菜心品种纯度鉴定简单重复序列间区法规程

ICS65.020.20

CCSX11

T/GXAS

团体标准

T/GXASXXXXX—2020

菜心品种纯度鉴定简单重复序列间区法规

程

CodeofpracticeofexperimentaIidentificationmethodforvarietyof

Chinesefloweringcabbageseed-ISSR

（征求意见稿）

2020-XX-XX发布2020-XX-XX实施

广西标准化协会发布

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-12,—1—

刖百

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些文件可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由广西壮族自治区农业科学院蔬菜研究所提出。

本文件起草单位：广西壮族自治区农业科学院蔬菜研究所。

本文件主要起草人：史卫东、罗海玲、康红卫、黄中宁。

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菜心品种纯度鉴定简单重复序列间区法规程

1范围

本文件规定了菜心品种纯度鉴定的实验方法。

本文件适用于利用简单重复序列间区法（ISSR）对大豆种子品种鉴定的实验过程。

2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

简单重复序列间区experimentaIidentification

根据某个简单重生序列（微卫星位点）设计出一系列特异引物，通过PCR反应扩增微卫星位点间隔

的碱基顺序的分子标记和检测方法。

3.2

引物primer

一条互补结合在模板DM链上的短的单链，提供3'末端作为DNA合成的起点，延伸合成模板DNA

的互补链。

3.3

微卫星DNAmicrosateIIiteDNA

是一类由几个核甘酸（一般为1个、5个）为重复单位的长达几十至几百个核甘酸的串联重复序列。

4原理

DNA是生物体的遗传基础，携带所有的遗传物质，从DNA分子水平上进行鉴别是区分物种、品种甚至

个体之间差异最为有效的方法。利用PCR技术可将DMA片段在短时间内扩增几十甚至几百万倍，从而达到

可以检测的目的。ISSR方法是在PCR技术基础上发展起来的一种检测方法，是根据简单重复序列（微卫

星位点）设计出一系列特异引物，包括双核甘酸、三核昔酸和四核甘酸等为重复单位的微卫星DNA片段

（一般为20个碱基），通过PCR反应扩增微卫星位点及其间隔区，以检测其扩增片段的多态性。

5环境条件

5.1温度：15℃、25℃；

5.2湿度：相对湿度（RH）W50%。

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6仪器设备

6.1PCR扩增仪。

6.2紫外分光光度计。

6.3高速台式离心机：转速不小于15000r/min。

6.4多用电泳仪及水平式电泳槽。

6.5紫外透射仪。

6.6微量移液器。

6.7电子天平：分度值为0.0001go

6.8磁力加热搅拌器。

6.9凝胶成像系统。

6.10超纯水系统。

6.11灭菌锅。

6.12酸度计。

6.13微波炉。

6.14恒温水浴锅。

6.15恒温干燥箱。

6.16离心管。

6.17研钵。

6.18移液器吸头。

6.19容量瓶.

