。③将②中选出的T2代阳性植株

（填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到

%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。DAI基因和卡那霉素抗性基因75自交100金版P123为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见图9，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑

。金版P1231．他汀类药物是目前应用广泛、效果理想的降脂药物，醇脱氢酶是该药物催化合成过程中的关键酶。研究人员对酿酒酵母醇脱氢酶基因进行PCR，并将其导入大肠杆菌BL-21中，构建重组醇脱氢酶工程菌，利用LB培养基可大量生产醇脱氢酶。(1)对酿酒酵母醇脱氢酶基因进行PCR时，需要先设计引物，引物应选择图1中的_____________________________。引物Ⅱ、引物Ⅲ金版P124(2)PCR反应过程如图2所示，其中50℃复性45s的目的是______________________。TaqDNA聚合酶在图2中的____________过程中发挥作用。使引物与模板链结合延伸和后延伸(3)pET-28b质粒(图3)中a区段表示的是_____结构，其作用是_____________________。构建重组质粒时最好选用限制酶_________________________。将重组质粒导入BL-21中后，培养在含有________的LB固体培养基上，以达到筛选的目的。启动子与RNA聚合酶结合，启动转录NcoⅠ和XhoⅠ卡那霉素金版P124(4)通常用________________的方法，检测工程菌BL-21是否生产出了醇脱氢酶。抗原—抗体杂交2．甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质，将甜蛋白基因导入番茄可提高番茄甜味，改善果实品质，获得超甜植株。下图是甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶切割位点示意图。(1)利用转基因技术获得超甜番茄的核心步骤是_____________________，该过程需要选择______________________限制酶切割甜蛋白基因。(2)Ti质粒上的启动子是____________识别和结合的位点，为了保证甜蛋白基因能够在番茄细胞中表达，应将Ti质粒上的启动子替换为__________________________________。(3)农杆菌侵染番茄细胞时，T-DNA的作用是______________________________________________________________，该过程发生的变异类型为______________。然后在添加____________的培养基中培养番茄细胞，筛选转化成功的愈伤组织。基因表达载体的构建XbaⅠ和HindⅢRNA聚合酶番茄细胞中能表达的基因的启动子

携带目的基因进入受体细胞并将其整合到受体细胞的染色体DNA上基因重组卡那霉素金版P1252．甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质，将甜蛋白基因导入番茄可提高番茄甜味，改善果实品质，获得超甜植株。下图是甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶切割位点示意图。金版P125(4)若得到的超甜番茄体细胞中导入的是2个甜蛋白基因，则让其自交，若子代表型及比例为_____________________________，说明2个甜蛋白基因插到了两对同源染色体上(含有1个和2个甜蛋白基因的番茄甜味相同)。超甜番茄∶普通番茄＝15∶12．蛋白质工程基因合成新的蛋白质蛋白质结构脱氧核苷酸序列金版P121题点2蛋白质工程基本原理及应用3．水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是__________，物质b是__________。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是____________________。多肽链mRNA密码子具有简并性(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有_____________________、__________________________________________和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是_______________。通过构建基因文库获取通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成DNA半保留复制金版P125(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的______(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是________________________________________________