6.20烧杯。

6.21三角烧瓶。

6.22PE手套。

6.23锡箔纸。

6.24封口膜。

7试剂

7.1TaqDNA聚合朝：保存条件为20c±2

7.210XBuffer：保存条件为20c±2C。

7.3四种脱氧核甘酸（4XdNTP）：保存条件为20℃士2℃。

7.4Mg24：保存条件为20C士2℃。

7.5RNA醐：保存条件为20℃±2

7.6琼脂糖。

7.7三羟甲基氨基甲烷。

7.8浪酚蓝。

7.9二甲苯青FF。

7.108•羟基喳咻。

7.11十二烷基磺酸钠。

7.12溟化乙锭。

7.13异戊醇。

7.14结晶酚。

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7.15三氯甲烷。

7.16硼酸；

7.17蔗糖。

7.18无水乙醉。

7.19盐酸。

7.20氯化钠。

7.21去离子水。

8鉴定步骤

8.1高压灭菌

将欲灭菌的离心管放入烧杯中，用锡箔纸封口，移液器吸头装在吸头盒内，配好的试剂装入试剂瓶

中，盖好盖，放入灭菌锅中。首先将压力升至1Pa,放气，再将压力重新升至1Pa,开始计时，20min

后，将电源关闭。待压力为零时，取出离心管、吸头及试剂瓶，待用。

8.2溶液配制

相关溶液配制方法见附录A。

8.3DNA的提取

具体步骤如下：

a）取新鲜或冷冻叶片100mg,放在1.5ml离心管中，加入1000匀浆缓冲液浸泡4h,倒入研钵

中充分研磨，将研磨产物倒入L5ml离心管中，取少量匀浆缓冲液冲洗研钵，一并倒入离心

管中，离心（转速为4000r/min）lOmin,将上清液移至新的1.5ml离心管中，弃沉淀。

b）加入与上清液等体积的饱和酚，缓慢颠倒离心管2cmin,不应该剧烈振荡。离心（转速为8（）0（）

r/min）10min,将上清液移至新的离心管中。

c）加入与上清液等体积的酚一三氯甲烷一异戊醇（体积比为24:23:1）,离心（转速为8000r/min）

10min,将上清液移至新的离心管中。

d）加入与上清液等体积的三氯甲烷一异戊醇（体积比为23:1）,缓慢颠倒10min,离心（转速为

800（）r/min）10min,取上清液至新的离心管中。

e）加入上清液二倍体积的冰冷乙醉，水平旋转离心管50圈、100圈，即可出现白色絮状DNA。

f）将离心管置于20℃冰箱中3（）h,取出后离心（转速为8000r/min）10h,形成白色沉淀。

g）倒掉离心管中的液体，加入1mL75%乙醉，离心（转速为15000r/min）5mim倒掉乙醉，

倒置在干净的吸水纸上，吸干液体。

h）将离心管置于恒温干燥箱（40℃、50℃）中20min或置于通风处40min。

i）加入100LTE缓冲液和RNA酷2L,水浴（55℃±2℃）12h,使DNA沉淀充分溶解，4℃

冰箱中保存。

8.4DNA浓度检测

8.4.1紫外吸收检测

DMA分子中的喋吟环和喀咤环能够吸收紫外光。DM的紫外吸收高峰在波长260nm处，蛋白质的紫外

吸收高峰在波长280nm处。取提取的DNA溶液5L,加水995L,放人比色杯中，用紫外分光光度计检测，

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记下260nm和280nm下的0D值，计算出DNA的浓度以及⑴60和01）80的比值。DNA的0D260/0D280宜在1.8,

1.5以上也可用于ISSR叩CR分析，若比值太小应重复8.3中a）〜i）步骤继续抽提。

8.4.2DNA浓度计算

按公式（1）计算：

D=50x1000xOD2Mxs.........................................................（1）

式中：

D一—DNA的浓度，单位为纳克每微升（ng/pL）；

S——稀释倍数。

8.5凝胶电泳检测

将制备好的浓度为0.7%。的琼脂糖凝胶放入电泳槽中，使点徉孔处于电源负极端，加入没过胶面1mm

深的足量电泳缓冲液（0.5XTBE）。取DNA溶液10L和凝胶加样缓冲液2L,在封口膜上用微量移液器上

下吸打混匀，加入到点样孔中（注意避免出现气泡）。打开电源，将电压控制在5V/cm,电泳1h,取

出凝胶，放在紫外透射仪上观察,若D5IA质量好、分子量高（＞50kb）且无降解，在点样孔附近呈现一

条致密亮带；若DNA部分降解，则呈连续分布状态多若严重降解，则看不到大片段DNA,只能在远离加样

孔为地方看到RNA。

8.6ISSR扩增

8.6.1反应成分

25反应体系中，含有IXBuff'er,1.5nmu）l/LMg",200卬iol/LdNTP,1UTaqDNA聚合酶，1即。1/1.引

物，100ng模板DNA,加水至25RL。按上述比例将反应液依次加入0.2mL离心管中，放人PCR仪中，进行

PCR循环。

8.6.1.1循环过程

94℃预变性7min；94℃变性30s,48c退火45s,45个循环；72℃延伸（？）s；72c延伸7min；

4℃冷却。

8.7电泳检测

将制备好的浓度为2%的琼脂糖凝胶放人电泳槽中，使点样孔处于电源负极端。取PCR扩增产物

和凝胶加样缓冲液2L,在封口膜上用微量移液器上下吸打混匀，加入到点样孔中。打开电源，将电压

控制在3V/cm,电泳4h,切断电源，取出凝胶，在凝胶成像上扫描。

8.8鉴定

将待测品种的凝胶成像结果可该品种原种的标准谱带相比较，从而鉴定出该品种的真实性。

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附录A

(规范性附录)

缓冲液和主要试剂的配制

A.1匀浆缓冲液的配制

A.1.1mol/LTris.CI(pH8.0)200mL>0.5mol/LEDTA(pH8.0)50mL和0.5gSDS,力口水至100mL。使

用前应保证SDS充分溶解，若出现结晶，应放在50°C水浴中溶解10min。

A.1.21mol/LTris*Cl(pH8.0)：称取12.11gTris,溶于80mL水中,用浓HC1调节溶液的pH值至8.0,

加水定容至100mL,高压灭菌.

A.1.30.5mol/LEDTA(pH8.0):称取18.61gEDTANa2•2H20,溶于80mL水中,在磁力加热搅拌器上剧烈

搅拌，用NaOH2g左右调节溶液的pH值至8.0,加水定容至100mL,高压灭菌。

A.2饱和酚的制备

饱和酚的制备宜在通风橱或通风良好的条件下进行。

A.3TE缓冲液的配制

A.3.11mol/LTris.CI(pH7.6)：称取12.11gTris,溶于80mL水中，用浓HCI调节溶液的pH值至7.

6,加水定容至100